JP2016042827A - ポリ塩化ビフェニル類分解用微生物触媒及びその組み合わせ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】芳香族化合物の分解反応に関わる一群の酵素を過剰発現させた微生物菌体に、賦形剤を添加し、噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒。
【選択図】図1
Description
しかしながら、これらのPCBs分解菌を別々に培養し、個々のポリ塩化ビフェニル異性体に対する分解特性を詳細に検討することにより、PCBs分解に最適な組み合わせの複数の微生物を配合した複合微生物製剤は知られていない。
[1]芳香族化合物の(酸化的)分解反応に関わる一群の酵素を過剰発現させた嫌気性ならびに好気性を示す全ての微生物菌体に、賦形剤を添加し、噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒。
[2]前記乾燥菌体が、核酸を転移し又は複製する能力を不活化した死細菌細胞からなる[1]に記載の微生物触媒。
[3]前記賦形剤が、乳糖、スキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス及びアラビアガムからなる群より選択される[1]又は[2]に記載の微生物触媒。
[4]前記酵素が、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを含む[1]〜[3]のいずれかに記載の微生物触媒。
[5]前記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが、ビフェニル−2,3−ジオキシゲナーゼ若しくはビフェニル−3,4−ジオキシゲナーゼ又はこれらの混合物を含む[1]〜[4]のいずれかに記載の微生物触媒。
[6]リン酸緩衝液に再懸濁した時に、生細胞と同様の細胞形態に分散しうる[1]〜[5]のいずれかに記載の微生物触媒。
[7]基質特異性の異なる複数の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼのそれぞれを過剰発現させた[1]〜[6]のいずれかに記載の複数の微生物触媒を組み合わせてなる、ポリ塩化ビフェニル類分解用組成物。
これにより、生物多様性の保全に影響を及ぼすと懸念される遺伝子組換え生物を含む細胞生物の利用が簡便となり、したがって、世界における有用微生物の開放系での利用範囲も大きく拡がるであろうことから、産業の活性化が期待できるものである。
本発明の微生物触媒に使用しうる芳香族化合物分解酵素は、芳香族化合物を含む汚染物質を分解しうる酵素であれば特に限定されるものではなく、多種多様な汚染物質を分解するものとして多くの動物又は微生物由来の酵素を用いることができる。これらの中でも、特に、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ、又はRieske non-heme iron oxygenaseと称される一群の酵素が好ましく、これらは多くの芳香族化合物分解経路での最初の反応であるシス型二水酸化反応を触媒する。トルエンやナフタレンに加えてベンゼン、クメン、フェナントレン、ピレン等の単環・多環の芳香族炭化水素に限らず、ダイオキシン、ジベンゾチオフェン、カルバゾール等のヘテロ環式芳香族化合物、PCB等のビフェニル環化合物等の種々の芳香族化合物の好気的代謝経路において、これらの酵素は初発酸化酵素として一連の分解反応の進行の有無を左右する重要な役割を果たしている。芳香環水酸化ジオキシゲナーゼは、基質を認識し酸化反応を行う酸化酵素(TO:terminal oxygenase)と、電子をNAD(P)HからTOに伝える電子伝達系から構成される多成分酵素である。電子伝達系は、NAD(P)Hから電子を受け取るレダクターゼ(Red)単独で構成される場合と、Redとフェレドキシン(Fdx)の二つで構成される場合がある。
本発明の微生物触媒を作製する上で、主要な原料となる、上記ビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル代謝経路で働く一連の酵素種を、自らの細胞内に強発現することができる微生物種について述べる。
培地は、K. Kimbara et. al. Agric. Biol. Chem., 52 (11), 2885-2891, 1988. を参考に、pHが6.8〜7.0までとなるように調整した合成培地が良く、さらにビフェニルを炭素源として0.05〜0.1%(w/v)まで加えたものが望ましい。さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良い。本培養に至る前に3段階の前培養を行うことが、細菌を効率良く増殖させる上で望ましい。手順は、培地量の10倍以上の容積の試験管などに、前に述べたビフェニルを0.05〜0.1%(w/v)まで加えた合成培地を2〜3mLまで入れ、15〜18%(w/w)までに調整したグリセロールへ菌体量としてOD660=0.1〜0.8までとなるように、−80℃以下で凍結保存した細菌株を、できるだけ速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を120rpm、温度を30〜35℃まで、OD660=0.4〜0.8まで培養し、次に培地量で5倍以上の容積のフラスコなどに入れた、同じくビフェニルを0.05〜0.1%(w/v)まで加えた合成培地27〜30mLに、その全量を投入し、振盪回転を120rpm、温度を30〜35℃まで、OD660=0.4〜0.8まで培養し、さらに培地量の5倍以上の容積のフラスコなどにビフェニルを0.05〜0.1%(w/v)まで加えた合成培地270〜300mLに、全量を投入し、振盪回転を120rpm、温度を30〜35℃まで、OD660=0.4〜0.8まで培養する。本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備し、その翼形状はタービン型で良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく合成培地2.7〜3Lまでに対し、ビフェニルを0.02〜0.05%(w/v)までとなるように加えて、そこへ、前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は400〜600rpmまでとし、空気の場合は4〜5L/分までとし、温度は30〜35℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を0.005〜0.01MPaまでとなるよう調節すると良い。細菌の生育と共に炭素源であるビフェニルが消費されるが、さらにビフェニルを0.02〜0.05%(w/v)までとなるよう、継続的に加えていくことが望ましく、さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良く、最終的に、より高塩素化されたPCBsの分解活性を獲得した細菌が得られる。培養中の培養液のpHは、細菌の最終収量に影響を与えるため、その範囲は7.0〜9.0までとするのが望ましく、pHの調整には、必要に応じて、アンモニウム塩を0.02%〜0.05%(w/v)までとなるように断続的に加えるのが良く、硫酸アンモニウムでも良い。また硫酸アンモニウムの添加は、培養中に窒素源も消費する場合において望ましい。最終の培養液のOD660=2.5〜3.0までで、湿重量が15〜20gまでの高活性なPCBs分解細菌が得られる。
培地は、Luria Broth(1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム)(以下、「LB培地」とする)、あるいはTerrific Brothを改変したイースト・エキストラクト2.4%とトリプトン1.2%を主成分とし(以下、「TB改変培地」とする)、リン酸水素二ナトリウム塩とリン酸二水素ナトリウム塩それぞれ70mMを、6対4の比率で配合した緩衝成分を含み、オートクレーブによる滅菌の後にpH6.8〜7.0で調整したものが望ましい。
本培養に至る前に、二段階の前培養を行う事が望ましく、培地量の10倍以上の容積の試験管などに、上記のいずれかの培地を2〜3mLまで、薬剤耐性遺伝子を含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細菌を培養する場合は、抗生物質を100μg/mLあるいは適量を加え、抗生物質の種類としては、アンピシリンやネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリンなどを含み、15〜18%(w/w)までに調整したグリセロールへ、OD660=0.1〜0.9までとなるように−80℃以下で凍結保存した細菌株を速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を120rpm、温度を30〜35℃まで、3〜5時間まで培養し、次にTB改変培地を300mLまでに、直ちにその全量を投入し、振盪回転を120rpm、温度を30〜35℃まで、7〜9時間まで培養する。
前述の方法で得られた細菌体は、重力あるいは遠心による回収時において、生理食塩水あるいは20mMのリン酸塩緩衝液で少なくとも2回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム塩を用いるのが良い。その後、菌体に対し細胞保護作用を示す賦形剤を添加する。例えば、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムなどの糖質を用い、菌体濃度5〜15%(w/v)までに対し1〜3%(w/v)まで加えると、最終的に−20〜−80℃までに温度制御された冷凍庫などで保存できる。とりわけ乳糖は、費用対効果や細胞保護作用の面で優れているので、これを用いることが望ましい。
得られた野生型、あるいは遺伝子組換え型を含むPCBs分解酵素群を高発現する細菌体の乾燥法、すなわち、発明品の最終形態となる触媒化法について述べる。
賦形剤とした糖質類と混合した湿菌体の乾燥は、凍結乾燥機やドラムドライヤー、スプレードライヤーを用いることができるが、スプレードライヤーが望ましい。発明を限定するものでないが、例えば、試作用としては、EYELA製SD−1000型を用いることができる。本機は、乾燥経路において、蒸発缶とサイクロンを備える。乾燥に重要な入口温度として、蒸発缶前の吸気管に温度センサーが取り付けてあり、また出口温度として、蒸発缶とサイクロンの間に温度センサーが取り付けてある。本乾燥工程においては、本機の入口温度を100〜120℃まで、出口温度を60〜70℃までの範囲で設定することが望ましい。その他に、ブロア風量は毎分0.75立米までとし、噴霧圧力は70〜90kPa、送液量は毎分5〜15mLまでとする。
本発明の微生物触媒を用いるPCBsの分解方法は、上記で乾燥した菌体を水性媒体に分散させたものとPCBsとを接触させることを特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、このようにして得られた微生物触媒を、比較的低濃度のPCBs汚染油と接触させたときに高いPCBs分解活性を発揮することができる。
さらに本発明の微生物触媒は、基質特異性の異なる複数の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを、それぞれ過剰発現させた複数の微生物触媒を組み合わせることが好ましい。上述したように、分解すべきPCBsは、その置換塩素原子の数と位置において極めて不均一な化合物集団であるから、それぞれの汚染油に含まれるPCBsの性状に合わせて、複数の微生物触媒の混合比率を調整し、最適なPCBs分解用組成物を調製しうることも本発明の1つの利点である。
本試験は、微生物触媒中に生存する細菌が存在しないことを確認する目的で行った。
本試験には、本発明である触媒化処理を施したビフェニルジオキシゲナーゼゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種(ロット番号:YU130926SD−1)を用いた(以下、「本触媒」とする)。本触媒は、ビフェニルに対し特異的に反応し、反応においては黄色を呈することが判っている。
上記懸濁液10μL(約1×108個の細菌細胞を含む)を、0.1%ビフェニルを含む無機液体培地2mLに添加し、温度30℃、120rpmで、5日間振盪培養を行ったが、菌体の生育による顕著な濁度の上昇は確認されなかった。
また、無機培地を主成分とした固形培地が入った培養皿に、唯一の炭素源として、ビフェニルをその蓋に固定し、上記で調製した本触媒の懸濁液を無機培地で1×10−4倍に希釈した溶液40μL(約40,000個の細菌細胞を含む)を播種して、温度30℃で一定とした環境で、5日間の培養を試みた。一方、LB培地(1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム)を1/5に希釈した栄養固形培地を用いて、上記同様の培養実験も試みた。その結果、両試験において、本触媒特有の、ビフェニル分解を示す黄色の呈色ならびに、菌コロニー形成・発育を認めなかった。
以上の結果から、本発明において作製した微生物触媒中に、生存菌体は含まれていないことが示された。
本試験では、微生物触媒中の酵素活性の残存評価を目的に試験を行った。
本試験には、本発明である触媒化処理を、賦形剤とした糖質である、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムを用いて、それぞれ施したビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種(ロット番号:YU120917SD−1〜8)を用いた(以下、「本触媒」とする)。
次に、試験反応溶液を、材質が全てガラスか少なくとも容器の内面がガラスライナーとなった反応容器にて、前述の試験溶液をOD660=10となるようこれへ投入し、基質としては、5mg/LのカネクロールKC−300を、反応液全量が500μLとなるように投入した。
微生物触媒の物理化学的特性を確認する目的で、乳糖を用いて微生物触媒化した試料の、粒子サイズとサイズ分布の確認を行った。
ドライスプレーでの乾燥工程において、糖質が細胞全体を均一に包み込みながら乾燥することで、複数の細胞が凝集することが懸念される。その結果、微生物触媒全体から見た、基質と細胞との接触面積が減少することから、触媒活性に大きな影響を及ぼすことが想定された。本試験では、微生物触媒が細胞ごとに均一に糖質で包含され乾燥し、反応時のリン酸塩緩衝液へ懸濁されても良く分散されているかを観察した。
本試験には、本発明である触媒化処理を施したビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種(ロット番号:YU130926SD−1)を用いた(以下、「本触媒」とする)。
試験懸濁液内の微生物触媒の粒子サイズとサイズ分布は、動的光散乱法(Dynamic Light Scattering法(以下、「DLS法」とする)を用いて調べた。測定機器は、Malvern社製、ゼータサイザーナノZSを使用した。本機器の設定パラメーターは、微生物細胞のReflective Indexを、1.37〜1.39までの範囲(Katz et al. JOUNAL OF SELECTED TOPICS IN QUANTUM ELECTRONICS Vol.9, No.2, 277−287. 2003)で、1.39が望ましく、蒸留水となる溶媒のReflective Indexを1.33、Viscosity of Sampleを1 Centipoise(CP)、Equilibrium Timeを120秒、Temperatureを25℃として、計測を行った。
微生物触媒の物理化学的特性を確認する目的で、乳糖を用いて微生物触媒化した試料の、細胞膜の形態や構造の保存性確認を行った。
走査型電子顕微鏡を用いて行った。分析機器はキーエンス株式会社製、VE−9800を用いた。
Claims (7)
- 芳香族化合物の分解反応に関わる一群の酵素を過剰発現させた微生物菌体に、賦形剤を添加し、噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒。
- 前記乾燥菌体が、核酸を転移し又は複製する能力を不活化した死細菌細胞からなる請求項1に記載の微生物触媒。
- 前記賦形剤が、乳糖、スキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス及びアラビアガムからなる群より選択される請求項1又は2に記載の微生物触媒。
- 前記酵素が、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを含む請求項1〜3の何れか一項に記載の微生物触媒。
- 前記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが、ビフェニル−2,3−ジオキシゲナーゼ若しくはビフェニル−3,4−ジオキシゲナーゼ又はこれらの混合物を含む請求項1〜4の何れか一項に記載の微生物触媒。
- リン酸緩衝液に再懸濁した時に、生細胞と同様の細胞形態に分散しうる1〜5の何れか一項に記載の微生物触媒。
- 基質特異性の異なる複数の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼのそれぞれを過剰発現させた請求項1〜6のいずれか一項に記載の複数の微生物触媒を組み合わせてなる、ポリ塩化ビフェニル類分解用組成物。
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JP2016044173A (ja) * | 2014-08-22 | 2016-04-04 | 国立大学法人山形大学 | 微生物触媒及びその使用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003088380A (ja) * | 2001-09-18 | 2003-03-25 | Railway Technical Res Inst | ビフェニル又はその誘導体の分解法、及びそれに用いられる微生物 |
WO2012141244A1 (ja) * | 2011-04-14 | 2012-10-18 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物菌体乾燥粉末の製造方法 |
JP2013179890A (ja) * | 2012-03-02 | 2013-09-12 | Yamagata Univ | 新規微生物及びこれを用いるポリ塩化ビフェニルの分解方法 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003088380A (ja) * | 2001-09-18 | 2003-03-25 | Railway Technical Res Inst | ビフェニル又はその誘導体の分解法、及びそれに用いられる微生物 |
WO2012141244A1 (ja) * | 2011-04-14 | 2012-10-18 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物菌体乾燥粉末の製造方法 |
JP2013179890A (ja) * | 2012-03-02 | 2013-09-12 | Yamagata Univ | 新規微生物及びこれを用いるポリ塩化ビフェニルの分解方法 |
Non-Patent Citations (1)
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---|
日本農芸化学会2014年度大会講演要旨集(オンライン)、2014年3月5日、3A10A17, JPN6018021106, ISSN: 0003931282 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016044173A (ja) * | 2014-08-22 | 2016-04-04 | 国立大学法人山形大学 | 微生物触媒及びその使用 |
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