KR102014732B1 - 미생물의 사균화 방법 - Google Patents

미생물의 사균화 방법 Download PDF

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케이코 카사하
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가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤
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Abstract

효소활성을 가지는 미생물 균체액을, 용이하게 보존, 이용 가능한 기술을 제공한다. 이 기술은 효소활성을 가지는 미생물 균체액의 pH를 조정하고, 이어서 이것을 가열처리하는 것을 특징으로 하는 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화하는 방법이고, 또한, 효소활성을 가지는 미생물 균체액에 당질을 첨가하고, 이어서 이것을 가열처리하는 것을 특징으로 하는 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화하는 방법이다.

Description

미생물의 사균화 방법 {METHOD FOR KILLING MICROORGANISM}
본 발명은 미생물의 사균화 방법에 관한 것으로, 더 상세히는 효소활성을 가지는 미생물 균체액의 효소역가를 유지하면서 미생물을 사균화하는 방법에 관한 것이다.
미생물에는 유용한 효소활성을 가지는 것이 많이 존재하고, 당질, 아미노산, 인지질 등의 기능성 식품 소재의 제조에 널리 이용되고 있다. 그 중에서도 당질 소재, 특히 올리고당의 제조에 이용할 수 있는 미생물은 많이 알려져 있으며, 예를 들면, 스포로보로마이세스·싱귤라리스(Sporobolomyces singularis)에 속하는 효모균이 가지는 β－갈락토시다아제 활성을 이용하여 갈락토올리고당을 제조하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1).
그런데 미생물은 일반적으로, 가열처리에 의해 사균화되어 보존되는 것으로 알려져 있으나, 상기와 같은 효소활성을 가지는 미생물에 가열처리를 하는 경우에는 미생물은 사균화되지만, 효소활성이 현저하게 저하해 버려, 사실상 사용할 수 없게 되어 버린다는 문제가 있었다. 또한, 효소활성을 유지한 채로 사균화시키는 기술로서, 형질 전환된 미생물을 25℃~35℃의 알코올 등의 약품에 의해 효소활성을 유지한 채로 사균화시키는 기술도 보고(특허문헌 2)되어 있지만, 이 기술에서는 유전자 조작을 한 미생물을 이용하거나 사균화의 처리에 사용한 알코올 등이 잔존하거나 하기 때문에, 사균화 후의 용도가 한정되어 버린다고 하는 문제가 있었다.
특허문헌 1: 일본국 특허공고 평5－58714호 공보 특허문헌 2: 일본국 특허공개 2002－355028호 공보
따라서, 본 발명은 효소활성을 가지는 미생물 균체액을, 용이하게 보존, 이용 가능하게 하는 기술을 제공하는 것을 과제로 하는 것이다.
본 발명자들은 이러한 문제를 해결하기 위하여 미생물의 가열처리에 의한 사균화의 조건에 대해서 예의 연구한바, 효소활성을 가지는 미생물 균체액 중의 미생물을 사균화하기 위한 가열처리 전에 pH를 조정하는 것이나, 가열처리 시에 당질을 존재시키는 것에 의해, 효소역가가 유지된 채로 사균화할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 또한, 전술한 바와 같이 하여 사균화된 미생물 균체액은 사균화 전의 미생물 균체액의 효소역가가 유지되어 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 효소활성을 가지는 미생물 균체액의 pH를 조정하고, 이어서 이것을 가열처리함을 특징으로 하는 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화하는 방법이다.
또한, 본 발명은 사균화 전의 미생물 균체액의 효소역가가 유지되어 있는 것을 특징으로 하는 사균화 미생물 균체액이다.
더욱이, 본 발명은 효소활성을 가지는 미생물 균체액에 당질을 첨가하고, 이어서 이것을 가열처리하는 것을 특징으로 하는 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화하는 방법이다.
더 더욱이, 본 발명은 당질을 함유하고, 사균화 전의 미생물 균체액의 효소역가가 유지되어 있는 것을 특징으로 하는 사균화 미생물 균체액이다.
본 발명의 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화하는 방법에 의하면, 효소활성을 가지는 미생물 균체액의 효소역가를 유지한 채로 미생물을 사균화할 수가 있다. 또한, 이 방법에서는 효소의 열안정성을 높일 수가 있으므로, 더 넓은 온도조건에서 효소역가가 유지된 채로 사균화할 수가 있다. 그 때문에, 사균화 후의 미생물 균체액은 용이하게 보존, 이용이 가능해진다. 즉, 미생물이 살아 있는 경우는 보존 중에 미생물로부터 어떠한 대사물이 생겨 미생물 균체액의 품질이 저하하여 효소역가의 보존 안정성에도 영향을 줄 가능성이 있지만, 사균화되어 있는 경우는 그러한 문제는 생기지 않기 때문에, 사균화 미생물 균체액은 효소역가의 보존 안정성이 뛰어나다.
또한, 본 발명의 사균화 미생물 균체액은 효소활성이 유지된 상태로 사균화되어 있으므로 용이하게 보존, 이용 가능하게 된다.
더욱이, 상기 사균화 미생물 균체액을 건조시켜 사균화 미생물 균체 건조분말로 하면, 더 장기간 안정하게 보존, 이용 가능하게 된다.
삭제
도 1은 실시예 9에 있어서, 유당 농도 2질량/체적%에서 Ss 농축액을 45℃ 또는 50℃에서 5시간 유지하고, 가열처리를 한 후의 역가 잔존율을 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 9에 있어서, 유당 농도 2질량/체적%에서 Ss 농축액을 45℃ 또는 50℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 한 후의 역가 잔존율을 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 9에 있어서, 유당 농도 5질량/체적%에서 Ss 농축액을 45℃ 또는 50℃에서 5시간 유지하고, 가열처리를 한 후의 역가 잔존율을 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 9에 있어서, 유당 농도 5질량/체적%에서 Ss 농축액을 45℃ 또는 50℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 한 후의 역가 잔존율을 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 11에 있어서, 각종 농도의 수산화나트륨 용액, 수산화칼륨 용액, 탄산나트륨 용액을 이용하여 Ss 배양액의 pH를 조정한 후의 역가 잔존율을 나타내는 도면이다.
본 발명의 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화하는 방법(이하, 「본 발명 방법」이라고 한다)은 효소활성을 가지는 미생물 균체액의 pH를 조정하고, 이어서 이것을 가열처리하는 방법(이하, 「본 발명 방법 1」이라고 한다) 또는 효소활성을 가지는 미생물 균체액에 당질을 첨가하고, 이어서 이것을 가열처리하는 방법(이하, 「본 발명 방법 2」라고 한다)에 의해 실시할 수가 있다.
본 발명 방법에 의해, 사균화되는 미생물로서는 예를 들면, 세균, 효모, 곰팡이 등의 미생물로, 효소를 세포벽에 결합하고 있든지, 또는 균체내 및/또는 균체외에 산생하는 것, 즉, 효소활성을 가지는 미생물이면 특히 한정되는 것은 아니다. 이들 효소활성을 가지는 미생물로서는 예를 들면, 스트렙토코쿠스속, 락토바실루스속, 바실루스속, 비피도박테리움속 등에 속하는 세균, 스포로보로마이세스속, 불레라속, 클리베로마이세스속, 리포마이세스속, 칸디다속, 클립토코카스속, 스테리그마토마이세스속, 벤싱토니아속, 발리스토스포로마이세스속, 페로마이세스속, 피브로바시디움속, 시로바시디움속, 틸레솝시스속, 이타소니리아속, 틸렙시아속, 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 한세눌라속, 로도토룰라속, 데바료마이세스속, 피키아속, 토룰롭시스속 등에 속하는 효모를 들 수 있다. 또한, 효소로서는 예를 들면, 아미라제, 슈크라제,α－갈락토시다아제, β－갈락토시다아제, 글루코오스이소메라제,α－글루코시다제, β－글루코시다제, β－프락토플라노시다제,α－만노시다제, β－만노시다제, 크실라나제 등의 당질 분해 효소 등의 효소를 들 수 있다.
상기 효소활성을 가지는 미생물 중에서도 β－갈락토시다아제 활성을 가지는 미생물이 바람직하다. 이러한 미생물로서는 스포로보로마이세스속, 불레라속, 클리베로마이세스속, 리포마이세스속, 칸디다속, 클립토코카스속, 스테리그마토마이세스속, 벤싱토니아속, 발리스토스포로마이세스속, 페로마이세스속, 피브로바시디움속, 시로바시디움속, 틸레솝시스속, 이타소니리아속, 틸렙시아속, 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 한세눌라속, 로도토룰라속, 데바료마이세스속, 피키아속, 토룰롭시스속 등에 속하는 효모, 스트렙토코쿠스속, 락토바실루스속, 바실루스속, 비피도박테리움속에 속하는 세균을 들 수 있다.
또한, 상기 β－갈락토시다아제 활성을 가지는 미생물 중에서도 효모 또는 세균이 바람직하고, 특히 효모가 보다 바람직하다. 구체적인 β－갈락토시다아제 활성을 가지는 효모로서는 특히 스포로보로마이세스·싱귤라리스, 스테리그마토마이세스·에리비아에, 클립토코카스·로렌티, 로도토룰라·락토자, 시로바시디움·매그넘, 리포마이세스·리포파를 들 수 있다. 구체적인 β－갈락토시다아제 활성을 가지는 세균으로서는 특히 스트렙토코쿠스·서모필루스, 락토바실루스·불가리쿠스, 스트렙토코쿠스·락티스, 락토바실루스·사리바리우스, 락토바실루스·라이히마니, 락토바실루스·헬베티쿠스, 바실루스·브레비스, 바실루스·스테아로서모필루스, 비피도박테리움·비피담, 비피도박테리움·브레이베, 비피도박테리움·롱검, 비피도박테리움·아드레스센티스를 들 수 있다.
특히 바람직하게 이용되는 β－갈락토시다아제 활성을 가지는 효모로서는 스포로보로마이세스·싱귤라리스를 들 수 있으며, 그의 하나의 예인, 스포로보로마이세스·싱귤라리스　JCM　5356(ATCC　24193)은 이화학연구소 바이오자원센터((우)351－0198　일본국사이타마현와코시히로자와2－1)이나 ATCC(10801　University Boulevard Manassas, VA　20110　USA) 등으로부터 유상으로 입수하는 것이 가능하다.
또한, 스포로보로마이세스·싱귤라리스의 다른 예로서는 일본국 특허공개 2003－325166호 공보에 기재의 만들어 내는 방법에 의해, β－갈락토시다아제 고산생 변이 미생물로서 얻은 효모를 들 수가 있다. 이 중, 구체적으로는, 친주로서 상기 스포로보로마이세스·싱귤라리스　JCM　5356을 이용하여 상기 특허문헌의 공정(a)~(c)에 의해 얻어지는 효모의 예로서는 스포로보로마이세스·싱귤라리스 ISK－#4D4, 동#5A5, 동##2B6를 들 수 있어 이것은 2002년 4월 10일자로, 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터((우)305－8566　일본국이바라키현 츠쿠바시히가시1쵸메1번지1중앙제6)에 각각 FERM　P－18818, FERM　P－18819 및 FERM P－18817로서 기탁되어 있다.
전술한 미생물을 사균화하는 본 발명 방법 중. 효소활성을 가지는 미생물 균체액의 pH를 조정하고, 이어서 이것을 가열처리하는 방법(본 발명 방법 1)에 대해서 설명한다. 본 발명 방법 1의 실시에서는 우선, 효소활성을 가지는 미생물을 통상의 방법으로 따라 배지 등에서 배양하여 배양액을 얻는다. 이 배양액을 그대로 미생물 균체액으로서 이용해도 좋고, 다시, 원심분리장치나 막농축(膜濃縮) 장치 등을 이용하여, 적당히 세정·농축을 행한 것을 미생물 균체액으로서 이용해도 좋다. 이 미생물 균체액의 고형분 함량은 특히 한정되는 것은 아니고, 구체적으로는 0.5~10%를 예시할 수가 있다. 또, 이 명세서에 있어서의 「고형분 함량」이란, 미생물 균체액 중의 균체의 고형분 함량을 가리키며, 예를 들면, 미생물 균체액 중에 배지 성분이 포함되는 경우는 그 배지 성분에 유래하는 고형분은 이 명세서에 있어서의 「고형분 함량」에는 포함되지 않는다.
이어서 이 미생물 균체액의 pH를 조정한다. pH의 범위는 특히 한정되지 않으나, 더욱 넓은 온도 범위에 있어서 효소역가를 보다 높게 유지할 수 있다고 하는 점으로부터, 바람직하기로는 3.5~6.5, 보다 바람직하기로는 4.2~6.3, 더욱 바람직하기로는 4.5~5.7이다. 이 pH의 조정에 이용되는 물질은 특히 한정되지 않고, 산, 염기, 염의 어느 것이라도 이용할 수가 있고, 구체적으로는 염산, 아세트산, 황산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨 등의 수용액이나, 인산나트륨 완충액 등의 각종 완충액을 적당히 이용할 수 있으나, pH 조정 후에 역가가 저하하지 않는 점에서, 탄산염을 이용하는 것이 바람직하고, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산암모늄, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 및 탄산수소암모늄으로 이루어진 군에서 선택되는 탄산염 1종 또는 2종 이상을 이용하는 것이 보다 바람직하다.　
또, pH 조정 전에 미생물 균체액에 당질을 첨가 및/또는 pH 조정 후로 가열처리 전에 미생물 균체액에 당질을 첨가하는 것이 효소의 열안정성을 더욱 향상시키며, 효소역가를 더 높게 유지할 수 있는 점에서 바람직하다. 여기서 이용되는 당질은 특히 제한되는 것은 아니고, 단당, 2당, 3당 이상의 올리고당, 다당의 어느 쪽도 이용할 수가 있다. 단당으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스, 만노스 등을 들 수 있어 2당으로서는 유당, 유당 이성체, 말토오스, 스크로오스, 트레할로오스 등을 들 수 있어 3당 이상의 올리고당으로서는 갈락토올리고당, 말토올리고당, 프락토 올리고당 등의 각종 올리고당 등을 들 수 있으며, 다당으로서는 덱스트린, 전분 등을 들 수가 있다. 이들 당질 중에서도, 효소역가의 유지 효과나 코스트의 점으로부터, 유당, 글루코오스, 말토오스, 갈락토올리고당 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 바람직하고, 특히 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직하다. 미생물 균체액에 첨가하는 당질의 양은 특히 제한되는 것은 아니지만, 당질의 첨가량의 하한은 예를 들면, 미생물 균체액에 대해 0.2질량/체적%(이하, 단순히 "%"라고 한다) 이상이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 0.5% 이상, 더욱 바람직하기로는 2% 이상이다. 또한, 미생물 균체액에 당질을 첨가하는 시기나 방법도 특히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 별도 조제한 당질의 농후 용액을 첨가하는 방법을 들 수 있지만, 미생물 균체액에 첨가하는 당질 용액의 양이 너무 많으면 미생물 균체액 중의 균체 농도가 희박하게 되어, 미생물 균체액의 단위 중량당 효소역가가 저하해 버리는 문제가 생기는 경우가 있으므로, 당질의 첨가량의 상한은 30% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 15% 이하, 더욱 바람직하기로는 10% 이하이다. 이상으로부터, 미생물 균체액에 첨가하는 당질의 양은 0.2~30%가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 0.5~15%, 더욱 바람직하기로는 0.5~10%, 특히 바람직하기로는 2~10%이다.
또한, 미생물 균체액에 첨가하는 당질이 그 효소의 기질로 될 수 있는 경우(예를 들면, β－갈락토시다아제 활성을 가지는 미생물의 균체액에 유당을 가하는 경우)에는 당질 첨가로부터 가열처리가 끝나기까지 당질의 일부 또는 대부분이 효소 반응을 받는 경우도 있지만, 반응의 정도(분해도나 중합도)에 관계없이 당질을 첨가한 것에 의한 효과는 발휘되므로, 효소역가의 안정화라고 하는 점에는 전혀 문제가 없다. 예를 들면, 당질 첨가 후, 그대로 보존해도, 또는 냉각 처리나 가열처리해도, 효소역가의 안정화라고 하는 점에서는 전혀 문제가 없다. 또한, 상기의 경우, 미생물 균체액 중에, 첨가한 당질이 효소 반응을 받아 생성한 다른 당질이 포함되는 경우가 있지만, 이러한 당질이 존재하고 있어도 효소역가의 안정화라고 하는 점에서는 전혀 문제가 없다. 미생물 균체액 중에 첨가한 당질이 효소 반응을 받아 생성하는 당질로서는 단당, 2당, 3당 이상의 올리고당, 다당을 들 수가 있어 단당으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스, 만노오스 등을 들 수 있으며, 2당으로서는 유당, 유당 이성체, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스 등을 들 수 있고, 3당 이상의 올리고당으로서는 갈락토올리고당, 프락토 올리고당 등의 각종 올리고당을 들 수 있으며, 다당으로서는 덱스트린, 전분 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 당질 분해 효소(예를 들면, β－갈락토시다아제) 활성을 가지는 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질이 유당의 경우에는 유당이 효소 반응을 받기 때문에, 미생물 균체액 중에 포함되는 당질로서 글루코오스, 갈락토오스, 유당, 유당 이성체, 갈락토올리고당을 들 수가 있으며, 첨가하는 당질이 말토오스의 경우에는 미생물 균체액 중에 포함되는 당질로서 글루코오스, 말토오스, 말토올리고당을 들 수 있고, 첨가하는 당질이 덱스트린의 경우에는 미생물 균체액 중에 포함되는 당질로서 글루코오스, 말토오스, 말토올리고당, 덱스트린을 들 수가 있다. 또, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당, 글루코오스, 말토오스, 갈락토올리고당 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직한 것으로부터, 이들 당질을 첨가한 미생물 균체액 중에는 이들 당질과 이들의 당질이 효소 반응을 받아 생성하는 당질이 포함되며, 구체적으로는 유당, 글루코오스, 갈락토오스, 유당 이성체, 갈락토올리고당, 말토오스, 말토올리고당 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 당질이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 보다 바람직한 것으로부터, 미생물 균체액 중에는 유당, 글루코오스, 갈락토오스, 유당 이성체, 갈락토올리고당, 말토오스 및 말토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 당질이 포함되어 있는 것이 보다 바람직하다.
상기와 같이 하여 pH를 조정한 후, 가열처리를 한다. 가열처리의 방법은 특히 한정되는 것은 아니고, 연속적으로 행하는 플레이트식 열교환 장치에 의한 방법, 뱃치처리로 행하는 가열증기나 온수에 의해 균체액이 들어온 탱크를 가열하는 방법 등을 적용할 수 있지만, 효소의 실활을 극력 방지하도록 온도 제어하기 위해서는 뱃치처리로 행하는 가열증기나 온수에 의해 균체액이 들어온 탱크를 가열하는 방법의 쪽이 바람직하다. 뱃치처리 시의 가열처리는 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화할 수 있는 조건이면 특히 한정되지 않지만, 40~50℃이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 40~48℃, 더욱 바람직하기로는 40~46℃이다. 또한, 뱃치처리에서, pH 조정 전에 미생물 균체액에 당질을 첨가 및/또는 pH 조정 후에, 가열처리 전에 미생물 균체액에 당질을 첨가하는 경우는 40~60℃이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 40~55℃, 더욱 바람직하기로는 40~50℃이다. 또한, 가열 시간도 특히 한정되는 것은 아니지만, 1시간 이상이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 6시간 이상이다. 다만, 가열 시간이 너무 길면 효소역가가 저하하는 일이 있기 때문에, 24시간 이하가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 20시간 이하이고, 더욱 바람직하기로는 18시간 이하이다. 이상의 것에 따라, 가열 시간은 1~24시간이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 1~20시간, 더욱 바람직하기로는 1~18시간, 보다 바람직하기로는 6~24시간, 더욱 바람직하기로는 6~20시간, 보다 바람직하기로는 6~18시간이다. 또한, 가열처리 전에 당질이 첨가되어 있는 경우, 가열 시간은 1~24시간이 바람직하고, 더욱 바람직하기로는 4~20시간, 보다 바람직하기로는 5~18시간이다. 또, 본 발명 방법 1에 있어서 사균화라는 것은 미생물의 생균이, 가열처리에 의해 1000 cfu/㎖이하까지 감소하는 것을 말하며, 바람직하기로는 100 cfu/㎖이하, 보다 바람직하기로는 10 cfu/㎖이하까지 저감하는 것이 바람직하다.
또한, 상기와 같이 가열처리를 행함으로써, 미생물 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물 균체액 중의 미생물이 사균화된다. 여기서 효소역가가 유지되고 있다는 것은 가열처리 후(사균화 후)의 효소역가가 가열처리 전(사균화 전)의 효소역가의 80% 이상인 것을 말하며, 바람직하기로는 90% 이상, 보다 바람직하기로는 95% 이상이다.
열처리 후의 미생물 균체액(사균화 미생물 균체액)은 25℃ 이하, 바람직하기로는 0~5℃의 저온 조건에서 장기간 보존할 수가 있다. 그리고 이들 가열처리 후의 미생물 균체액은 효소활성을 이용하는 여러 가지의 용도에 이용할 수가 있다.
또한, 가열처리 후의 미생물 균체액은 다시, 분무 건조, 동결건조 등의 공지의 건조 수단으로 건조시켜 사균화 미생물 균체 건조분말로 할 수 있다. 그때에, 건조 공정이나 건조 후의 보존에 의한 효소역가의 저하를 막기 위해서, 가열처리 후의 미생물 균체액에 당질을 첨가할 수도 있다. 이용되는 당질은 특히 제한되는 것은 아니고, 단당, 2당, 3당 이상의 올리고당, 다당의 어느 것이라도 이용할 수 있다. 단당으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스, 만노오스 등을 들 수 있어 2당으로서는 유당, 유당 이성체, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스 등을 들 수 있으며, 3당 이상의 올리고당으로서는 갈락토올리고당, 말토올리고당, 프락토 올리고당 등의 각종 올리고당을 들 수 있고, 다당으로서는 덱스트린, 전분 등을 들 수가 있다. 이들 당질 중에서도, 효소역가의 유지 효과, 건조의 용이함이나 코스트의 점으로부터, 유당, 말토오스 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직하고, 특히 유당 및/또는 말토오스를 이용하는 것이 바람직하고, 유당을 이용하는 것이 게다가 바람직하다. 첨가하는 당질의 양은 특히 한정되는 것은 아니고, 당질의 첨가량의 하한은 예를 들면, 미생물 균체액에 대해 0.1% 이상이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 0.5% 이상, 더욱 바람직하기로는 1% 이상이다. 또한, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질의 양이 너무 많으면 미생물 균체액을 건조분말로 했을 경우에 미생물 균체 건조분말의 단위 중량당 효소역가가 저하해 버리는 일이 있기 때문에, 당질의 첨가량의 상한은 30% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 15% 이하, 더욱 바람직하기로는 10% 이하, 보다 바람직하기로는 5% 이하, 더욱 보다 바람직하기로는 3% 이하이다. 이상의 것으로부터, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질의 양은 미생물 균체액에 대해 0.1~30%가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 0.5~15%, 더욱 바람직하기로는 0.5%~10%, 보다 바람직하기로는 1%~10%, 더욱 보다 바람직하기로는 1%~5%, 보다 바람직하기로는 1%~3%이다. 또한, 당질의 첨가 방법은 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 별도 조제한 당질의 농후 용액을 첨가하는 방법을 들 수 있다. 건조의 정도는 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 건조분말 중의 수분량이, 약 10% 이하가 될 때까지 행한다. 이 건조에 의해, 건조 직후의 효소역가의 80% 이상의 효소역가를 유지한 채로 액체의 경우보다 더 장기간, 예를 들면, 1년 이상도 보존할 수가 있다. 또한, 이들의 사균화 미생물 균체 건조분말은 효소활성을 이용하는 여러 가지의 용도에 이용할 수가 있다.
또 전술한 분무 건조의 조건으로서는 건조실의 입구, 출구온도는 효소가 현저히 실활하지 않는 범위라면 좋고, 또한, 아토마이저 회전수, 원액 공급량 등은 그 조건에서의 약간 제품으로서의 특성이 다른 미생물 균체 건조분말을 얻을 수 있지만, 최종적인 효소역가에는 거의 영향은 없기 때문에, 나머지 유의할 필요는 없다. 구체적으로는 건조실의 입구온도는 70℃~200℃, 바람직하기로는 110℃~180℃, 출구온도는 50℃~120℃, 바람직하기로는 70℃~90℃을 예시할 수가 있다. 또한, 아토마이저 회전수는 10,000~30,000rpm, 원액 공급량은 0.2~200kg/시간을 예시할 수 있다. 이들의 분무 건조는 아토마이저 이외에도 이류체(二流體) 노즐 등의 분무 방식을 이용하여 행할 수 있다. 또, 공업적으로 연속 생산할 수 있다고 하는 점으로부터, 분무 건조법을 이용하는 것이 바람직하다.
상기에서 얻어진 가열처리 후의 미생물 균체액 및 사균화 미생물 균체 건조분말은 각각 단독으로 또는 조합하여 함유시켜 효소 조성물로 할 수도 있다. 이 효소 조성물에는 효소활성에 영향을 미치지 않는 범위에서 희석제, 부형제, 계면활성제, 방부제 등을 첨가할 수도 있다. 또한, 이 효소 조성물도, 효소활성을 이용하는 여러 가지의 용도에 이용할 수가 있다.
다음에, 상기한 미생물을 사균화하는 본 발명 방법 중, 효소활성을 가지는 미생물 균체액에 당질을 첨가하고, 이어서 이것을 가열처리하는 방법(본 발명 방법 2)에 대해서 설명한다. 본 발명 방법 2의 실시에서는 우선, 효소활성을 가지는 미생물을 통상의 방법으로 따라서 배지 등으로 배양하여 배양액을 얻는다. 이 배양액을 그대로 미생물 균체액으로서 이용해도 좋으나, 다시 원심분리 장치나 막농축 장치 등을 이용하여, 적의 세정, 농축을 행한 것을, 효소활성을 가지는 미생물 균체액으로서 이용해도 좋고. 이 미생물 균체액의 고형분 함량은 특히 한정되는 것은 아니고, 구체적으로는 0.5~10%를 예시할 수가 있다. 또, 전술한 바와 같이, 이 명세서에 있어서의 「고형분 함량」이란, 미생물 균체액 중의 균체의 고형분 함량을 가리키며, 예를 들면, 미생물 균체액 중에 배지 성분이 포함되는 경우는 그 배지 성분에 유래하는 고형분은 이 명세서에 있어서의 「고형분 함량」에는 포함되지 않는다.
이어서 이 미생물 균체액에, 당질을 첨가한다. 여기서 이용되는 당질은 특히 제한되는 것은 아니고, 단당, 2당, 3당 이상의 올리고당, 다당의 어느 것이라도 이용할 수 있다. 단당으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스, 만노오스 등을 들 수 있으며, 2당으로서는 유당, 유당 이성체, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스 등을 들 수 있고, 3당 이상의 올리고당으로서는 갈락토올리고당, 말토올리고당, 프락토 올리고당 등의 각종 올리고당 등을 들 수 있으며, 다당으로서는 덱스트린, 전분 등을 들 수가 있다. 이들 당질 중에서도, 효소역가의 유지 효과나 코스트의 점으로부터, 유당, 글루코오스, 말토오스, 갈락토올리고당 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 바람직하고, 특히 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직하다. 미생물 균체액에 첨가하는 당질의 양은 특히 제한되는 것은 아니지만, 당질의 첨가량의 하한은 예를 들면, 미생물 균체액에 대해 0.2% 이상이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 0.5% 이상, 더욱 바람직하기로는 2% 이상이다. 또한, 미생물 균체액에 당질을 첨가하는 시기나 방법도 특히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 별도 조제한 당질의 농후 용액을 첨가하는 방법을 들 수 있지만, 미생물 균체액에 첨가하는 당질 용액의 양이 너무 많으면 미생물 균체액 중의 균체 농도가 희박하게 되어, 미생물 균체액의 단위 중량당 효소역가가 저하해 버리는 문제가 생기는 경우가 있으므로, 당질의 첨가량의 상한은 30% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 15% 이하, 더욱 바람직하기로는 10% 이하이다. 이상의 것으로부터, 미생물 균체액에 첨가하는 당질의 양은 0.2~30%가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 0.5~15%, 더욱 바람직하기로는 0.5~10%, 특히 바람직하기로는 2~10%이다.
상기와 같이 하여 미생물 균체액에 당질을 첨가한 후는 가열처리를 한다. 가열처리의 방법은 특히 한정되는 것은 아니고, 연속적이게 행하는 플레이트식 열교환 장치에 의한 방법, 뱃치처리로 행하는 가열증기나 온수에 의해 균체액이 들어온 탱크를 가열하는 방법 등을 적용할 수 있지만, 효소의 실활을 극력 방지하도록 온도를 제어하기 위해서는 뱃치처리로 행하는 가열증기나 온수에 의해 균체액이 들어온 탱크를 가열하는 방법의 쪽이 바람직하다. 뱃치처리 시의 가열처리는 효소역가가 유지된 채로 미생물을 사균화할 수 있는 조건이면 특히 한정되지 않지만, 40~60℃이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 40~55℃, 더욱 바람직하기로는 40~50℃이다. 또한, 가열 시간도 특히 한정되는 것은 아니지만, 1시간 이상이 바람직하고, 보다 바람직하기로는 4시간 이상, 더욱 바람직하기로는 5시간 이상이다. 다만, 가열 시간이 너무 길면 효소역가가 저하하는 일이 있기 때문에, 24시간 이하가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 20시간 이하이고, 더욱 바람직하기로는 18시간 이하이다. 이상의 것보다, 가열 시간은 1~24시간이 바람직하고, 더욱 바람직하기로는 4~20시간, 보다 바람직하기로는 5~18시간이다. 또, 본 발명 방법 2에 있어서 사균화라는 것은 미생물의 생균이, 가열처리에 의해 1000 cfu/㎖이하까지 저감하는 것을 말하며, 바람직하기로는 100 cfu/㎖이하, 보다 바람직하기로는 10 cfu/㎖이하까지 저감하는 것이 바람직하다.
또한, 상기와 같이 가열처리를 행함으로써 미생물 균체액의 효소역가가 유지된 채로 미생물 균체액 중의 미생물이 사균화된다. 여기서 효소역가가 유지되고 있다는 것은 가열처리 후(사균화 후)의 효소역가가 가열처리 전(사균화 전)의 효소역가의 80% 이상인 것을 말해, 바람직하기로는 90% 이상, 보다 바람직하기로는 95% 이상이다.
또, 미생물 균체액에 첨가하는 당질이 그 효소의 기질로 될 수 있는 경우(예를 들면, β－갈락토시다아제 활성을 가지는 미생물의 균체액에 유당을 가하는 경우)에는 당질 첨가로부터 가열처리가 끝나기까지 당질의 일부 또는 대부분이 효소 반응을 받는 경우도 있지만, 반응의 정도(분해도나 중합도)에 관계없이 당질을 첨가한 것에 의한 효과는 발휘되므로, 효소역가의 안정화라고 하는 점으로부터는 전혀 문제가 없다. 예를 들면, 당질 첨가 후, 그대로 보존해도, 또는 냉각 처리나 가열처리해도, 효소역가의 안정화라고 하는 점으로부터는 전혀 문제가 없다. 또한, 상기의 경우, 미생물 균체액 중에, 첨가한 당질이 효소 반응을 받아 생성한 다른 당질이 포함되는 경우가 있지만, 이러한 당질이 존재하고 있어도 효소역가의 안정화라고 하는 점으로부터는 전혀 문제가 없다. 미생물 균체액 중에 포함되는 당질로서는 단당, 2당, 3당 이상의 올리고당, 다당을 들 수가 있으며, 단당으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스, 만노오스 등을 들 수 있고, 2당으로서는 유당, 유당 이성체, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스 등을 들 수 있으며, 3당 이상의 올리고당으로서는 갈락토올리고당, 프락토 올리고당 등의 각종 올리고당을 들 수 있고, 다당으로서는 덱스트린, 전분 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 당질 분해 효소(예를 들면, β－갈락토시다아제) 활성을 가지는 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질이 유당의 경우에는 유당이 효소 반응을 받기 때문에, 미생물 균체액 중에 포함되는 당질로서 글루코오스, 갈락토오스, 유당, 유당 이성체, 갈락토올리고당을 들 수가 있으며, 첨가하는 당질이 말토오스의 경우에는 미생물 균체액 중에 포함되는 당질로서 글루코오스, 말토오스, 말토올리고당을 들 수가 있고, 첨가하는 당질이 덱스트린의 경우에는 미생물 균체액 중에 포함되는 당질로서 글루코오스, 말토오스, 말토올리고당, 덱스트린을 들 수가 있다. 또, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당, 글루코오스, 말토오스, 갈락토올리고당 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직한 것으로부터, 이들의 당질을 첨가한 미생물 균체액 중에는 이들의 당질과 이들의 당질이 효소 반응을 받아 생성하는 당질이 포함되고, 구체적으로는 유당, 글루코오스, 갈락토오스, 유당 이성체, 갈락토올리고당, 말토오스, 말토올리고당 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 당질이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 보다 바람직한 것으로부터, 미생물 균체액 중에는 유당, 글루코오스, 갈락토오스, 유당 이성체, 갈락토올리고당, 말토오스 및 말토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 당질이 포함되어 있는 것이 보다 바람직하다.
가열처리 후의 미생물 균체액(사균화 미생물 균체액)은 25℃ 이하, 바람직하기로는 0~5℃의 저온 조건으로 장기간 보존할 수가 있다. 그리고, 이들의 가열처리 후의 미생물 균체액은 효소활성을 이용하는 여러 가지의 용도에 이용할 수가 있다.
또한, 가열처리 후의 미생물 균체액은 더욱, 분무 건조, 동결건조 등의 공지의 건조 수단으로 건조시켜 사균화 미생물 균체 건조분말로 할 수가 있다. 건조 정도는 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 건조분말 중의 수분량이, 약 10% 이하가 될 때까지 행한다. 이 건조에 의해, 건조 직후의 효소역가의 80% 이상의 효소역가를 유지한 채로 액체의 경우보다 보다 장기간, 예를 들면, 1년 이상이나 보존할 수가 있다. 또한, 이들의 사균화 미생물 균체 건조분말은 효소활성을 이용하는 여러 가지의 용도에 이용할 수가 있다.
또, 상기한 분무 건조의 조건으로서는 건조실의 입구, 출구온도는 효소가 현저히 실활 하지 않는 범위라면 좋고, 또한, 아토마이저 회전수, 원액 공급량 등은 그 조건에 따라 약간 제품으로서의 특성이 다른 미생물 균체 건조분말을 얻을 수 있지만, 최종적인 효소역가에는 거의 영향은 없기 때문에, 나머지 유의할 필요는 없다. 구체적으로는 건조실의 입구온도는 70℃~200℃, 바람직하기로는 110℃~180℃, 출구온도는 50℃~120℃, 바람직하기로는 70℃~90℃을 예시할 수가 있다. 또한, 아토마이저 회전수는 10,000~30,000rpm, 원액 공급량은 0.2~200kg/시간을 예시할 수가 있다. 이들의 분무 건조는 아토마이저의 그 밖에도 이류체 노즐 등의 분무 방식을 이용해 실시할 수가 있다. 또, 공업적으로 연속 생산할 수 있다고 하는 점으로부터, 분무 건조법을 이용하는 것이 바람직하다.
상기에서 얻어진 가열처리 후의 미생물 균체액 및 사균화 미생물 균체 건조분말은 각각 단독으로 또는 조합하여 함유시켜 효소 조성물로 할 수도 있다. 이 효소 조성물에는 효소활성에 영향을 미치지 않는 범위에서 희석제, 부형제, 계면활성제, 방부제 등을 첨가할 수도 있다. 또한, 이 효소 조성물도, 효소활성을 이용하는 여러 가지의 용도로 이용할 수가 있다.
[실시예]
다음에 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 하등 제약되는 것은 아니다. 또, 이하의 실시예에 있어서, β－갈락토시다아제 역가 고형분 함량, 미생물 균체 건조분말의 잔류수분, 입도분포, 스포로보로마이세스·싱귤라리스의 생균수 및 당 조성은 다음의 방법으로 측정, 분석했다.
(1) β－갈락토시다아제 역가의 측정법
　(a) 검액의 조제
　미생물 균체액의 약 2.5g 내지 약 6.0g를 50㎖ 용 메스 플라스크로 정확하게 칭량하고, 50mM 인산나트륨-구연산 완충액 (pH 4.0)(이하, 「완충액」이라고 한다)으로 정용(定容)하여 충분히 용해 내지 현탁하여 검액(檢液)으로 했다. 또한, 미생물 균체액이 당질(유당)을 포함한 경우에는 그의 약 2.5g를 50㎖ 용 원심관에 정확하게 칭량하고, 완충액으로 현탁한 후에, 원심분리(20,000 G, 15분간)하고, 세정하여 당질을 제거했다. 이 세정 조작을 3회 행한 후에, 50㎖ 용 메스 플라스크로 옮기고, 완충액으로 정용하고, 충분히 현탁하여 검액으로 했다. 다시, 피검시료가 미생물 균체 건조분말(이하, 「건조품」이라고 한다)의 경우는 그의 약 150~350mg에 대해서, 동일 조작으로 세정한 후에 검액을 조제했다.
　(b) 측정
o－니트로페닐-β－D－갈락토피라노시드(o-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside; ONPG) 0.3766g를 100㎖용 메스 플라스크로 칭량하고, 완충액으로 용해, 정용하여 12.5mM의 용액을 조제했다. 시험관에, 이 ONPG 용액을 0.8㎖ 넣어 30℃의 항온 수조 중에서 5분간 유지했다. 이것에 검액을 0.2㎖ 첨가하여 혼합하고, 30℃에서 10분간 반응시킨 후, 0.25M 탄산나트륨 용액을 4㎖ 가하여 반응을 정지했다(시험계). 별도로, 시험관에 ONPG 용액 0.8㎖와 0.25M 탄산나트륨 용액 4㎖를 넣고, 다시 검액을 0.2㎖를 가하여 혼합했다(맹검계). 시험계 및 맹검계의 각각을, 원심분리(2,000 G, 10분간, 15~20℃)에 걸어 얻어진 상청에 대하여 파장 420nm에서 흡광도를 측정하고, 다음 식에 의해 단위수를 산출했다. 또, 상기의 반응 조건으로, 1분간에 1μmol의 o－니트로페놀(o-nitrophenol; ONP)을 유리하는데 필요로 하는 효소량을 1U로 했다.
　
Figure 112013080073141-pct00001
A1: 시험액의 흡광도
A2: 맹검의 흡광도
B: 희석배액
* U/g 또는 U/㎖
(2) 고형분 함량　
사균화 처리 전후의 미생물 균체액의 5~10g, 또는 5~10㎖를 알루미늄 접시에 정확하게 칭량하고, 105℃에서 16시간 건조했다. 이 조작에 있어서의 건조 전후의 중량으로부터, 고형분 함량(질량%)을 산출했다. 또한, 분무 건조에 있어서, 고형분당 β－갈락토시다아제 역가를 산출할 때에 이용하는 건조 원액과 건조품의 고형분 함량도 같은 조건으로 구했다. 또, 미생물 균체액이 배양액일 때는(배지 성분을 포함할 때는), 원심관으로 정확하게 칭량하고, 원심 세정하여 배지 성분을 제거한 후, 세정 균체의 전량을 알루미늄 접시로 옮겨, 상기와 같은 조작으로 건조하고, 고형분 함량을 산출했다.
(3) 잔류 수분량
분무 건조에서의 건조품의 잔류 수분량은 (주)켓토카가쿠겐큐쇼((株)ケット科學硏究所) 제의 적외선 수분계를 이용하여 105℃, 15분간의 조건으로 측정했다.
(4) 입도 분포
건조품의 입도 분포는 심파텍사(シンパテック社) 제의 레이저 회절식 입도 분포 측정 장치(HELOS ＆ RODOS 시스템)를 이용하여 건식으로 측정했다.
(5) 스포로보로마이세스·싱귤라리스 생균수
락토스 2.5%, 효모 엑기스 0.5%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%, 한천 1.5%가 되도록, 이것들을 물에 용해하고, 2N 염산으로 pH 5.0으로 조정한 후, 오토클레이브 멸균(121℃, 10분간)하여 평판 플레이트(φ 90mm)를 작성했다. 이것을 생리 식염수로 용해하고, 희석한 샘플을 100㎕ 도말(塗抹)하고, 25℃에서 약 일주일 간 배양한 후, 형성된 콜로니를 계측하여 스포로보로마이세스·싱귤라리스 생균수로 했다.
(6) 당 조성 분석
당 조성은 HPLC를 이용하여 이하의 조건으로 분석했다.
［HPLC 조건］
컬럼: Shodex SUGAR KS－802(昭和電工(株)))
용매: 순수
유속: 0.5㎖/분
온도: 80℃
검출기: 시차굴절계
실시예　1
　　　미생물의 사균화:
(1) 배양
스포로보로마이세스·싱귤라리스(Sporobolomyces singularis)　YIT　10047 (ISK－##2B6, 이하, 「Ss」라고 표기)을, 글루코오스 5%, 효모 엑기스 1.0%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지 (pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양했다. 이 배양액을 원심분리(10,000 G, 30분간)하여 얻어진 습균체(濕菌體)에 멸균한 수돗물을 가하고, 충분히 현탁했다. 이것을 동일 조건에서 원심분리하고, 고형분 함량이 5% 정도가 되도록 습균체를 소량의 수돗물에 현탁한 것을 Ss 농축액으로 했다.　
(2) 사균화 ＜pH와 가열 온도의 검토＞
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5.0%)의 pH를 5N 수산화나트륨 용액으로, 3.5~6.3으로 단계적으로 조정했다. 이들과 pH 미조정(pH 3.1)의 Ss 농축액을 35℃, 40℃, 45℃, 50℃ 또는 55℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 전후의 Ss의 생균수 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 1에 나타냈다.

 가열전 35℃ 40℃ 45℃ 50℃ 55℃
생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율
(%)		 생균수 (cfu/㎖) 역가 잔존율
(%)		 생균수 (cfu/㎖) 역가 잔존율
(%)		 생균수 (cfu/㎖) 역가 잔존율
(%)		 생균수 (cfu/㎖) 역가 잔존율
(%)		 생균수 (cfu/㎖)
pH 3.1
(미조정)		 5.2E+
09		 97.6 5.0E+
01		 92.2 <10 68.5 <10 22,6 <10 - -
pH 3.5 3.7E+
09		 99.4 <10 102.6 <10 89.4 <10 42.6 <10 - -
pH 4.0 1.2E+
10		 - - 96.3 <10 82.9 <10 25.8 <10 0.9 <10
pH 4.2 3.9E+
09		 97.6 1.7E+
03		 102.5 <10 97.5 <10 63.3 <10 - -
pH 4.7 4.9E+
09		 97.7 4.4E+
04		 100.2 <10 97.5 <10 70.0 <10 - -
pH 5.0 1.5E+
10		 - - 99.5 <10 94.8 <10 53.1 <10 1.2 <10
pH 5.8 9.0E+
09		 - - 101.1 <10 98.3 <10 59.0 <10 2.1 <10
pH 6.3 6.0E+
09		 - - 97.5 <10 94.1 <10 54.4 <10 1.0 <10
pH를 3.5, 4.0으로 조정한 후에 가열처리했을 경우에는 40~45℃의 가열 온도에서 Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 45℃에서는 80% 이상, 40℃에서는 90% 이상이었다. 또한, pH 3.5의 경우는 35℃에서도 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 90% 이상이었다. pH 4.2, 4.7, 5.0, 5.8 또는 6.3으로 조정하여 가열처리했을 경우에는 40~45℃의 가열 온도에서 Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 90% 이상이었다. 한편, pH의 조정을 행하지 않고, 가열처리를 행하였을 경우 (pH 3.1)에서는 40℃의 가열 온도에서 Ss가 사균화되고, 또, 역가 잔존율이 90% 이상으로 되지만, 그 값은 92.2%이고, pH를 조정했을 경우에 비해 역가 잔존율은 낮았다. 더욱이, 45℃에서는 역가 잔존율이 80%를 밑돌아, 다른 pH 조건보다, 사균화 가능하고, 효소역가를 유지할 수 있는 온도 조건이 5℃ 이상 좁다고 추측되었다.
(3) 사균화 ＜가열 온도의 상세한 검토＞
상기 (1)과 동일하게 하여 얻어진 Ss 농축액 (고형분 함량 5.6%)의 pH를, 5N 수산화나트륨 용액으로 4.0, 4.5, 4.9, 5.7 또는 6.5로 조정했다. 이들을 44℃, 46℃, 48℃, 50℃ 또는 52℃에서 5시간 또는 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 전후의 Ss의 생균수 및 역가 잔존율의 결과를 표 2 (가열처리 5시간), 표 3 (가열처리 18시간)에 나타냈다.

 가열전 44℃ 46℃ 48℃ 50℃ 52℃
생균수
(cfu/㎖
 역가 잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖
pH 4.0 3.9E+
10		 95.1 <10 95.6 <10 87.4 <10 67.3 <10 37.2 <10
pH 4,5 7.0E+
09		 - - 100.6 <10 95.8 <10 88.0 <10 - -
pH 4.9 2.7E+
11		 98.8 1.7E+
02		 99.7 <10 95.1 <10 91.8 <10 60.3 <10
pH 5.7 2.2E+
10		 99.7 4.5E+
02		 97.6 <10 92.1 <10 94.1 <10 55.8 <10
pH 6.5 1.1E+
10		 99.1 2.4E+
03		 93.9 <10 87.5 <10 73.1 <10 44.9 <10

가열전 44℃ 46℃ 48℃ 50℃
생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율(%) 생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율(%) 생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율(%) 생균수
(cfu/㎖		 역가 잔존율(%) 생균수
(cfu/㎖
pH 4.0 3.9E+10 94.5 <10 87.3 <10 70.0 <10 46.3 <10
pH 4.5 7.0E+09 - - 91.0 <10 80.3 <10 65.5 <10
pH 4.9 2.7E+11 100.3 <10 96.1 <10 84.5 <10 72.3 <10
pH 5,7 2.2E+10 96.9 <10 101.4 <10 81.6 <10 76.9 <10
pH 6.5 1.1E+10 96.7 <10 94.0 <10 77.0 <10 57.6 <10
가열처리 5시간에 있어서, pH 4.0으로 조정한 후, 가열처리했을 경우에는 44~48℃의 가열 온도에서, Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 48℃에서는 80% 이상, 44~46℃에서는 90% 이상이었다. pH 4.5로 조정한 후, 가열처리했을 경우에는 46~50℃의 가열 온도에서, Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 50℃에서는 80% 이상, 46~48℃에서는 90% 이상이었다. pH 4.9 또는 5.7로 조정한 후, 가열처리했을 경우에는 44~50℃의 가열 온도에서, Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 90% 이상이었다. 특히 46~50℃의 가열 온도에서는 Ss는 10 cfu/㎖이하로 되었다. pH 6.5로 조정한 후, 가열처리했을 경우에는 44~48℃의 가열 온도에서, Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 48℃에서는 80% 이상, 44~46℃에서는 90% 이상이었다. 특히 46~48℃에서는 Ss는 10 cfu/㎖ 이하로 되었다.
또한, 가열처리 18시간에 있어서, pH 4.0으로 조정한 후, 가열처리했을 경우에는 44~46℃의 가열 온도에서, Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 46℃에서는 80% 이상, 44℃에서는 90% 이상이었다. pH 4.5, 4.9 또는 5.7로 조정한 후, 가열처리했을 경우에는 44~48℃의 가열 온도에서, Ss는 사균화되고, 또, 역가 잔존율은 48℃에서는 80% 이상, 44~46℃에서는 90% 이상이었다. pH 6.5로 조정한 후, 가열처리했을 경우에는 44~46℃의 가열 온도에서, Ss는 사균화되고, 또 역가 잔존율은 90% 이상이었다.
(4) 사균화 ＜가열 시간의 검토＞
　상기 (1)과 같게 하여 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5.0%)의 pH를, 5N 수산화나트륨 용액으로 4.5로 조정하고, 40℃ 또는 45℃로 유지하여 가열처리를 했다. 가열처리 중의 Ss의 생균수를 경시적으로 측정한 결과를 표 4에 나타냈다.
유지시간(시간)
 가열온도
40℃ 45℃
0 1.3E+09 3.0E+09
1 1.5E+08 5.0E+01
2 9.0E+06 <10
3 2.2E+06 <10
4 9.0E+04 <10
5 6.0E+03 <10
6 1.7E+02 <10
9 <10 <10
13 <10 <10
18 <10 <10
Ss생균수는 40℃, 45℃의 가열온도에서도 경시적으로 감소하고, 40℃의 가열처리에서는 6시간에 1,000 cfu/㎖이하, 9시간에 10 cfu/㎖이하로 되었다. 또한, 45℃의 가열처리에서는 1시간에 1,000 cfu/㎖이하, 2시간에 10 cfu/㎖이하로 되었다.
(5) 사균화 ＜유당과의 조합＞
상기 (1)와 동일하게 하여 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5.6%)에 대하여, 5N 수산화나트륨 용액으로 pH 4.5로 조정한 것, 유당이 1%로 되도록 첨가한 것(pH 미조정), 유당이 1%로 되도록 첨가한 후 pH를 4.5로 조정한 것의 3종을 조제하고, 50℃에서 18시간 유지하여 가열처리를 했다(시험 I). 동일 조작으로, 유당을 2% 첨가했을 경우도 실시했다(시험 II). 각 Ss현탁액의 역가 잔존율을 표 5에 나타냈다. 또, 가열처리 후의 Ss생균수는 모두 10 cfu/㎖이하였다.
pH만 조정 유당만 첨가 pH 조정 + 유당 첨가
시험 I 61.8 72.0 87.9
시험 II 62.9 84.3 94.4
　
시험 I, II 모두, pH 조정 또는 유당 첨가의 단독 처리 때의 역가 잔존율보다도, pH 조정과 유당 첨가를 조합했을 때의 역가 잔존율 쪽이 높았다. pH 조정에 의한 역가 안정 효과는 유당 존재하에서도 변함없이 발휘되고, 또한 역가 잔존율이 높아지는 것을 알았다.
실시예　2
건조품의 조제:
실시예 1과 동일하게 하여 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5.3%)의 pH를 5N 수산화나트륨 용액으로 4.5로 조정하고, 40℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 이 사균화 Ss 농축액 7.8ℓ에, 8, 20, 40% 유당 용액을 2.6ℓ 가하고, 충분히 혼합하여 고형분 함량이 Ss: 약 4%, 유당: 2, 5, 10%의 건조 원액을 조제했다. 이들과, 유당을 첨가하지 않은 사균화 Ss 농축액을 각각, 분무 건조 파일럿장치(프로닥션마이나, GEA 프로세스엔지니어링(주))을 이용하여, 입구온도: 120℃, 출구온도: 약 80℃, 아토마이저 회전수: 12,500rpm, 원액 처리량: 4kg/시간의 조건으로 건조하여, 양호한 건조품을 얻었다. 이들의 역가 잔존율(건조 원액의 고형분당 역가에 대한 건조품의 고형분당 역가의 비율), 평균 입경, 잔류 수분을 측정한 결과를 표 6에 나타낸다.
제품 1 제품 2 제품 3 제품 4

건조원액 중 농도(%)		 Ss 4 4 4 4
유당 2 5 10 0
총고형분 6 9 14 4
아토마이저 회전수(rpm) 12,500 12,500 12,500 12,500
액체 공급량(kg/hr) 4.0 4.0 4.0 4.0
건조실 입구온도(℃) 120 120 120 120
건조실 출구온도(℃) 80 80 80 80

건조품
 평균입경(㎛) 19.6 21.5 24.5 18.3
잔류수분(%) 4.7 4.6 5.2 4.9
역가잔존율(%) 92.1 96.9 99.8 97.8
건조 원액 중의 유당 농도 0~10%에 있어서, 건조 후의 역가 잔존율이 90% 이상인 건조품을 얻을 수 있었다. 또, 이들 건조품의 Ss생균수는 모두 10 cfu/㎖이하이고, 가열처리 전후의 역가 잔존율은 모두 90% 이상이었다.
실시예　3
올리고당 생성 시험:
(1) 건조품의 현탁액의 조제
상기 실시예 2에서 얻어진 건조품 중, 제품 1과 제품 2를 각각 45U에 상당하는 양을 칭량하고, 이들을 각각 10㎖의 이온 교환수에 가하고 현탁했다.
(2) 올리고당 생성 반응
상기 (1)에서 조제한 건조품의 현탁액의 전량 또는 실시예 1과 같은 방법으로 얻어진 Ss 농축액 45U에 상당하는 양을, 각각 60% 유당 용액 800㎖에 가하고 혼합한 후, 65℃, pH 6에서 22시간 반응시켰다. 이때의 당 조성을 조사한 결과를 표 7에 나타냈다.
제품 1 제품 2 Ss의 농축액

당 조성(%)

 ≥4당 1.0 1.0 0.9
3당 30.1 10.0 29.6
2당 57.8 58.0 58.7
Glc 10.8 10.7 10.5
Gal 0.3 0.3 0.4
건조품의 현탁액과 Ss 농축액(생균 현탁액)과는 생성하는 당 조성이나 반응속도에 큰 차이는 없고, 건조품이 올리고당의 제조에 이용할 수 있음을 알았다.
실시예　4
미생물의 사균화:
(1) 배양
실시예 1의 (1)과 동일하게 하여 Ss 농축액(고형분 함량 5.8%)을 얻었다.
(2) 사균화 ＜유당의 농도와 가열 온도의 검토＞
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액과 유당 용액을 3:1로 혼합하고, 유당을 0.2~15% 포함하는 Ss 농축액을 조제했다. 이들과 유당 무첨가의 Ss 농축액을 35℃, 40℃, 45℃, 50℃ 또는 55℃에서 18시간 유지하고, 가열처리했다. 가열처리 전후의 Ss의 생균수의 측정 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 8에 나타냈다.

 가열전 35℃ 40℃ 45℃ 50℃ 55℃
생균수
(cfu/㎖)		 역가
잔존율(%)		 생균수
(cfu/㎖)		 역가
잔존율(%)		 생균수
(cfu/㎖)		 역가
잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖)		 역가
잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖)		 역가
잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖)

유당
농도
(w/v)



 0%(무첨가) 1.7E+
10		 98.3 6.0E+
07		 97.0 4.0E+01 73.8 <10 28.2 <10 - -
0.2% 7.0E+
09		 101.3 4.0E+
07		 101.3 <10 81.8 <10 37.6 <10 - -
0.5% 9.0E+
09		 101.6 8.0E+
07		 103.1 <10 92.1 <10 55.4 <10 - -
1% 1.3E+
10		 101.5 1.3E+
08		 100.0 <10 100.8 <10 75.9 <10 - -
2% 1.3E+
10		 99.7 3.0E+
07		 105.3 <10 106.7 <10 90.7 <10 - -
5% 1.0E+
10		 - - 105.8 <10 105.0 <10 101.5 <10 60.4 <10
10% 1.4E+
10		 - - 105.4 <10 103.7 <10 103.0 <10 92.7 <10
15% 7.0E+
10		 - - 104.4 <10 104.5 <10 102.2 <10 98.5 <10
　
유당을 0.2% 첨가하여 가열처리했을 경우에는 40~45℃의 가열 온도에서 Ss는 사균화되고, 또한, 역가 잔존율은 45℃에서는 80% 이상, 40℃에서는 90% 이상이었다. 유당을 0.5~1% 첨가하고, 가열처리했을 경우에는 40~45℃의 가열 온도에서 Ss는 사균화되고, 또한, 역가 잔존율은 90% 이상이었다. 유당을 2~5% 첨가하고, 가열처리했을 경우에는 40~50℃의 가열 온도에서 Ss는 사균화되고, 또한, 역가 잔존율은 90% 이상이었다. 유당을 10~15% 첨가하고 가열처리했을 경우에는 40~55℃의 가열 온도에서 Ss는 사균화되고, 또한, 역가 잔존율은 90% 이상이었다. 한편, 유당을 무첨가로 가열처리했을 경우에는 40℃의 가열 온도로 Ss가 사균화되고, 또한 역가 잔존율이 90% 이상으로 되지만, 45℃에서는 역가 잔존율이 80%를 밑돌아, 사균화 가능하고, 효소역가를 유지할 수 있는 온도 조건이, 유당을 첨가했을 경우보다 5℃ 이상 좁다고 추측되었다.
(3) 사균화 ＜당질의 종류의 검토＞
덱스트린(NSD#300, サンエイ糖化(株)), 갈락토올리고당 3당 이상 획분, 유당, 말토오스 및 글루코오스에 대해서, 사균화시의 효소활성의 안정화 효과를 비교했다. 상기 (1)과 동일하게 하여 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5. 6%)과 8, 20%의 당질 용액을 3:1로 혼합하고, 당질을 2% 또는 5% 함유하는 Ss 농축액을 조제했다. 이들을 45℃ 또는 50℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 9에 나타냈다. 또, 가열처리 전의 Ss생균수는 108 cfu/㎖이었지만, 가열처리 후에는 어느 쪽의 당질, 어느 쪽의 농도도 10 cfu/㎖이하로 감소하고, 사균화되어 있었다.


 당질농도(w/v) 및 가열온도
2% 5%
45℃ 50℃ 45℃ 50℃


당질의
종류
 덱스트린 NSD300 93.9 48.6 98.8 68.8
갈락토올리고당 3당 이상의 획분 102.5 81.5 108.1 97.8
유당 103.5 83.4 103.6 101.1
말토오스 101.3 91.0 104.8 98.2
글루코오스 104.4 88.5 107.3 99.4
당질 무첨가 때의 역가 잔존율은 45℃의 가열 온도에서는 72.7%, 50℃의 가열 온도에서는 29.5%였다. 이것에 대해, 어느 쪽의 당질도 공존시킨 쪽이 역가 잔존율은 높고, 50℃의 가열 온도로 덱스트린을 공존시켰을 경우 이외는 역가 잔존율은 80% 이상으로까지 향상했다.
(4) 사균화 ＜가열 시간의 검토＞
상기 (1)과 동일하게 하여 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5.0%)과 20% 유당 용액을 3:1로 혼합하고, 유당을 5% 함유하는 Ss 농축액을 조제하고, 40℃, 45℃에서 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 중의 Ss의 생균수를 경시적으로 측정한 결과를 표 10에 나타냈다.

유지시간(시간)		 가열온도
40℃ 45℃
0 1.7E+09 3.0E+09
1 1.1E+07 <10
2 9.0E+04 <10
3 6.0E+03 <10
4 2.1E+01 <10
5 <10 <10
6 <10 <10
9 <10 <10
13 <10 <10
18 <10 <10
Ss생균수는 40℃, 45℃의 가열 온도에 경시적으로 감소하고, 40℃의 가열처리에서는 4시간에 1000 cfu/㎖이하, 5시간에 10 cfu/㎖이하로 되었다. 또한, 45℃의 가열처리에서는 1시간에 10 cfu/㎖이하로 되었다.
(5) 사균화 ＜당 조성의 검토＞
상기 (1)과 동일하게 하여 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5.3%)과 8, 20, 40% 유당 용액을 3:1로 혼합하고, 유당을 2%, 5%, 10% 포함한 Ss 농축액을 조제했다. 이들을 40℃에서 18시간 유지하고, 가열처리했다. 상기의 HPLC 조건으로, 가열처리 후의 당 조성을 분석했다. 그 결과를 표 11에 나타냈다. 또한, 가열처리 전의 역가를 측정하고, 잔존역가를 산출한 결과도 함께 표 11에 나타냈다. 또, 가열처리 전의 Ss생균수는 108 cfu/㎖이었으나, 가열처리 후에는 어느 쪽도 10 cfu/㎖이하로 감소되고, 사균화되어 있었다.
유당 농도
(w/v)		 당 조성(%) 역가 잔존율
(%)
3당 이상 2당 단당
2% 0.0 5.3 94.7 104.1
5% 0.2 12.4 87.4 105.6
10% 6.1 42.7 51.3 104.4
　유당을 포함한 Ss 농축액(생균 현탁액)은 가열처리 중에 유당이 β－갈락토시다아제의 작용을 받지만, 그 반응의 정도에 관계없이, 역가 안정효과는 유지되어 있음을 알았다. 또한, Ss 농축액 중에는 첨가한 유당이 효소 반응을 받아 생성한 단당(글루코오스, 갈락토오스)이나 갈락토올리고당이 존재하고 있어도 효소역가의 안정화에는 문제가 없는 것도 확인되고, 당질로서 단당이나 갈락토올리고당을 이용할 수 있음도 확인되었다.
실시예　5
건조품의 조제:
실시예 1과 동일하게 하여 얻어진 Ss 농축액(고형분 함량 5.3%)과 8, 20, 40% 유당 용액을 3:1로 혼합하고, 고형분 함량이 Ss: 4%, 유당: 2, 5, 10%의 건조 원액을 조제했다. 이들을 40℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 이 사균화 Ss 농축액을 분무 건조의 파일럿 장치(프로닥션마이나, GEA 프로세스 엔지니어링(주))을 이용하고, 입구온도: 120℃, 출구온도: 약 80℃, 아토마이저 회전수: 12,500rpm, 원액 처리량: 4kg/시간의 조건으로 건조하여 양호한 건조품을 얻었다. 이들의 역가 잔존율(건조 원액의 고형분당 역가에 대한 건조품의 고형분당 역가의 비율), 평균 입경, 잔류 수분을 측정했다. 그 결과를 표 12에 나타냈다.
제품 5 제품 6 제품 7

건조원액 중 농도(%)
 Ss 4 4 4
유당 2 5 10
총고형분 6 9 14
아토마이저 회전수(rpm) 12,500 12,500 12,500
액체 공급량(kg/hr) 4.0 4.0 4.0
건조실 입구온도(℃) 120 120 120
건조실 출구온도(℃) 80 80 80

건조품
 평균입경(㎛) 22.9 22.4 26.8
잔류수분(%) 7.4 7.5 5.6
역가잔존율(%) 94.0 96.0 97.2
　
건조 원액 중의 유당 농도 2~10%에 있어서, 건조 후의 역가 잔존율이 90% 이상인 미생물 균체 건조품을 얻을 수 있었다. 또, 이들의 건조품의 Ss생균수는 어느 쪽도 10 cfu/㎖이하이고, 가열처리 전후의 역가 잔존율은 어느 쪽도 90% 이상이었다.
실시예　6
올리고당 생성 시험:
(1) 건조품의 현탁액의 조제　
상기 실시예 5에서 얻어진 건조품 중, 제품 5와 제품 6을 각각 45U에 상당하는 양을 칭량하고, 이들을 각각 10㎖의 이온 교환수에 가하여 현탁했다.
(2) 올리고당 생성 반응
상기 (1)에서 조제한 건조품의 현탁액의 전량 또는 실시예 1과 같은 방법으로 얻어진 Ss 농축액 45U에 상당하는 양을, 각각 60% 유당 용액 800㎖에 첨가하고 혼합한 후, 65℃, pH 6에서 22시간 반응시켰다. 이때의 당 조성을 조사한 결과를 표 13에 나타냈다.
제품 5 제품 6 Ss의 농축액

당 조성(%)


 ≥ 4당 1.0 1.0 0.9
3당 30.3 30.3 29.6
2당 57.2 57.4 58.7
Glc 11.0 11.0 10.5
Gal 0.4 0.4 0.4
건조품의 현탁액과 Ss 농축액(생균 현탁액)과는 생성하는 당 조성에 큰 차이는 없고, 건조품이 올리고당의 제조에 이용할 수 있음을 알았다.
실시예　7
미생물의 사균화:
(1) 배양
실시예 1의 것(1)과 동일하게 하여 Ss 농축액(고형분 함량 5.2%)을 얻었다.
(2) 사균화 ＜유당의 농도와 가열 온도의 검토＞
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액과 유당 용액을 3:1로 혼합하고, 유당을 2~5% 포함한 Ss 농축액을 조제했다. 이들과 유당 무첨가의 Ss 농축액을 50℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 14에 나타냈다. 또, 가열처리 후의 Ss생균수는 모두 10 cfu/㎖이하였다.
유당 농도(w/v) 역가 잔존율
2% 85.2
3% 95.8
4% 98.2
5% 102.0
　
유당 농도 2~5%에서 역가 잔존율이 80%를 웃돌았다. 그리고 유당 농도 3% 이상으로 역가 잔존율이 90%를 웃도는 것을 알았다.
실시예　8
미생물의 사균화:
(1) 배양
실시예 1의 것(1)과 동일하게 하여 Ss 농축액(고형분 함량 5.4%)을 얻었다.
(2) 사균화 ＜유당과의 조합＞
　상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액에 대해서, 2N 수산화나트륨 용액으로 pH 4.5로 조정한 것, 유당을 1%가 되도록 첨가한 것(pH 미조정), 유당을 1%로 되도록 첨가한 후에 pH를 4.5에 조정한 것의 3종을 조제하고, 45℃에서 18시간 유지하고, 가열처리를 했다(시험 III). 같은 조작으로, 유당을 2% 첨가했을 경우도 실시했다(시험 IV). 각 Ss현탁액의 역가 잔존율을 표 15에 나타냈다. 또, 가열처리 후의 Ss생균수는 모두 10 cfu/㎖ 이하이었다.
pH만 조정 유당만 첨가 pH 조정+ 유당첨가
시험 III 97.2 100.2 102.9
시험 IV 98.3 102.0 103.1
시험 III, IV와도, pH 조정 또는 유당 첨가의 단독 처리 때의 역가 잔존율보다, pH 조정과 유당 첨가를 조합했을 때의 역가 잔존율 쪽이 높았다. pH 조정에 의한 역가 안정효과는 유당 존재하에서도 변함없이 발휘되고, 더욱이, 역가 잔존율이 높아지는 것을 알았다.
(3) 사균화 ＜유당과의 조합＞
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액에 대해서, 2N 수산화나트륨 용액으로 pH 4.5, 5.0, 5.5로 조정한 것, 유당을 2%가 되도록 첨가한 것(pH 미조정), 유당을 2%가 되도록 첨가한 후에 pH를 4.5, 5.0, 5.5로 조정한 것의 3종을 조제하고, 50℃에서 5시간 또는 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 각 Ss현탁액의 역가 잔존율을 표 16에 나타냈다. 또, 가열처리 후의 Ss생균수는 모두 10 cfu/㎖이하였다.

처리조건
 가열전
생균수
(cfu/㎖)
 50℃
유지 시간 5h 유지 시간 18h
역가 잔존율 (%) 생균수
(cfu/㎖)		 역가 잔존율 (%) 생균수
(cfu/㎖)
2% 유당 9.2E+10 100.1 <10 89.7 <10
pH 4.5 4.6E+10 88.0 <10 65.5 <10
pH 4.5+ 2% 유당 7.3E+10 102.9 <10 97.1 <10
pH 5.0 1.1E+11 91.8 <10 72.3 <10
pH 5.0+ 2% 유당 1.0E+11 103.6 <10 99.5 <10
pH 5.5 6.1E+09 94.1 <10 76.9 <10
pH 5.5+ 2% 유당 4.6E+10 100.8 <10 99.5 <10
어느 경우도, pH 조정 또는 유당 첨가의 단독 처리 때의 역가 잔존율보다, pH 조정과 유당 첨가를 조합했을 때의 역가 잔존율 쪽이 높았다. 또한, 가열 유지 시간 18시간의 경우, pH 4.5~5.5에 조정함으로써, 유당 2%에서도 역가 잔존율이 90% 이상으로 되었다.
실시예　9
미생물의 사균화:
(1) 배양
Ss를, 글루코오스 2%, 효모 엑기스 0.4%, 인산1칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.025%를 함유하는 배지 (pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양했다. 이 배양액을 원심분리(10,000 G, 30분간)하여 얻어진 습균체에, 멸균한 수돗물을 가하고, 충분히 현탁했다. 이것을 동일 조건에서 원심분리하여 얻어진 습균체에 유당 용액 및 멸균 수를 가하고, 유당을 2% 또는 5% 함유하고, 또한 균체 농도가 2.5%, 4.5% 및 6.5%(w/v)로 되는 Ss 농축액을 조제했다.
(2) 사균화 ＜유당의 농도와 가열 온도의 검토＞
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액을 45℃ 또는 50℃에서 5시간 또는 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 전후의 Ss의 생균수의 측정 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)을 도 1~4에 나타냈다.
어느 균체 농도에서도, 사균화 후의 역가 잔존율은 80% 이상이고, 역가 잔존율에 차이는 보이지 않았다. 특히, 유당 농도가 5%의 경우에는 어느 균체 농도에서도, 사균화 후의 역가 잔존율은 90% 이상이었다.
실시예　10
미생물의 사균화:
(1) 배양
Ss를, 글루코오스 4%, 효모 엑기스 0.8%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지 (pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양하여 Ss 배양액(고형분 함량 2.5%)을 얻었다.　
(2) 사균화
상기 (1)에서 얻어진 Ss 배양액의 pH를 2N 수산화나트륨 용액으로, 3.5~5.0으로 단계적으로 조정했다. 이들과 pH 미조정의 Ss 배양액을 40℃ 또는 45℃에서, 5시간 또는 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 후의 Ss의 생균수 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 17에 나타냈다.
배양 롯트 lot. 1 lot. 2 lot. 3
배양 종료액 역가(U/g) 2.29 2.52 2.37
미조정시 pH 3.10 3.17 3.53



사균화처리











 조건 역가
잔존율(%)		 생균수
(cfu/㎖)		 역가
잔존율(%)		 생균수
(cfu/㎖)		 역가
잔존율(%)		 생균수
(cfu/㎖)
pH 온도
(℃)		 시간
(h)

미조정
 40
 5 65.9 >1.0E+02 - - 95.2 4.3E+04
18 64.1 <10 - - 94.2 <10
45
 5 41.0 <10 - - 85.0 <10
18 31.3 <10 - - 77.9 <10

3.5

 40
 5 - - 86.3 4.6E+04 - -
18 - - 85.8 <10 - -
45
 5 - - 72.4 <10 - -
18 - - 64.0 <10 - -

4.0

 40
 5 94.2 >1.0E+02 95.0 4.6E+06 99.0 1.2E+06
18 96.2 <10 95.7 <10 98.7 7.0E+00
45
 5 92.9 <10 90.0 <10 98.5 <10
18 80.3 <10 79.3 <10 94.2 <10

4.5

 40
 5 95.4 >1.0E+02 96.5 9.9E+06 99.7 2.0E+06
18 98.1 <10 99.9 <10 102.6 <10
45
 5 96.9 <10 98.3 <10 99.8 <10
18 88.4 <10 91.9 <10 99.7 <10

5.0

 40
 5 95.4 >1.0E+02 99.5 1.5E+07 100.3 1.5E+07
18 98.1 <10 101.5 <10 99.0 1.7E+02
45
 5 99.9 <10 101.7 <10 100.7 <10
18 90.8 <10 94.9 <10 100.8 <10
어느 배양액에서도 사균화 처리 시의 pH가 높을수록 역가 잔존율이 향상했다. 또한, 어느 배양액에서도 역가 잔존율 80% 이상, Ss생균수 10 cfu/㎖ 이하를 만족하는 것은 pH를 4.0 이상으로 조정하고, 45℃에서 5시간 가열처리했을 경우이었다. 또한, pH 5.0으로 조정하고, 45℃에서 18시간 가열처리했을 경우도, 상기 역가 잔존율의 조건을 만족했다.
실시예　11
pH 조정제의 검토:
(1) 배양
　Ss를 글루코오스 4%, 효모 엑기스 0.8%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지 (pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양하여 Ss 배양액(고형분 함량 2.8%)을 얻었다.　
(2) pH 조정
상기 (1)에서 얻어진 Ss 배양액에 0.5N, 2N 또는 5N 수산화나트륨 용액 또는 수산화칼륨 용액, 10% 또는 20% 탄산나트륨 용액을 적하하여 pH를 5.0으로 조정했다. pH 조정 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 pH 조정 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)을 도 5에 나타냈다.
pH 조정제로서 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용했을 경우, pH 조정 직후에 역가가 7~8% 저하했다. 한편, pH 조정제로서 탄산나트륨을 사용했을 경우, 역가 저하는 거의 일어나지 않았다.
실시예　12
pH 조정제의 검토:
(1) 배양
Ss를 글루코오스 5%, 효모 엑기스 1%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지 (pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양하여 Ss 배양액(고형분 함량 2.5%)을 얻었다.
(2) 사균화
상기 (1)에서 얻어진 Ss 배양액의 pH를 2N 수산화나트륨 또는 20% 탄산나트륨 용액으로, 4.0~5.0으로 단계적으로 조정했다. 이들을 40℃ 또는 45℃에서, 5시간 또는 18시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 후의 Ss의 생균수 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)을 표 18에 나타냈다.
사균화 시 pH 조정제 2N NaOH 20% Na2CO3

사균화처리






 조건 역가 잔존율(%) 생균수
(cfu/㎖)		 역가 잔존율
(%)		 생균수
(cfu/㎖)
pH 온도(℃) 시간(h)

4.0

 40 5 99.7 6.7E+06 99.7 4.1E+06
18 100.9 <10 101.2 <10
45
 5 94,7 <10 95.9 <10
18 86.5 <10 87.1 <10

4.5

 40
 5 99.7 9.3E+09 99.6 5.8E+06
18 102.4 >1.0E+02 101.7 >1.0E+02
45
 5 100.4 <10 99.8 <10
18 94.6 <10 93.5 <10

5.0

 40
 5 101.6 9.2E+06 103.7 7.8E+06
18 103.1 >1.0E+02 100.0 >1.0E+02
45
 5 104.2 <10 102.1 <10
18 98.9 <10 97.5 <10
　
사균화 처리 전후에 있어서의 역가 잔존율 및 Ss생균수에 대해서 pH 조정제에 의한 차이는 보이지 않았다.
실시예　13
건조품의 조제:
(1) Ss 농축액의 조제
Ss를 글루코오스 4%, 효모 엑기스 0.8%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지 (pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양했다. 이 배양액을 원심분리(10,000 G, 30분간)하여 균체 농축액을 회수했다. 이것에 멸균한 수돗물을 가하고, 충분히 현탁하고, 세정한 후에 동일 조건에서 원심분리하여 고형분이 5% 정도로 되도록 조정한 것을 Ss 농축액(고형분 함량 5.1%)으로 했다.
(2) Ss 배양액의 조제
Ss를 글루코오스 4%, 효모 엑기스 0.8%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지 (pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양하여 Ss 배양액을 얻었다.
(3) Ss 농축액의 사균화 (pH 조정)
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액의 pH를 20% 탄산나트륨 용액으로, 4.8±0.2로 조정했다. 이 Ss 농축액을 45℃에서 7시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 후의 Ss의 생균수 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 19에 나타냈다. 또한, 건조 직전에, 사균화 후의 Ss 농축액에 24% 유당 용액을 5:1로 혼합하고, 유당을 4% 함유하는 건조 원액을 조제했다.
(4) Ss 농축액의 사균화(유당 공존)
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액과 24% 유당 용액을 5:1로 혼합하고, 유당을 4% 함유하는 Ss 농축액을 조제했다. 이 Ss 농축액을 50℃에서 7시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 후의 Ss의 생균수 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 19에 나타냈다. 사균화 후의 Ss 농축액을 그대로 건조 원액으로 했다.
(5) Ss 농축액의 사균화(pH 조정·유당 공존의 병용)
상기 (1)에서 얻어진 Ss 농축액과 24% 유당 용액을 10:1로 혼합하고, 유당을 2.2% 함유하는 Ss 농축액을 조제했다. 다시 당해 Ss 농축액의 pH를 20% 탄산나트륨 용액으로, 4.8±0.2로 조정했다. 이 Ss 농축액을 50℃에서 7시간 유지하고, 가열처리했다. 가열처리 후의 Ss의 생균수 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 19에 나타냈다. 또한, 건조 직전에, 사균화 후의 Ss 농축액에 24% 유당 용액을 11:1로 혼합하여 유당을 4% 함유하는 건조 원액을 조제했다.
(6) Ss 배양액의 사균화(pH 조정)
상기 (2)에서 얻어진 Ss 배양액의 pH를 20% 탄산나트륨 용액으로, 4.8±0.2로 조정했다. 이 Ss 배양액을 45℃에서 7시간 유지하고, 가열처리를 했다. 가열처리 후의 Ss의 생균수 및 가열처리 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 가열처리 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)의 결과를 표 19에 나타냈다. 또한, 사균화 후의 Ss 배양액을 원심분리(16,000 G)하여 습균체를 회수했다. 이것에 멸균한 수돗물을 가하고, 충분히 현탁하여 고형분이 5% 정도가 되도록 조정하여 사균화된 Ss 농축액(고형분 함량 5.2%)을 얻었다. 건조 직전에, 이 사균화된 Ss 농축액에 24% 유당 용액을 5:1로 혼합하여 유당을 4% 함유하는 건조 원액을 조제했다.
(7) 분무 건조
상기 (3)~(6)에서 얻어진 건조 원액을 분무 건조의 파일럿 장치(프로닥션마이나, GEA 프로세스 엔지니어링(주))를 이용하고, 입구온도: 120℃, 출구온도: 80℃, 아토마이저 회전수: 15,000rpm, 원액 처리량: 약 4.5kg/시간의 조건으로 건조하여 양호한 건조품을 얻었다. 이들의 건조품의 역가 잔존율, 평균 입경, 잔류 수분을 측정했다. 그 결과를 표 19에 나타냈다.
Figure 112013080073141-pct00002
모든 사균화 조건에서, 역가 잔존율 90% 이상, 그리고, Ss 생균수 10 cfu/㎖ 미만의 양호한 건조품이 얻어졌다.
실시예　14
보존 시험:
실시예 2에서 조제한 건조품(제품 1~3) 및 실시예 5에서 조제한 건조품(제품 5~7)을 각각 5℃ 또는 25℃에서 360일 보존했다. 보존 전의 β－갈락토시다아제 역가에 대한 보존 후의 β－갈락토시다아제 역가의 비율(역가 잔존율)을 측정했다. 그 결과를 표 20에 나타냈다.

 실시예 2(pH 조정) 실시예 5(유당 첨가)
제품 1
(유당 2%)		 제품 2
(유당 5%)		 제품 3
(유당 10%)		 제품 5
(유당 2%)		 제품 6
(유당 5%)		 제품 7
(유당 10%)
역가잔존율
(%)		 5℃ 100.2 101.0 98.0 95.7 95.4 93.5
25℃ 93.3 95.4 95.7 87.3 90.2 92.8
5℃ 또는 25℃에서 360일 보존해도 역가 잔존율은 80% 이상인 것을 알았다.
실시예　15
미생물의 사균화:
Ss 대신 스포로보로마이세스·싱귤라리스　JCM　5356(ATCC　24193)을 이용하는 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 미생물의 사균화를 실시한바, 역가 잔존율 등에 대해서 거의 같은 결과가 얻어졌다. 예를 들면, pH 5.0, 45℃에서 가열처리했을 때에 역가 잔존율이 80% 이상이었다.
실시예　16
사균화 ＜당 조성의 검토＞:
Ss 대신 스포로보로마이세스·싱귤라리스　JCM　5356(ATCC　24193)을 이용하는 이외는 실시예 4와 동일하게 하여 미생물의 사균화를 실시한바, 역가 잔존율 등에 대해서 거의 같은 결과가 얻어졌다. 예를 들면, 유당 농도 5%, 45℃에서 가열처리했을 때에 역가 잔존율이 80% 이상이었다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명 방법에 의하면, 효소활성을 가지는 미생물 균체액의 효소역가를 유지한 채로 미생물을 사균화할 수가 있다. 그 때문에, 본 발명 방법으로 처리된 미생물 균체액은 취급이 간단하고, 또 보존 가능하기 때문에, 효소활성을 이용한 산업에 있어서 유리하게 이용할 수 있는 것이다.

Claims (44)

  1. β－갈락토시다아제 활성을 가지는 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 pH를 4.5~5.7로 조정하고, 이어서 이것을 44~48℃에서, 5시간 이상 가열 처리하는 것을 특징으로 하고, 가열 처리 후의 균체액의 β－갈락토시다아제의 역가가 가열 처리 전의 β－갈락토시다아제의 역가의 80% 이상인 스포로보로마이세스·싱귤라리스를 사균화하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, pH 조정 전에 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액에 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 당질 1종 이상을 첨가하거나, 또는 pH 조정 후, 가열 처리 전에 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액에 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 당질 1종 이상을 첨가하는 것인 스포로보로마이세스·싱귤라리스를 사균화하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,　당질을 0.2~30질량/체적%로 첨가하는 스포로보로마이세스·싱귤라리스를 사균화하는 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, pH 조정을 탄산염을 이용하여 행하는 것인 스포로보로마이세스·싱귤라리스를 사균화하는 방법.
  5. β－갈락토시다아제 활성을 가지는 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 pH를 4.5~5.7로 조정하고, 이어서 이것을 44~48℃에서, 5시간 이상 가열 처리하는 것을 특징으로 하는, 가열 처리 후의 균체액의 β－갈락토시다아제 역가가 가열 처리 전의 β－갈락토시다아제 역가의 80% 이상인 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서, pH 조정 전에 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액에 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 당질 1종 이상을 첨가하거나, 또는 pH 조정 후, 가열 처리 전에 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액에 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 당질 1종 이상을 첨가하는 것인 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 제조방법.
  7. 청구항 6에 있어서,　당질을 0.2~30 질량/체적%로 첨가하는 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 제조방법.
  8. 청구항 5 또는 6에 있어서, pH 조정을 탄산염을 이용하여 행하는 것인 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 제조방법.
  9. 청구항 5 기재의 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 제조방법에 의해 얻어진 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액을 건조함을 특징으로 하는 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체 건조분말의 제조방법.
  10. 청구항 5 기재의 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액의 제조방법에 의해 얻어진 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액을 함유시킨 것을 특징으로 하는 효소 조성물의 제조방법.
  11. 청구항 9 기재의 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체 건조분말의 제조방법에 의해 얻어진 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체 건조 분말을 함유시킨 것을 특징으로 하는 효소 조성물의 제조방법.
  12. β－갈락토시다아제 활성을 가지는 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액에 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 당질 1종 이상을 첨가하고, 이어서 이것을 40~50℃에서, 4~20시간 가열 처리하는 특징으로 하는 균체액의, 가열 처리 후의 β－갈락토시다아제의 역가가 가열 처리 전의 β－갈락토시다아제의 역가의 80% 이상인 스포로보로마이세스·싱귤라리스의 사균화하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,　전기 당질을 0.2~30 질량/체적%로 첨가하는 스포로보로마이세스·싱귤라리스를 사균화하는 방법.
  14. β－갈락토시다아제 활성을 가지는 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액에 유당, 글루코오스, 말토오스 및 갈락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 당질 1종 이상을 첨가하고, 이어서 이것을 40~50℃에서, 4~20시간 가열 처리함으로써 얻어지는, 가열 처리 후의 β－갈락토시다아제의 역가가 가열 처리 전의 β－갈락토시다아제의 역가의 80% 이상인 것을 특징으로 하는 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액.
  15. 청구항 14에 있어서,　전기 당질을 0.2~30 질량/체적%로 첨가하는 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액.
  16. 청구항 14 기재의 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액을 건조하여 얻어진 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체 건조분말.
  17. 청구항 14 기재의 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체액을 함유하는 효소 조성물.
  18. 청구항 16 기재의 사균화 스포로보로마이세스·싱귤라리스 균체 건조 분말을 함유하는 효소 조성물.




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