WO2019193841A1 - 高生残性微生物乾燥菌体の製造方法 - Google Patents

高生残性微生物乾燥菌体の製造方法 Download PDF

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聡司 三井田
譲 牧野
彰久 松井
伊藤　雅彦
康浩 茂木
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    • C12R2001/245—Lactobacillus casei

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing microbial dry cells having high survival after storage.
  • microorganisms have useful enzyme activities and are widely used for the production of functional food materials such as carbohydrates, amino acids, and phospholipids.
  • lactic acid bacteria have been widely used for the production of dairy products such as yogurt and cheese, and in recent years, foods and beverages using dried lactic acid bacteria have been developed.
  • lactic acid bacteria it is desirable to use living cells as they are, but in the process of obtaining dry cells, the cells are often damaged and killed, and the necessary amount of living bacteria It was difficult to get a body.
  • Patent Documents 1 and 2 Non-Patent Document 1
  • Non-Patent Document 1 a technique for adjusting a dispersion medium used when drying bacterial cells
  • an object of the present invention is to provide a new technique for reducing the damage and death of bacterial cells.
  • the present invention is a method for producing a highly viable microbial dry cell characterized by subjecting the dry microbial cell to a temperature change treatment.
  • the present invention is a method for improving the survival of dried microorganism cells characterized by subjecting the dried microorganism cells to a temperature change treatment.
  • thermo change treatment it is possible to improve the viability of the microbial dry cells once produced after storage by a simple method called temperature change treatment.
  • the method for producing a highly viable microorganism dried cell of the present invention involves subjecting the dried microorganism to a temperature change treatment.
  • the microorganism dry cells used in the production method of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include cells obtained by drying microorganisms such as lactic acid bacteria.
  • lactic acid bacteria include Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus morimoris, Lactobacillus cilmoris, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus yoghurti, Lactobacillus yoghurti.
  • Bulgaricus Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus
  • Lactobacillus johnsonii Lactobacillus mali, etc.
  • Bifidobacterium breve Bifidobacterium longum and other Bifidobacterium bacteria, Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis and other Streptococcus lactis bacteria, Coccus Lactis Subspecies. Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subspecies. Lactococcus lactis subsp. Cremoris, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, etc.
  • lactic acid bacteria may be used alone or in combination of two or more.
  • lactic acid bacteria are preferable.
  • lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus are preferred, Lactobacillus casei is more preferred, Lactobacillus casei YIT 9029 (FERM BP-1366, date of contract: May 1, 1981, product evaluation technology of independent administrative agency)
  • the Foundation Organization's Patent Biological Deposit Center (Kazusa Kamashi 2-5-8, Room 120, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan) is particularly preferred.
  • the method for drying the microorganisms to obtain dried cells is not particularly limited, and spray drying, freeze drying, etc., well known to those skilled in the art may be employed. Specific methods include, for example, Japanese Patent No. 3504365, JP 2010-4787, GLDE20ANTONI et al., "Trehalose, a Cryoprotectant for Lactobacillus bulgaricus", Cryobiology 26, p.149-153, 1989. And the method described in International Publication WO2017 / 073752 and the like. Among these methods, the method described in International Publication No. WO2017 / 073752 is preferable.
  • microorganisms are cultured according to a conventional method, and then collected according to a conventional method. In addition, you may wash
  • the collected microbial cells are dispersed in an aqueous solution containing a protecting agent, an antioxidant and a chelating agent, preferably an aqueous solution comprising an protecting agent, an antioxidant and a chelating agent (hereinafter referred to simply as “dispersing medium”). If the suspension is added to the suspension and dried, the microorganisms are dried.
  • the water used in the dispersion medium is not particularly limited.
  • potable water such as purified water and deionized water can be used.
  • the protective agent used in the dispersion medium is not particularly limited.
  • glutamic acid or a salt thereof such as sodium glutamate and potassium glutamate
  • glutamic acid or a salt thereof and / or a disaccharide it is preferable to use glutamic acid or a salt thereof and / or a disaccharide, and sodium glutamate and / or trehalose are more preferable.
  • the content of the protective agent in the dispersion medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 40% by mass, and more preferably 5 to 30% by mass.
  • the antioxidant used in the dispersion medium is not particularly limited.
  • ascorbic acid such as sodium ascorbate or calcium ascorbate or a salt thereof, vitamin E, catechin, glutathione, astaxanthin, or the like can be used.
  • sodium ascorbate is preferable.
  • the content of the antioxidant in the dispersion medium is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 10% by mass, and more preferably 0.05 to 5% by mass.
  • the chelating agent used in the dispersion medium is not particularly limited, and for example, citric acid such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or sodium citrate or a salt thereof, phytic acid, or the like can be used.
  • the content of the chelating agent in the dispersion medium is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 10% by mass, and more preferably 0.5 to 5% by mass.
  • a preferable embodiment of the dispersion medium includes an aqueous solution containing sodium glutamate, trehalose, sodium ascorbate and sodium citrate.
  • the amount of microbial cells suspended in the dispersion medium is not particularly limited.
  • the number of microbial cells in the suspension is about 1.0 ⁇ 10 5 to 4.0 ⁇ 10 14 cfu / mL. There, more preferably about 1.0 ⁇ 10 7 ⁇ 4.0 ⁇ 10 13 cfu / mL.
  • the method for drying the suspension is not particularly limited.
  • a known drying method such as freeze drying or spray drying can be used.
  • Freeze drying is preferred.
  • the drying conditions in the freeze-drying method include conditions in which a freezing treatment is performed at ⁇ 35 ° C. to ⁇ 45 ° C. for 6 to 12 hours and then a drying treatment is performed at 12 ° C. to 32 ° C. for 40 to 90 hours. Can do.
  • the dried microbial cells obtained as described above are then subjected to a temperature change treatment.
  • the microbial dry cells Prior to the temperature change treatment, the microbial dry cells are formed with, for example, 0.2 g of hydroxypropylmethylcellulose without pulverizing the microbial dry cells with a mill and degassing under normal atmospheric composition.
  • the capsule may be filled and placed in a bag made of aluminum or the like together with an oxygen scavenger, and the temperature change treatment may be performed in that state.
  • the temperature change treatment is a process in which a temperature load different from room temperature is applied for a certain period of time, in which dried microbial cells are usually stored. Specifically, the following (a) and (b) (A) Treatment for heating to 30 ° C. or more for 1 day or more (b) One or more treatments selected from the group consisting of treatment for cooling to 1 ° C. or more and 10 ° C. or less are performed. These processes (a) and (b) can be performed individually, in combination, or repeatedly.
  • Preferable examples of the treatment (b) include the following.
  • the preferable temperature change treatment is, for example, the above (a) or the above (b) followed by the (a), and more preferably the above (a1).
  • (b1) is applied, (a1) is further applied, or (a2) is applied, and (a1) is particularly preferable.
  • such a temperature change treatment can be performed using a device capable of heating such as a dryer or an autoclave, and in the case of cooling, a device capable of cooling such as a refrigerator or a freezer. Can be applied.
  • a device capable of heating such as a dryer or an autoclave
  • a device capable of cooling such as a refrigerator or a freezer.
  • the pressure and the like are not particularly limited during the temperature change treatment.
  • the microbial dry cells thus obtained have a survival rate of 110% or more when the dried microbial cells are not subjected to temperature change treatment after 6 months storage, and after 12 months storage.
  • This highly viable microorganism dry cell can be used for the same use as the conventional microorganism dry cell. Specifically, it can be used for foods and beverages as it is or by mixing with other food materials usually added to foods. Examples of the food include processed meat food such as ham and sausage, processed fish food such as kamaboko and chikuwa, bread, confectionery, butter, yogurt and fermented milk. Moreover, as a drink, a soft drink, a dairy lactic acid bacteria drink, a lactic acid bacteria drink etc. are mentioned, for example. Furthermore, as a form of food / beverage products, the form of food / beverage products used normally, for example, solid form, such as a powder and a granule, paste form, liquid form, etc. are mentioned. Still further, the dried microorganism cells may be formulated into tablets, powders, chewable agents, hard capsules, soft capsules, pills, and the like.
  • Lactobacillus casei dried cells were serially diluted with physiological saline (0.85% by mass sodium chloride). After diluting 1 mL of the diluted solution with a BCP-added plate count agar medium and culturing at 37 ° C. for 72 hours, the resulting colonies were counted and multiplied by the dilution rate to obtain the number of viable Lactobacillus casei.
  • Example 1 Preparation of Lactobacillus casei dry cells and heat treatment: Lactobacillus casei YIT 9029 in a medium (pH 7) containing 1% by mass of yeast extract, 0.1% by mass of monopotassium phosphate, 0.2% by mass of dipotassium phosphate, and 2% by mass of lactose at 37 ° C., 20% Cultured anaerobically for hours. After completion of the culture, the solution was cooled to 20 ° C. or lower, and the pH was adjusted to 7.0 with a 5N sodium hydroxide solution.
  • the bacterial cells obtained by centrifuging this culture solution (14000 G, 4 ° C., 30 minutes) were collected, and sodium glutamate 10 mass%, trehalose 10 mass%, sodium ascorbate 1 mass%, sodium citrate 1 mass
  • the cells were suspended in a dispersion medium prepared to a total amount of 1000 mL with a composition of% to 2.0 ⁇ 10 11 cfu / mL.
  • This cell suspension was dispensed into a tray, and dried cells were prepared by freeze-drying.
  • the freeze-drying was performed using a freeze-dryer (TAKARA FREEZE-DRYER TF20-80TANNS: manufactured by Takara ETM Co., Ltd.) at a shelf temperature of ⁇ 40 ° C.
  • the obtained dried cells were pulverized with a mill, and 0.2 g each was filled into a capsule (made of hydroxypropylmethylcellulose) without degassing under normal atmospheric composition, and an oxygen scavenger (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) Made into an aluminum pouch.
  • the aluminum pouch immediately after production obtained above was heated at 35 ° C. for 2 days and then stored at 22 ° C. for 6 months (implementation method 1). Moreover, the aluminum pouch immediately after manufacture obtained above was cooled at 2 ° C. for 1 day, further heated at 35 ° C. for 2 days, and then stored at 22 ° C. for 6 months (Example 2). Furthermore, the aluminum pouch immediately after production obtained above was heated at 37 ° C. for 1 day and then stored at 22 ° C. for 6 months (Execution method 3). The aluminum pouch obtained above was stored at 22 ° C. for 6 months for comparison.
  • Table 1 The results of measuring the number of viable bacteria before and after storage are shown in Table 1. In addition, the survival rate was calculated from the number of these viable bacteria using the following formula, and further, how much the survival rate of each implementation method was improved with respect to the comparison method (no temperature change treatment) Calculated using the formula. The results are also shown in Table 1.
  • the survival rate after storage for 6 months in the implementation method is 25% or more, and the implementation method has at least 110% survival in the case where the temperature change treatment is not performed (comparative method). It was.
  • Example 2 Long-term storage of Lactobacillus casei dry cells: Table 2 shows the results of measuring the number of viable bacteria before and after storage in the same manner as in Example 1 after storing the dried cells obtained in Example 1 after storage for 6 months at 22 ° C. for another 6 months. Moreover, the survival rate and the improvement rate of the survival property were calculated by the same method as in Example 1. The results are also shown in Table 2.
  • the survival rate after storage for 12 months of the implementation method is 21% or more, and the implementation method has at least 130% survival when no temperature change treatment is performed (comparative method). It was.
  • the present invention can be used for the production of dry cells of microorganisms. more than

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Abstract

微生物乾燥菌体に変温処理を施すことを特徴とする高生残性微生物乾燥菌体の製造方法により、菌体の損傷や死滅を減らす新たな技術を提供する。

Description

高生残性微生物乾燥菌体の製造方法
　本発明は、保存後の生残性が高い微生物乾燥菌体の製造方法に関する。
　微生物には、有用な酵素活性を有するものが多く存在し、糖質、アミノ酸、リン脂質等の機能性食品素材の製造に広く利用されている。
　特に微生物の中でも乳酸菌は、従来からヨーグルトやチーズ等の乳製品の製造に広く利用されており、また、近年、乳酸菌を乾燥させたものを用いた食品や飲料等の開発が進んでいる。そして、乳酸菌の効果を得るためには、生きたままの菌体を利用することが望ましいが、乾燥菌体を得る工程では、菌体が損傷し、死滅することが多く、必要量の生菌体を得ることは難しかった。
　これまで、菌体の損傷や死滅を減らす技術としては、例えば、菌体を乾燥させる際に使用する分散媒を調整する技術等が知られている（特許文献１、２、非特許文献１）。
　しかしながら、菌体の損傷や死滅を減らす技術としては、菌体を乾燥させるまでに行われるものしか知られていなかった。
特許第３５０４３６５号 特開２０１０－４７８７号公報
G.L.DE ANTONI et al., "Trehalose, a Cryoprotectant for Lactobacillus bulgaricus", Cryobiology 26, p.149-153, 1989.
　従って、本発明の課題は、菌体の損傷や死滅を減らす新たな技術を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、通常は熱ストレスは微生物の生残性を低下させる要因となるところ、乾燥菌体を得た後に熱ストレスに該当する変温処理を施すことにより、意外にも保存後の生残性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、微生物乾燥菌体に変温処理を施すことを特徴とする高生残性微生物乾燥菌体の製造方法である。
　また、本発明は、微生物乾燥菌体に変温処理を施すことを特徴とする微生物乾燥菌体の生残性改善方法である。
　本発明によれば、変温処理という簡単な方法で、一旦製造した微生物乾燥菌体の保存後の生残性を向上できる。
　本発明の高生残性微生物乾燥菌体の製造方法（以下、「本発明製造方法」という）は、微生物乾燥菌体に変温処理を施すものである。
　本発明製造方法に用いられる微生物乾燥菌体は、特に限定されないが、例えば、乳酸菌等の微生物を乾燥させた菌体が挙げられる。乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・クレモリス（Lactobacillus cremoris）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ユーグルティ（Lactobacillus yoghurti）、ラクトバチルス・デルブルッキィー サブスピーシーズ．ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキィー サブスピーシーズ．デルブルッキィー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）等のラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等のエンテロコッカス属細菌を挙げることができる。これら乳酸菌は１種または２種以上を組み合わせてもよい。これらの微生物の中でも乳酸菌が好ましい。これら乳酸菌の中でも、ラクトバチルス属の乳酸菌が好ましく、ラクトバチルス・カゼイがより好ましく、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６、受託日：昭和５６年５月１日、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室））が特に好ましい。
　上記微生物を乾燥させ、乾燥菌体を得る方法は特に限定されず、当業者に周知な噴霧乾燥、凍結乾燥等を採用すればよい。具体的な方法としては、例えば、特許第３５０４３６５号、特開２０１０－４７８７号公報、G.L.DE ANTONI et al., "Trehalose, a Cryoprotectant for Lactobacillus bulgaricus", Cryobiology 26, p.149-153, 1989.、国際公開ＷＯ２０１７／０７３７５２号等に記載の方法等が挙げられる。これらの方法の中でも国際公開ＷＯ２０１７／０７３７５２号に記載されている方法が好ましい。
　より具体的に、国際公開ＷＯ２０１７／０７３７５２号に記載されている方法は次のようにして行われる。
　まず、微生物を常法に従って培養し、次いで、常法に従って集菌する。なお、微生物の培養や集菌の間や前後には、必要に応じて洗浄をしてもよい。
　この集菌した微生物菌体を、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を含む水溶液、好ましくは保護剤、抗酸化剤およびキレート剤からなる水溶液の分散媒（以下、これを単に「分散媒」ともいう）中に加えて懸濁させ、この懸濁液を乾燥すれば、微生物乾燥菌体が得られる。
　上記分散媒で使用する水は、特に限定されないが、例えば、精製水、脱イオン水等の飲用可能な水を使用できる。
　上記分散媒で使用する保護剤は、特に限定されないが、例えば、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム等のグルタミン酸またはその塩、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類、グリセロール、マルトデキストリン、サイクロデキストリン、脱脂粉乳等が挙げられる。これら保護剤の中でも、グルタミン酸もしくはその塩および／または二糖類を使用することが好ましく、グルタミン酸ナトリウムおよび／またはトレハロースがより好ましい。上記分散媒における保護剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、１～４０質量％が好ましく、５～３０質量％がより好ましい。
　また、上記分散媒で使用する抗酸化剤は、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム等のアスコルビン酸またはその塩、ビタミンＥ、カテキン、グルタチオン、アスタキサンチン等を使用することができ、これら抗酸化剤の中でもアスコルビン酸ナトリウムが好ましい。上記分散媒における抗酸化剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、０.０１～１０質量％が好ましく、０.０５～５質量％がより好ましい。
　更に、上記分散媒で使用するキレート剤は、特に限定されないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸ナトリウム等のクエン酸またはその塩、フィチン酸等を使用することができる。上記分散媒におけるキレート剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、０.１～１０質量％が好ましく、０.５～５質量％がより好ましい。
　上記分散媒の好ましい態様としては、グルタミン酸ナトリウム、トレハロース、アスコルビン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含有する水溶液が挙げられる。
　上記分散媒に微生物菌体を懸濁させる量は、特に限定されないが、例えば、懸濁液中の微生物菌体数として、１.０×１０５～４.０×１０１４ｃｆｕ／ｍＬ程度であり、１.０×１０７～４.０×１０１３ｃｆｕ／ｍＬ程度がより好ましい。
　上記懸濁液を乾燥させる方法は、特に限定されないが、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等の公知の乾燥方法を利用することができるが、乾燥工程での微生物の生残率を高めるためには、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥法における乾燥条件としては、例えば、－３５℃～－４５℃で６～１２時間の凍結処理を行った後、１２℃～３２℃で４０～９０時間の乾燥処理を行う条件を挙げることができる。
　上記のようにして得られる微生物乾燥菌体は、次いで、変温処理を行う。なお、変温処理の前にこの微生物乾燥菌体は、例えば、微生物乾燥菌体をミルで粉砕し、通常の大気組成下で脱気を行わずに、０．２ｇずつヒドロキシプロピルメチルセルロース等で形成されたカプセルに充填し、脱酸素剤と共にアルミ等で形成された袋等に入れておき、その状態で変温処理を行ってもよい。
　変温処理は、通常、微生物乾燥菌体が保存される、室温と異なる温度負荷を一定期間以上かけるものである。具体的には次の（ａ）および（ｂ）
（ａ）１日以上、３０℃以上に加温する処理
（ｂ）１日以上、１０℃以下に冷却する処理
からなる群から選ばれる処理の１または２以上を施すものである。これら（ａ）および（ｂ）の処理はそれぞれの処理を単独で施したり、組み合わせて施したり、繰り返して施したりすることができる。
　上記（ａ）の処理の好ましい例としては以下のものが挙げられる。
（ａ１）１日以上、好ましくは２日、３０℃以上、好ましくは３５～３７℃に加温する処理
（ａ２）１日以上、好ましくは１日、３０℃以上、好ましくは３５～３７℃に加温する処理
　上記（ｂ）の処理の好ましい例としては以下のものが挙げられる。
（ｂ１）１日以上、好ましくは１日、１０℃以下、好ましくは２～１０℃に冷却する処理
　変温処理の好ましいものとしては、例えば、上記（ａ）を施す、または、上記（ｂ）を施してから更に（ａ）を施すことであり、より好ましいものとしては、上記（ａ１）を施す、または、上記（ｂ１）を施してから更に（ａ１）を施す、または、上記（ａ２）を施すことであり、特に好ましいものとしては、上記（ａ１）を施すことである。
　このような変温処理は、加温の場合には、乾燥機やオートクレーブ等の加温可能な装置を利用して施すことができ、冷却の場合には、冷蔵庫や冷凍庫等の冷却可能な装置を利用して施すことができる。なお、これら変温処理の際には、圧力等は特に限定されない。
　斯くして得られる微生物乾燥菌体は、６ヶ月保存後の場合は、微生物乾燥菌体に変温処理を施さない場合の１１０％以上の生残性を有するものとなり、１２ヶ月保存後の場合は、微生物乾燥菌体に変温処理を施さない場合の１２０％以上の生残性を有するものとなり、好ましくは１３０～１４０％の生残性を有するものとなる。
　この高生残性微生物乾燥菌体は、従来の微生物乾燥菌体と同様の用途に用いることができる。具体的には、そのまま、あるいは通常食品に添加される他の食品素材と混合することにより、食品や飲料に利用することができる。食品としては、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、ヨーグルトや発酵乳等が挙げられる。また、飲料としては、例えば、清涼飲料、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料等が挙げられる。更に、飲食品の形態としては、通常用いられる飲食品の形態、例えば、粉末、顆粒等の固体状、ペースト状、液状等が挙げられる。また更に、微生物乾燥菌体は、例えば、錠剤、散剤、チュアブル剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、丸剤等の製剤化をしてもよい。
　以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ラクトバチルス・カゼイの生菌数は、次の方法で測定した。
＜ラクトバチルス・カゼイ生菌数の測定法＞
　ラクトバチルス・カゼイ乾燥菌体を生理食塩水（０．８５質量％塩化ナトリウム）で段階希釈した。希釈液１ｍＬをＢＣＰ加プレートカウント寒天培地で混釈し、３７℃、７２時間培養した後に、生じたコロニーを計測し、希釈率を乗じ、ラクトバチルス・カゼイ生菌数とした。
実　施　例　１
　　　ラクトバチルス・カゼイ乾燥菌体の調製および変温処理：
　ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ ９０２９を、酵母エキス１質量％、リン酸一カリウム０．１質量％、リン酸二カリウム０．２質量％、乳糖２質量％を含む培地（ｐＨ７）で、３７℃、２０時間嫌気的に培養した。培養終了後、液温が２０℃以下になるまで冷却し、５規定の水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に調整した。この培養液を遠心分離（１４０００Ｇ、４℃、３０分間）して得られた菌体を回収して、グルタミン酸ナトリウム１０質量％、トレハロース１０質量％、アスコルビン酸ナトリウム１質量％、クエン酸ナトリウム１質量％となる組成で全量が１０００ｍＬとなるように調製した分散媒に、菌体を２．０×１０１１ｃｆｕ／ｍＬとなるように懸濁した。この菌体懸濁液をトレーに分注し、凍結乾燥法により乾燥菌体を調製した。なお、凍結乾燥は、凍結乾燥機（TAKARA FREEZE-DRYER TF20-80TANNS：（株）宝エーテーエム製）を用い、棚温－４０℃で９時間、その後２０℃で８０時間の条件で行った。得られた乾燥菌体をミルで粉砕し、通常の大気組成下で脱気を行わずに、０．２ｇずつカプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース製）に充填し、脱酸素剤（三菱ガス化学（株）製）と共にアルミパウチに入れた。
　上記で得られた製造直後のアルミパウチを３５℃で２日間加温した後、２２℃で６か月間保存した（実施方法１）。また、上記で得られた製造直後のアルミパウチを２℃で１日間冷却し、更に、３５℃で２日間加温した後、２２℃で６か月間保存した（実施方法２）。更に、上記で得られた製造直後のアルミパウチを３７℃で１日間加温した後、２２℃で６か月間保存した（実施方法３）。なお、上記で得られたアルミパウチを２２℃で６か月間保存したものを比較とした。保存前後の生菌数を測定した結果を表１に示した。また、これらの生菌数から以下の式を用いて生残率を算出し、更に、各実施方法が比較方法（変温処理なし）に対してどれだけ生残性を向上させたかを以下の式を用いて算出した。それらの結果も表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［数１］
生残率（％）＝（保存後の生菌数／保存前の生菌数）×１００
［数２］
生残性の向上率（％）＝（実施方法の生残率／比較方法の生残率）×１００
　この結果から、実施方法の６ヶ月保存後の生残率は２５％以上であり、実施方法は変温処理を施さない場合（比較方法）の少なくとも１１０％以上の生残性を有することが分かった。
実　施　例　２
　　　ラクトバチルス・カゼイ乾燥菌体の長期保存：
　実施例１で得られた６ヶ月保存後の乾燥菌体を２２℃でさらに６ヶ月保存し、保存前後の生菌数を実施例１と同様の方法で測定した結果を表２に示した。また、実施例１と同様の方法で生残率と生残性の向上率を算出した。それらの結果も表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この結果から、実施方法の１２ヶ月保存後の生残率は２１％以上であり、実施方法は変温処理を施さない場合（比較方法）の少なくとも１３０％以上の生残性を有することが分かった。
　本発明は、微生物の乾燥菌体の製造に利用できる。
 
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　以　　上

Claims (8)

  1. 　微生物乾燥菌体に変温処理を施すことを特徴とする高生残性微生物乾燥菌体の製造方法。
  2. 　変温処理が、次の（ａ）および（ｂ）
    （ａ）１日以上、３０℃以上に加温する処理
    （ｂ）１日以上、１０℃以下に冷却する処理
    からなる群から選ばれる処理の１または２以上を施すものである請求項１記載の高生残性微生物乾燥菌体の製造方法。
  3. 　微生物乾燥菌体に変温処理を施さない場合の１１０％以上の生残性を有するものである請求項１または２記載の高生残性微生物乾燥菌体の製造方法。
  4. 　微生物乾燥菌体が、ラクトバチルス属の乳酸菌の乾燥菌体である請求項１～３の何れかに記載の高生残性微生物乾燥菌体の製造方法。
  5. 　微生物乾燥菌体に変温処理を施すことを特徴とする微生物乾燥菌体の生残性改善方法。
  6. 　変温処理が、次の（ａ）および（ｂ）
    （ａ）１日以上、３０℃以上に加温する処理
    （ｂ）１日以上、１０℃以下に冷却する処理
    からなる群から選ばれる処理の１または２以上を施すものである請求項５記載の微生物乾燥菌体の生残性改善方法。
  7. 　微生物乾燥菌体に変温処理を施さない場合の１１０％以上の生残性を有するものである請求項５または６記載の微生物乾燥菌体の生残性改善方法。
  8. 　微生物乾燥菌体が、ラクトバチルス属の乳酸菌の乾燥菌体である請求項５～７の何れかに記載の微生物乾燥菌体の生残性改善方法。
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