KR101920899B1

KR101920899B1 - 미생물 균체 건조분말의 제조방법

Info

Publication number: KR101920899B1
Application number: KR1020137022452A
Authority: KR
Inventors: 마사카즈 이케다; 히로시 이시카와; 키사쿠 시무라; 유키 후쿠다; 마사히코 이토
Original assignee: 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2012-04-12
Publication date: 2019-02-13
Also published as: AU2012243770B2; JPWO2012141244A1; KR20140005999A; US10465160B2; CN103403141A; EP2698428B1; AU2012243770A1; US20140038269A1; JP5997692B2; EP2698428A1; EP2698428A4; WO2012141244A1; CN103403141B

Abstract

건조 상태이면서, 미생물이 가지는 효소활성을 유지할 수 있는 수단을 개발하는 것을 목적으로 하고, 효소활성을 가지는 미생물 균체액에 당질을 첨가하고, 이어서 이것을 건조하는 것을 특징으로 하는 효소역가가 유지된 미생물 균체 건조분말의 제조방법 및 이것에 의해 얻어지는 미생물 균체 건조분말을 제공한다.

Description

미생물 균체 건조분말의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING DRY MICROBIAL CELL POWDER}

본 발명은 미생물 균체 건조분말의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세히는 미생물이 가지고 있는 효소활성을 미생물이 생균인지 사균인지를 불문하고 건조 상태로 장기간 안정하게 유지할 수 있는 미생물 균체 건조분말 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

미생물에는 유용한 효소활성을 가지는 것이 많이 존재하고, 당질, 아미노산, 인지질 등의 기능성 식품 소재의 제조에 널리 이용되어 있다. 그 중에서도 당질 소재, 특히 올리고당의 제조에 이용할 수 있는 미생물은 많이 알려져 있으며, 예를 들면, 스포로보로마이세스·싱귤라리스(Sporobolomyces　singularis)에 속하는 효모균이 갖는 β-갈락토시다아제 활성을 이용하여 갈락토올리고당을 제조하는 것이 보고되어 있고(특허문헌 1), 또한, 스포로보로마이세스·싱귤라리스의β-갈락토시다아제 활성을 높인 변이 미생물을 만들어내는 것도 보고되어 있다(특허문헌 2).

상기 스포로보로마이세스·싱귤라리스가 가지는 β-갈락토시다아제는 몇 개인가의 미생물이 산생하는 효소와 동일하도록 효소가 미생물의 세포벽에 강고하게 결합하여 있기 때문에, 공업적으로 분리, 정제하는 것은 기술적으로도, 가격적으로도 곤란하다. 그 때문에, 스포로보로마이세스·싱귤라리스가 가지는 β-갈락토시다아제를 공업적으로 이용하는 경우는 희박한 미생물 균체액으로서 공급되는 것으로 되나, 그의 이용 형태에 기인하는 문제가 있었다.

즉, 균체에 대해서 수배의 물, 완충액 등을 함유하는 형태이기 때문에, 보관이나 이용처까지의 유통에 비용이 많이 드는 것, 또한, 액상품이기 때문에 미생물 오염에 대한 관리가 어렵고, 장기 보존에는 적합하지 않은 것, 게다가 미생물 오염의 위험성을 낮추기 위해서, 수요에 맞추어 생산할 필요가 있는 것 등의 문제가 있었다.

특히, 스포로보로마이세스·싱귤라리스가 가지는 β-갈락토시다아제를 이용하여 갈락토올리고당을 공업적으로, 그리고, 값싸게 생산하려고 하는 경우에는 상기 문제의 해결은 매우 중요하고, 건조 상태이면서, 미생물이 가지는 효소활성을 유지할 수 있는 수단의 개발이 요망되고 있었다.

특허문헌 1: 일본특허공고 평5-58714호 공보 특허문헌 2: 일본특허 제 4071037호 공보 특허문헌 3: 일본특허공개 평10-57031호 공보 특허문헌 4: 일본특허공개 2002-17337호 공보

따라서, 본 발명은 미생물이 가지고 있는 효소활성을 건조 상태로 장기간 안정하게 유지할 수 있는 미생물 균체 건조분말의 제조방법을 제공하는 것을 그 과제로 하는 것이다.

본 발명자들은 이러한 문제를 해결하기 위하여 예의 연구한 바, 건조 미생물 균체와 당질의 공존 상태에서는, 그의 건조 미생물이 생균인지, 사균인지를 불문하고, 미생물이 가지는 효소활성이 장기간 유지할 수 있는 것을 알았다.

또한, 건조 균체분말을 분무건조법에 의해 조제하는 경우는 미생물 균체액에 미리 당질을 첨가하고, 분무건조를 행함으로써 건조 중의 효소역가의 저하도 거의 없는 것도 발견했다.

그리고, 이들 성질을 이용하면, 수요에 제약되지 않고, 미생물의 배양이 가능하고, 게다가 유통 비용도 크게 낮출 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 효소활성을 가지는 미생물 균체액에 당질을 첨가하고, 이어서 이것을 건조하는 것을 특징으로 하는 효소역가가 유지된 미생물 균체 건조분말의 제조방법이다.

또한, 본 발명은 효소활성을 가지는 미생물 균체와 당질을 함유하는 장기 보존 가능한 미생물 균체 건조분말이다.

본 발명 방법에 의하면, 1년 이상이라고 하는 장기간 보존해도 미생물이 가지는 효소활성이 거의 저하하지 않는 미생물 균체분말을 얻을 수 있기 때문에, 유통, 생산의 양면으로부터 경제성이 매우 높은 것이다. 또한, 본 발명 방법에서는 미생물로서 사균을 이용했을 경우에도, 그의 효소역가를 유지할 수 있기 때문에, 생균을 이용했을 경우에 일어나는 미생물이 산생하는 대사물 등에 의한 품질의 저하를 회피할 수가 있는 것이다. 본 발명 방법에 의해 얻어지는 미생물 균체 건조분말은 올리고당 생성 반응에 있어서, 실용상 문제없이 사용할 수 있는 것이다.

도 1은 분무 건조품에 대해서, 1년간 보존시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 동결 건조품에 대해서, 1년간 보존시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 분무 건조품에 대해서, 분무건조 후의 역가 잔존율을 나타내는 도면이다.

본 발명 방법에 의해, 미생물 균체 건조분말이 얻어지는 미생물로서는 세균, 효모, 곰팡이 등의 미생물로, 효소를 세포벽에 결합하고 있든지, 또는 균체 내에 생산하는 것이면 어느 것이든 좋고, 더욱이 각종 처리를 거친 후의 미생물이라도 좋다. 예를 들면, 세균으로서는 스트렙토콕쿠스·서모필루스, 락토바실루스·불가리쿠스, 스트렙토콕쿠스·락티스, 락토바실루스·살리바리우스, 락토바실루스·라이히만니, 락토바실루스·헬베티쿠스, 바실루스·브레비스, 바실루스·스테아로서모필루스, 비피도박테리움·비피담, 비피도박테리움·브레이베, 비피도박테리움·롱검, 비피도박테리움·아돌레스센티스를 들 수 있다. 또한, 효소로서는 특히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 당질 분해효소라면, 아미라제, 슈크라제, α- 및 β-갈락토시다아제, 글루코오스이소메라제, α- 및 β-글루코시다제, β-프락토플라노시다제, α- 및 β-만노시다제, 크실라나제 등을 들 수 있다. 이들의 미생물 중에서도 β-갈락토시다아제를 산생하는 효모가 바람직하다.

상기 미생물 중, β-갈락토시다아제를 산생하는 효모로서는 스포로보로마이세스속, 크리베로마이세스속, 리포마이세스속, 칸디다속, 클립토콕쿠스속, 스테리그마토마이세스속, 블레라속, 벤싱토니아속, 발리스트스포로마이세스속, 페로마이세스속, 필로바시디움속, 시로바시디움속, 틸레티옵시스속, 이타소닐리아속, 티레티아속, 사카로마이세스속, 쉬조사카로마이세스속, 한세눌라속, 로도토룰라속, 데바료마이세스속, 피키아속, 돌루롭시스속 등의 효모를 들 수 있으며, 특히 스포로보로마이세스속, 스테리그마토마이세스속, 크리베로마이세스속, 클립토콕쿠스속, 로도토룰라속, 시로바시디움속, 리포마이세스속이 바람직하고, 스포로보로마이세스속, 클립토콕쿠스속, 로도토룰라속 또는 시로바시디움속에 속하는 미생물의 어느 하나가 보다 바람직하고, 스포로보로마이세스·싱귤라리스, 스테리그마토마이세스·엘비아에, 클립토콕쿠스·로렌티, 로도토룰라·락토자, 로드톨루라·미누타, 시로바시디움·매그넘, 리포마이세스·리포파가 특히 바람직하고, 한층 더 스포로보로마이세스·싱귤라리스, 클립토콕쿠스·로렌티, 로도토룰라·락토오스, 시로바시디움·매그넘, 로도토룰라·미누타가 보다 바람직하다.

한층 더 바람직하게 이용되는 효모의 예로서는 스포로보로마이세스·싱귤라리스를 들 수 있으며, 그 예의 하나인, 스포로보로마이세스·싱귤라리스　JCM　5356은 이화학연구소 바이오리소스센터((우)305-0074 이바라키현 츠쿠바시 코우야다이3-1-1)로부터 유상으로 입수하는 것이 가능하다.

또한, 다른 예로서는 특허문헌 2에 기재의 제조방법에 의해, β-갈락토시다아제 고산생(高産生) 변이 미생물로서 얻은 효모를 들 수가 있다. 이 중, 구체적으로, 친주로서 스포로보로마이세스·싱귤라리스　JCM　5356을 이용하여 상기 특허문헌의 공정(a)~(c)에 의해 얻어진 효모의 예로서는 스포로보로마이세스·싱귤라리스 ISK-#4D4, 동#5A5, 동##2B6를 들 수 있으며, 이것은 2002년 4월 10일자로, 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터((우)305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1 중앙 제6)에 각각 FERM　P-18818, FERM　P-18819 및 FERM　P-18817으로서 기탁되어 있다.

본 발명 방법의 실시에 있어서는 우선, 미생물을 통상의 방법에 따라 배양하고, 이어서, 예를 들면, 데 라발형 연속 원심기(De Laval continuous centrifuge)나 막농축 장치 등을 이용하여 집균, 세정하여 미생물 균체액을 조제한다.

이어서, 이 미생물 균체액에, 통상의 방법에 따라 안정화제로서 당질을 첨가하고, 건조하면 좋다. 보다 구체적으로는 분무건조를 이용하는 경우에는 미생물을 현탁한 미생물 균체액 중에, 필요량의 당질을 첨가하고, 그 상태로 분무건조함으로써, 목적으로 하는 미생물 균체 건조분말을 얻을 수 있다. 미생물 균체액 중의 균체량은 특히 제한되지 않지만 1 내지 10 질량/체적%(이하, 단순히 "%"로 나타낸다)가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 2 내지 6%이다. 또한, 이용되는 당질은 특히 제한되지 않고, 단당, 2당, 3당 이상의 올리고당, 다당을 이용할 수 있으며, 단당으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스, 만노오스, 2당으로서는 유당, 유당 이성체, 말토오스, 슈크로오스, 트레할로오스, 3당 이상의 올리고당으로서는 갈락토올리고당, 말토올리고당, 프락토올리고당 등의 각종 올리고당, 다당으로서는 덱스트린, 전분을 예시할 수가 있다. 이것들 중에서도, 효소역가의 안정화 효과, 건조의 용이함이나 비용의 점으로부터, 유당, 말토오스 및 덱스트린으로부터 되는 군으로부터 선택되는 1종 이상이 바람직하고, 특히 유당 및/또는 말토오스를 이용하는 것이 바람직하고, 유당을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

이 때, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질의 양은 특히 제한되지 않지만, 효소역가의 안정화 효과의 점에서, 미생물 균체액에 대해서 0.1% 이상으로 되는 양이 바람직하고, 더 바람직하기로는 0.5% 이상으로 되는 양, 보다 더 바람직하기로는 1% 이상으로 되는 양이다. 한편, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질의 양이 너무 많으면 미생물 균체 건조분말의 단위 중량당 효소역가가 떨어져 버리기 때문에, 당질의 양은 30% 이하가 바람직하고, 더 바람직하기로는 15% 이하로 되는 양, 보다 더 바람직하기로는 10% 이하로 되는 양, 한층 더 바람직하기로는 5% 이하로 되는 양, 더더욱 한층 더 바람직하기로는 3% 이하로 되는 양이다. 이상의 것으로부터, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질의 양은 미생물 균체액에 대해서 0.1 내지 30%로 되는 양이 바람직하고, 더 바람직하기로는 0.5 내지 15%로 되는 양, 보다 더 바람직하기로는 0.5% 내지 10%로 되는 양, 한층 더욱더 바람직하기로는 1% 내지 10%로 되는 양, 한층 더 보다 바람직하기로는 1% 내지 5%로 되는 양, 보다 바람직하기로는 1% 내지 3%로 되는 양이다.

또, 당질이 그 효소의 기질로 될 수 있는 경우(예를 들면, β-갈락토시다아제를 산생하는 미생물 균체액에 안정화제로서 유당을 첨가했을 경우), 당질 첨가로부터 분무 완료까지 일부 또는 대부분의 당질이 반응을 받는 경우도 있지만, 반응의 정도(분해도나 중합도)에 관계없이 당질의 효과는 발휘되므로, 특히 문제로 되지는 않는다. 예를 들면, 당질 첨가 후, 5℃~40℃에서, 1시간~40시간 정도 반응시켜도, 효소역가의 안정화라고 하는 점으로부터는 전혀 문제가 없다.

또한, 당질이 그 효소의 기질로 될 수 있는 경우는 첨가한 당질이 효소 반응을 받기 때문에, 미생물 균체 건조분말 중에는 첨가한 당질에 첨가하여, 그것과는 다른 당질이 포함되는 경우가 있지만, 효소역가의 안정화라고 하는 점으로부터는 전혀 문제가 없다. 미생물 균체 건조분말 중에 포함되는 당질로서는 단당, 2당, 3당이상의 올리고당, 다당을 들 수 있으며, 단당으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프락토오스, 만노오스, 2당으로서는 유당, 유당 이성체, 말토오스, 슈크로오스, 트레할로오스, 3당이상의 올리고당으로서는 갈락토올리고당, 프락토올리고당 등의 각종 올리고당, 다당으로서는 덱스트린, 전분을 예시할 수 있다. 또한, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당을 이용했을 경우에 미생물 균체 건조분말 중에 포함되는 당질로서는 글루코오스, 갈락토오스, 유당, 유당 이성체, 갈락토올리고당을 들 수 있으며, 말토오스를 이용했을 경우에 미생물 균체 건조분말 중에 포함되는 당질로서는 글루코오스, 말토오스, 말토올리고당을 들 수 있어 덱스트린을 이용했을 경우에 미생물 균체 건조분말 중에 포함되는 당질로서는 글루코오스, 말토오스, 말토올리고당, 덱스트린을 들 수가 있고, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당, 말토오스 및 덱스트린으로부터 되는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 이용하는 것이 바람직한 것으로부터, 미생물 균체 건조분말 중에는 글루코오스, 갈락토오스, 유당, 유당 이성체, 갈락토올리고당, 말토오스, 말토올리고당, 덱스트린으로부터 되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당질이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 더욱이 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당 및/또는 말토오스를 이용하는 것이 보다 바람직한 것으로부터, 미생물 균체 건조분말 중에는 글루코오스, 갈락토오스, 유당, 유당 이성체, 갈락토올리고당, 말토오스, 말토올리고당으로부터 되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당질이 포함되어 있는 것이 보다 바람직하다. 또한, 미생물 균체액 중에 첨가하는 당질로서 유당을 이용하는 것이 보다 바람직한 것으로부터, 글루코오스, 갈락토오스, 유당, 유당 이성체, 갈락토올리고당으로부터 되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당질이 포함되어 있는 것이 보다 바람직하다.

또한, 분무건조의 조건으로서는 건조실의 입구 및 출구온도는 효소가 현저히 실활하지 않는 범위라면 좋고, 또한, 아토마이저 회전수, 원액 피드량 등은 그 조건 나름으로 약간 제품으로서의 특성이 다른 미생물 균체 건조분말이 얻어지나, 최종적인 효소역가에는 거의 영향은 없기 때문에, 나머지 유의할 필요는 없다. 구체적으로는 건조실의 입구온도는 70℃~200℃, 바람직하기로는 110℃~180℃, 출구온도는 50℃~120℃, 바람직하기로는 70℃~90℃을 예시할 수 있다. 또한, 아토마이저 회전수는 10,000~30,000rpm, 원액 피드량은 0.2~200kg/시간을 예시할 수 있다. 이것들의 분무건조는 아토마이저 이외에 이류체(二流體) 노즐 등의 분무 방식을 이용하여 행할 수 있다. 또, 분무건조법에 의하면, 이 건조 공정에서 미생물이 거의 사멸하여 생균수가 적은 미생물 균체 건조분말이 얻어지므로 바람직하다.

한편, 동결건조법을 이용하는 경우에는 통상의 방법에 의해 미생물 균체액 중에 필요량의 당질을 첨가하고, 그 후 동결건조하면 좋다. 이 경우의 당질의 첨가량도, 미생물 균체액에 대해서 0.1 내지 30%로 되는 양이 바람직하고, 더 바람직하기로는 0.5 내지 15%로 되는 양, 보다 바람직하기로는 0.5% 내지 10%로 되는 양, 한층 더 바람직하기로는 1% 내지 10%로 되는 양, 한층 더 보다 바람직하기로는 1% 내지 5%로 되는 양, 보다 바람직하기로는 1% 내지 3%로 되는 양이다.

상기와 같이 하여 얻어지는 미생물 균체 건조분말은 이 미생물이 가지고 있는 효소활성을, 건조상태로 장기간 안정하게 유지할 수 있는 것이다. 이 미생물은 생균이어도, 사균이어도 좋지만, 미생물이 산생하는 대사물 등에 의한 품질의 저하를 고려하면 사균인 것이 바람직하다.

상기와 같이 얻어지는 미생물 균체 건조분말은 건조 미생물 균체에 대해, 0.01 내지 30배량의 당질을 포함하는 것이고, 바람직하기로는 0.05 내지 15배량이고, 더 바람직하기로는 0.05 내지 10배량이고, 보다 바람직하기로는 0.1 내지 10배량이고, 한층 더 바람직하기로는 0.1 내지 5배량이고, 한층 더 보다 바람직하기로는 0.1 내지 3배량이다. 또한, 이것에 포함되는 수분량은 특히 규정되지 않지만, 10 질량% 이하인 것이 바람직하다. 그리고, 건조 후의 효소역가는 건조 전의 효소역가의 70% 이상인 것이 바람직하고, 건조 방법이 분무건조의 경우는 상기한 방법 밖에는 효소역가의 저하 억제는 달성할 수 없다. 또, 동결건조의 경우는 분무건조와 달리, 건조에 의해 효소역가는 저하하지 않기 때문에, 미생물만을 동결건조 해 분말로 한 후, 이것에 분말상의 당질을 첨가해도 좋다.

또한, 본 발명에서 얻어지는 미생물 균체 건조분말은 상온(25℃)으로 보존해도, 1년 이상에 걸쳐 건조 직후의 미생물이 가지고 있던 효소역가를 유지한다고 하는 특유의 효과를 가지는 것이다. 즉, 건조 직후의 효소역가의 50% 이상, 더욱이 80~90% 이상이라고 하는 높은 효소역가를 장기간 유지할 수 있는 것이다.

종래부터, 미생물의 생존성을 높이기 위해, 부형제로서 유당 등을 사용하는 것은 알려져 있지만(특허문헌 3, 4), 본 발명 방법은 이러한 미생물의 생존성을 높여 유지하는 등의 발상은 전혀 없고, 다른 기술 사상에 근거하는 것이다. 본 발명에 대해서는 오히려, 미생물 자체는 사멸하고, 미생물이 가지고 있던 효소활성만이 보존되는 것이 바람직하기 때문이다.

[실시예]

다음에 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 하등 제약되는 것은 아니다. 또, 이하의 실시예에서, β-갈락토시다아제 역가, 잔류 수분량/고형분 함량, 입도 분포 및 스포로보로마이세스·싱귤라리스의 생균수는 다음 방법으로 측정했다.

(1)β-갈락토시다아제 역가의 측정법

　(a) 검액의 조제

피험시료가 농축액인 경우는 그의 약 2.5g를, 또한, 피험시료가 건조품의 경우는 그 150~350mg 정도를 50㎖용의 원심관에 정확히 칭량하고, 50mM 인산나트륨-시트르산 완충액(pH 4.0)(이하, "완충액"이라고 한다)에 현탁한 후에, 원심분리(20000 G, 15분간)하고, 세정하여 당질을 제거했다. 이 세정 조작을 3회 행한 후에, 50㎖용 메스플라스크로 옮기고, 완충액으로 용량을 맞추고, 충분히 현탁시켜 검액으로 했다.

(b) 측　정

o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(o-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside; ONPG) 0.3766g를 100㎖용 메스플라스크로 칭량하고, 완충액에 용해하여 용량을 맞추어 12.5mM의 용액을 조제했다. 시험관에, 이 ONPG 용액을 0.8㎖ 넣고, 30℃의 항온 수조 중에서 5분간 유지했다. 이것에 검액을 0.2㎖ 첨가하여 놓고, 혼합한 후, 30℃에서 10분간 반응시킨 후에 0.25M 탄산나트륨 용액을 4㎖ 첨가하여 반응을 정지했다(시험계). 별도로, 시험관에 ONPG 용액 0.8㎖와 0.25M 탄산나트륨 용액 4㎖를 넣고, 다시 검액을 0.2㎖ 가하고, 혼합했다(맹검계). 시험계 및 맹검계의 각각을, 원심분리(2000 G, 10분간, 15~20℃)에 걸고, 얻어진 상청에 대해 파장 420nm에서 흡광도를 측정하고, 다음 식에 의해 단위수를 산출했다. 또, 상기 반응 조건에서, 1분간에 1μmol의 o-니트로페놀(o-nitrophenol; ONP)을 유리하는데 필요로 하는 효소량을 1U로 했다.

A₁: 시험액의 흡광도

A₂: 맹검의 흡광도

B: 희석배액

* U/g 또는 U/㎖

또한, 건조고형분당 β-갈락토시다아제 역가를 산출하는 경우에는 후술하는 방법으로 구한 고형분 함량을 이용하여 산출했다.

(2) 잔류 수분량/고형분 함량

분무건조에서의 미생물 균체 건조분말(이하, "건조품"이라고 한다)의 잔류 수분은 (주)켓토카가쿠겐큐쇼(株ケット科學硏究所)제의 적외선수분계를 이용하여 105℃, 15분간의 조건에서 측정했다. 또한, 동결 건조품의 고형분 함량 및 고형분 당의β-갈락토시다아제 역가를 산출할 때에 이용하는 건조 원액과 건조품의 고형분 함량은 105℃에서 16시간 처리했을 때의 건조물 중량으로부터 산출했다.

(3) 입도 분포

분무 건조품의 입도 분포는 심파테크사(Sympatec, Inc)제의 레이저 회절식 입도 분포 측정 장치(HELOS ＆ RODOS 시스템)를 이용하여 건식으로 측정했다.

(4) 스포로보로마이세스·싱귤라리스 생균수

락토스 2.5%, 효모 엑기스 0.5%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%, 한천 1.5%가 되도록, 이것들을 물에 용해하고, 2N 염산으로 pH 5.0로 조정한 후, 오토클레이브 멸균(121℃, 10분간)하여 평판 플레이트(φ90mm)를 작성했다. 이것에, 생리 식염수로 용해, 희석한 샘플을 100㎕ 도말(塗抹)하고, 25℃에서 약 일주일간 배양한 후, 형성된 콜로니를 계측하여 스포로보로마이세스·싱귤라리스 생균수로 했다.

실시예　1

효모 균체 건조분말의 조제:

스포로보로마이세스·싱귤라리스(Sporobolomyces　singularis) YIT　10047 (ISK-##2B6, 이하, "Ss"라고 표기)을, 글루코오스 5%, 효모 엑기스 0.6%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지(pH 5)에서, 27℃, 4일간 호기적으로 배양했다. 이 배양액을 원심분리(10000G, 30분간)하여 얻어진 습균체에, 멸균한 수돗물을 가하고 충분히 현탁했다. 이것을 동일 조건으로 원심분리하고, 습균체를 소량의 수돗물에 현탁한 것을 Ss 농축액(고형분 4.9%)로 했다. Ss 농축액 20L에, 25% 유당 용액을 5L 가하고, 충분히 교반하여 건조 원액을 얻었다. 이 조작은 20℃이하에서 행했다. 이 건조 원액을 시료로서 이용하여 효모 분말을 동결건조법 및 분무건조법에 의해 조제했다. 건조 원액 중의 고형분 함량(계산치)은 Ss가 약 3.9%, 유당이 약 5%로 된다.

분무건조는 로터리 아토마이저를 장착한 파일럿 장치(프로닥션마이나, GEA 프로세스 엔지니어링(주))을 이용하여 각종 운전 조건에서 분무건조를 행했다. 이 운전 조건은 표 1에 나타냈다.

또, 동결건조는 동결건조기　RLE-206(共和眞空技術(주))을 이용하고, 선반 온도 25~30℃의 조건으로 행했다.

또, 분무건조 및 동결건조로 얻은 건조품은 각각, 지퍼가 달린 비닐 봉투에 넣어 밀폐하고, 5℃, 25℃의 항온실에서 약 1년간 보관하고, 정기적으로 일부를 빼내, β-갈락토시다아제 역가를 측정하여 보존시험을 행했다.

분무건조 후의 물성 시험:

분무건조하여 얻어진 건조품에 대해서, 그의 구체적인 건조 조건과 얻어진 건조품의 평가를 표 1에 나타냈다. SD-1~3은 로터리 아토마이저의 회전수를 내려 액적(液滴)을 크게 함으로써 건조품 입도의 변경을 시도했다. 또한, SD-4는 건조 온도를 5℃올려 피드량을 늘림으로써 생산 효율을 올리는 것을 시도했다. 분무건조의 조건과 얻어진 제품의 결과를 표 1에 나타낸다.

		SD-1	SD-2	SD-3	SD-4
아토마이저 회전수(rpm)		25000	18000	15000	18000
원액 피드량(kg/hr)		4.0	→	→	5.0
건조실 입구온도(℃)		115	→	→	120
건조실 출구온도(℃)		80	→	→	→
제품	상태	구형	→	→	→
	평균입경(㎛)	15	18	21	17
	잔류수분(%)	3.6	4.0	5.0	5.5
	역가 잔존율(%)	96.7	95.7	94.6	96.0

이 결과로부터 명백한 바와 같이, SD-1~3의 건조 후의 역가 잔존율(건조 원액의 고형분당 역가에 대한 건조품의 고형분당 역가의 비율)은 모두 95%정도로 높고, 실용화 가능한 수준으로 판단되었다. 건조 온도를 5℃ 올린 SD-4에서도 역가 잔존율에 큰 차이는 없었다.

Ss의 분무건조에 있어서, Ss 농축액을 그대로 건조하면 고형분당 β-갈락토시다아제 역가가 현저하게 떨어지므로, 건조에 있어서 유당을 첨가함으로써 효소역가를 높게 유지할 수 있는 것이 명백해졌다.

또한, SD-1~3은 아토마이저 회전수를 낮추는 것에 따라 평균 입경이 커지는 것이 확인되었다.

또, 데이터는 나타나지 않았지만, 이들 건조품을 이용하여 실험실 스케일로 올리고당 생성 반응을 행하고, 당조성의 경시변화, 종점까지의 소요시간 등은 건조처리 전의 Ss 농축액과 동등한 것이 확인되었다.

건조품의 보존시험:

분무 건조품과 동결 건조품에 대해서, 5℃, 25℃에서 약 1년간 보존시험을 행했다. 분무 건조품은 건조 온도가 다른 SD-2와 SD-4의 2 검체, 동결 건조품은 Ss 농축액[유당 없음: FD(-)]과 건조 원액[유당 5%FD(＋)]으로부터 조제한 2 검체로 했다. 각각의 검체에 대해서, 경일적(經日的)으로 샘플링하고, 역가 잔존율(건조 직후의 건조품의 고형분당 역가에 대한, 보존 후의 건조품의 고형분당 역가의 비율)을 산출했다. 분무 건조품에 대한 결과를 표 2, 도 1에, 동결 건조품에 대한 결과를 표 3, 도 2에 나타낸다.

표 2, 도 1의 결과로부터, 분무 건조품의 보존에서, SD-2와 SD-4의 안정성은 동등하고, 1년 후의 역가 잔존율은 5℃에서, 시험 개시시의 거의 100%, 25℃에서도 95% 정도를 유지하고 있었다. 이것으로부터, 분무 건조품의 역가 안정성은 매우 높은 것이 밝혀졌다. 또, 1년간 보존 후의 분무 건조품 4종의 올리고당 생성능은 보존전과 동등한 것이 확인되었다.

또한, 표 3, 도 2의 결과로부터, 동결 건조품의 보존에 있어서도, 안정화제(유당)의 유무는 역가 잔존율에 영향을 주고 있으며, 5℃, 25℃ 모두, 유당을 첨가한 FD(＋)의 역가 잔존율은 유당을 첨가하지 않는 FD(-)보다 높고, 1년간 보존 후의 역가 잔존율은 약 85~90%였다.

	SD-2(5℃)	SD-2(25℃)	SD-4(5℃)	SD-4(25℃)
19일 보존 후	105.2	97.2	104.2	96.8
40일 보존 후	100.3	-	95.9	-
96일 보존 후	108.0	102.2	107.0	102.7
150일 보존 후	98.7	101.5	98.5	100.4
196일 보존 후	98.3	99.6	96.3	96.6
375일 보존 후	99.6	93.3	101.3	95.3

	FD(-)(5℃)	FD(-)(25℃)	FD(+)(5℃)	FD(+)(25℃)
23일 보존후	103.2	95.6	96.9	88.6
43일 보존후	95.2	83.7	95.4	93.0
90일 보존후	92.9	75.8	-	-
183일 보존후	86.9	61.5	92.7	85.3
356일 보존후	80.4	47.2	89.4	84.3

실시예　2

유당 첨가량의 검토

효모 균체 건조분말의 조제

Ss 농축액(고형분 5.0%) 75㎖에, 각종 농도의 유당 용액 25㎖를 가하고, 유당을 0~15%함유하는 건조 원액을 100㎖씩 조제했다. 이것들을, 이류체 노즐식의 실험용 분무건조장치(SD-1000, 東京理科器械(주))를 이용하고, 입구온도: 120℃, 출구온도: 약 80℃, 원액 처리량: 4㎖/분의 조건으로 처리하고, 사이클론 부분에 부착한 부분도 포함하여 회수한 것을 건조품으로 했다.

역가의 측정

건조 원액, 건조품의 역가를 측정하고, 건조 원액의 고형분당 역가에 대한 건조품의 고형분당 역가의 비율(역가 잔존율)을 산출했다. 얻어진 결과를 표 4, 표 5, 도 3에 나타낸다.

	SD-5	SD-6	SD-7	SD-8	SD-9	SD-10
유당농도(%)	0	0.1	0.2	0.5	1	2
역가 잔존율(%)	34.4	42.7	49.1	72.1	77.5	83.2

	SD-11	SD-12	SD-13	SD-14
유당 농도(%)	3	5	10	15
역가 잔존율(%)	86.8	93.4	100.7	100.2

표 4, 표 5, 도 3의 결과로부터, 건조 공정 전체에 있어서의 역가 수율의 지표인 역가 잔존율은 유당 농도에 수반해 향상하고, 0.1% 이상의 농도에서 효과가 보이며, 0.5% 이상의 농도에서 분명한 효과가 보였다.

실시예　3

다른 안정화제의 검토:

(효모 균체 건조분말의 조제)

덱스트린(NSD#300, #500; 모두 サンエイ糖化(株)), 말토오스 및 유당에 대해서, 분무건조시의 효소역가 유지효과(안정화 효과)를 비교했다. Ss 농축액(고형분 5.0%) 75㎖에, 4, 20, 40%의 안정화제 용액 25㎖를 가하고, 안정화제를 1, 5, 10% 함유하는 건조 원액을 100㎖씩 조제했다. 이것들을, 이류체 노즐식의 실험용 분무건조장치(SD-1000, 東京理科器械(株))를 이용하여 입구온도: 120℃, 출구온도: 약 80℃, 원액 처리량: 4㎖/분의 조건으로 처리하고, 사이클론부에 부착한 부분도 포함하여 회수한 것을 건조품으로 했다.

(역가의 측정)

건조 원액과 건조품의 역가를 측정하고, 건조 원액의 고형분당 역가에 대한 건조품의 고형분당 역가의 비율(역가 잔존율)을 산출했다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.

		덱스트린 NSD #300	덱스트린 NSD #500	말토오스	유당
안정화제 농도	1%	50.4	44.6	61.3	77.5
	5%	65.9	70.5	91.4	93.4
	10%	65.4	53.4	90.5	100.7

역가 잔존율은 안정화제 무첨가(34.4%, 표 4)보다도, 안정화제가 공존하는 쪽이 높았다. 특히, 유당이나 말토오스 등의 2당류의 쪽이, 덱스트린보다도 역가 잔존율이 높고, 2당류 중에서도 유당이 역가 잔존율이 높고, 안정화제로서 우수한 것을 알았다.

실시예　4

당조성의 검토:

(효모 균체 건조분말의 조제)

Ss 농축액(고형분 5.3%) 7.8L에, 20% 유당 용액을 2.6L 가하고, 충분히 혼합한 것을 3개 준비하고, 10℃-1시간, 5℃-40시간, 40℃-18시간의 각각의 조건에서 유지하여 반응시켜, 당조성이 다른 건조 원액을 조제했다. 이것들을, 파일럿 장치(프로닥션마이나, GEA 프로세스 엔지니어링(주))을 이용하여, 입구온도: 120℃, 출구온도: 약 80℃, 아토마이저 회전수: 12500rpm, 원액 처리량: 4kg/시간의 조건에서 건조했다.

(당조성의 분석)

하기 HPLC 조건에서, 반응 후의 건조 원액 중의 당조성을 분석했다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.

＜HPLC 조건＞

컬럼: ShodexSUGAR　KS-802(昭和電工(株)))

용매: 순수

유속: 0.5㎖/분

온도: 80℃

검출기: 시차굴절계(示差屈折計)

(역가의 측정)

건조 원액과 건조품의 역가를 측정하고, 건조 원액의 고형분당 역가에 대한 건조품의 고형분당 역가의 비율(역가 잔존율)을 산출했다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.

반응조건	당조성(%)			역가 잔존율(%)
반응조건	3당 이상	2당	단당	역가 잔존율(%)
10℃-1시간	7.3	84.5	8.2	96.9
5℃-40시간	25.0	43.8	31.2	91.3
40℃-18시간	0.2	12.4	87.4	96.0

표 7의 결과로부터, 유당과 β―갈락토시다아제의 반응의 정도에 관계없이, 역가 안정효과가 발휘되고 있는 것을 알았다. 또한, 안정화제로서 단당(글루코오스, 갈락토오스)이나 갈락토올리고당을 이용할 수 있는 것도 확인되었다.

실시예　5

건조 온도의 검토:

(효모 균체 건조분말의 조제)

Ss 농축액(고형분 5.0%)에 5N 수산화나트륨 용액을 가하여 pH 4.5로 조정하고, 45℃에서 9시간 유지함으로써, Ss를 사균화했다. 이 액 8L에, 25% 유당 용액을 2L 가하고, 충분히 혼합한 것을 건조 원액으로서 건조실의 입구온도를 120℃, 150℃, 180℃로 하고, 이것에 대해서 출구온도가 80℃로 되도록 원액 공급량을 조정하여 분무건조했다.

(역가의 측정)

건조 원액과 건조품의 역가를 측정하여 건조 원액의 고형분 당 역가에 대한 건조품의 고형분 당 역가의 비율(역가 잔존율)을 산출했다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.

	120℃	150℃	180℃
역가 잔존율(%)	103.6	96.8	90.7
원액 공급량(kg/시간)	3.6	10.0	12.9

표 8의 결과로부터, 건조에서 입구온도를 올림으로써 원액 공급량을 증대시킬 수가 있고, 입구온도가 180℃에서는 120℃때의 약 3.5배로 할 수가 있었다. 더욱이 건조시의 입구온도를 180℃로 하여도 건조품의 역가는 90% 이상이 유지되고 있으며, 이 온도로 경제성 좋게 효모 균체 건조분말이 얻어지는 것을 알았다.

실시예　6

　　Ss 이외의 효모에 대한 검토:

　　　(효모 균체 건조분말의 조제)

클립토콕쿠스·로렌티(C.　laurentii　IFO 18803), 로도토룰라·락토자(R.　lactosa　JCM 1546), 시로바시디움·매그넘(S.　magnum　JCM 6876) 및 로도토룰라·미누타(R.　minuta　JCM8101)를 각각 단독에서, 유당 5%, 효모 엑기스 0.3%, 인산1칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%를 함유하는 배지(pH 5) 중, 26℃에서 호기적으로 배양했다. 이 배양액을 원심분리(10000 G, 30분간)하여 얻어진 습균체에, 멸균한 수돗물을 가하고, 충분히 현탁했다. 이것을 동일 조건으로 원심분리하고, 습균체를 소량의 수돗물에 현탁한 것을 균체 농축액(고형분 약 4%)으로 했다.

균체 농축액 75㎖에, 20%유당 용액을 25㎖ 가하고, 충분히 교반하여 건조 원액을 조제했다. 이 조작은 20℃이하에서 행했다. 이 건조 원액 이외에, 유당 용액 대신에 물을 이용하여 조제한 건조 원액의 각각 대하여, 분무건조법에 의해 효모 분말을 조제했다. 또, 건조 원액 중의 고형분 함량(계산치)은 균체가 약 3%, 유당이 약 5%가 되도록 조정했다.

분무건조는 토쿄리카기카이(東京理科器械)(주) 제의 이류체 노즐형의 분무건조장치(SD-1000)를 이용하여 건조실의 입구온도 120℃, 출구온도 70~90℃에서 행했다.

(역가의 측정)

각각의 효모의 건조 원액과 건조품의 역가를 측정하고, 건조 원액의 고형분 당 역가에 대한 건조품의 고형분 당 역가의 비율(역가 잔존율)을 산출했다. 또한, 유당을 첨가하지 않는 균체 농축액에 대해서도 동일하게 역가를 측정하여 역가 잔존율을 산출했다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.

유당 농도(w/v %)	C. lauentii (IFO 18803)	R. lactosa (JCM 1546)	S. magnum (JCM 6876)	R. minuta (JCM 8101)
0	61.5%	NT	63.9%	81.3%
5	77.1%	99.8%	74.0%	116.1%

　　NT: 시험미실시

로도토룰라·락토자(R.　lactosa) 이외의 3주의 분무건조 후의 역가 잔존율은 유당 미첨가시와 비교하여 유당 5%첨가에서 모두 높아졌다. 로도토룰라·락토자에 대해서는 유당 5% 첨가시에, 99.8%로 매우 높았다. 이들 결과로부터, 유당 첨가에 의해 발휘되는 분무건조 후의 β-gal 역가 저하 억제효과는 Ss에 특이적인 것이 아니고, 널리 효모에 대해서 적용 가능하다라고 하는 것을 나타냈다.

참고예

올리고당 생성 시험:

(분무 건조품의 현탁액의 조제)

상기 실시예 5에서 얻어진 건조품(입구온도 120℃)을 45 U에 상당하는 양을 칭량하고, 이것을 10㎖의 이온 교환수에 가하고, 현탁하여 현탁액을 얻었다.

(올리고당 생성 반응)

60% 유당 용액 800㎖에, 상기에서 조제한 건조품의 현탁액의 전량을 첨가하여 혼합하고, 65℃, pH 6에서 22시간 반응시켰다. 이 때의 당조성을 조사한 결과를 표 10에 나타낸다.

≥4당	3당	2당	Glc	Gal
1.0	30.0	58.0	10.7	0.3

표 10의 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 건조품(미생물 균체 건조분말)은 올리고당의 생성 반응에 있어서, 실용상 문제없이 사용할 수 있음을 나타냈다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명 방법에 의해 얻어지는 효모 균체 건조분말은 이 효모가 가지고 있는 효소활성을 건조 상태로 장기간 안정하게 유지할 수 있는 것이다. 즉, 실온에서 보존해도, 건조시의 효소역가를 지나치게 저하시키지 않고 보관, 유지할 수 있는 것이다.

따라서, 효모가 가지는 효소활성을 이용함에 있어서, 취급이 간단하고, 또 보존 가능하기 때문에, 수요에 맞추어 생산할 필요가 없기 때문에, 효소활성을 이용한 산업에서 유리하게 이용할 수 있는 것이다.

Claims

β-갈락토시다아제 활성을 가지는 스포로보로마이세스속, 클립토콕쿠스속, 로도토룰라속 또는 시로바시디움속에 속하는 미생물의 균체액에 유당을 미생물 균체액에 대해서 0.1 내지 30 질량/체적%가 되도록 첨가하고, 이어서 이것을 분무 건조하고, 건조 후의 β-갈락토시다아제 역가가 건조 전의 β-갈락토시다아제 역가의 70% 이상인 것을 특징으로 하는 미생물 균체 건조분말의 제조방법.
제1항에 있어서,　
β-갈락토시다아제 활성을 가지는 스포로보로마이세스속, 클립토콕쿠스속, 로도토룰라속 또는 시로바시디움속에 속하는 미생물의 균체액에 대한 유당의 첨가량이 1 내지 5 질량/체적%인 미생물 균체 건조분말의 제조방법.
β-갈락토시다아제 활성을 가지는 스포로보로마이세스속, 클립토콕쿠스속, 로도토룰라속 또는 시로바시디움속에 속하는 미생물의 분무 건조된 건조 미생물 균체와, 이 건조 미생물 균체액에 대해서 0.1 내지 5배량의 유당을 함유하는, 상온에서 1년간 보존 후의 β-갈락토시다아제 역가가 분무 건조 직후의 β-갈락토시다아제 역가의 80% 이상 보존되는 장기 보존 가능한 미생물 균체 건조분말.
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