CN111954711A - 高存活性微生物干燥菌体的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过高存活性微生物干燥菌体的制造方法来减少菌体的损伤、死亡的新技术，所述高存活性微生物干燥菌体的制造方法的特征在于，对微生物干燥菌体实施变温处理。

Description

高存活性微生物干燥菌体的制造方法
技术领域
本发明涉及一种保存后的存活性高的微生物干燥菌体的制造方法。
背景技术
在微生物中大量存在具有有用的酶活性的微生物，被广泛利用于糖质、氨基酸、磷脂等功能性食品材料的制造。
特别是微生物中的乳酸菌一直以来被广泛利用于酸奶、奶酪等乳制品的制造，另外，近年来，正在进行使用使乳酸菌干燥而得的菌体的食品、饮料等的开发。而且，为了得到乳酸菌的效果，期望利用活着的菌体，但在得到干燥菌体的工序中，许多菌体会损伤、死亡，难以得到需要量的活菌体。
迄今为止，作为减少菌体的损伤、死亡的技术，例如已知有调整使菌体干燥时使用的分散介质的技术等(专利文献1、2，非专利文献1)。
然而，作为减少菌体的损伤、死亡的技术，仅已知进行至使菌体干燥为止的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3504365号
专利文献2：日本特开2010－4787号公报
非专利文献
非专利文献1：G.L.DE ANTONI et al.，"Trehalose，a Cryoprotectant forLactobacillus bulgaricus"，Cryobiology 26，p.149－153，1989.
发明内容
因此，本发明的课题在于提供一种减少菌体的损伤、死亡的新技术。
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现通常热应激是使微生物的存活性降低的主要原因，但通过在得到干燥菌体后实施相当于热应激的变温处理，意外地使保存后的存活性提高，完成了本发明。
即，本发明是一种高存活性微生物干燥菌体的制造方法，其特征在于，对微生物干燥菌体实施变温处理。
另外，本发明是一种微生物干燥菌体的存活性改善方法，其特征在于，对微生物干燥菌体实施变温处理。
根据本发明，能够通过变温处理这样的简单的方法来提高暂且制造的微生物干燥菌体的保存后的存活性。
具体实施方式
本发明的高存活性微生物干燥菌体的制造方法(以下，称为“本发明制造方法”)对微生物干燥菌体实施变温处理。
本发明制造方法中使用的微生物干燥菌体没有特别限定，例如可举出使乳酸菌等微生物干燥而得的菌体。作为乳酸菌，例如可举出干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳脂乳杆菌(Lactobacillus cremoris)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、日本乳杆菌(Lactobacillus yoghurti)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.delbrueckii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)等乳杆菌属细菌，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)等双歧杆菌属细菌，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)等链球菌属细菌，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、植物乳球菌(Lactococcusplantarum)、棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)等乳球菌属细菌，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)等肠球菌属细菌。这些乳酸菌可以为1种或组合2种以上。这些微生物中，优选乳酸菌。这些乳酸菌中，优选乳杆菌属的乳酸菌，更优选干酪乳杆菌，特别优选干酪乳杆菌YIT 9029(FERM BP－1366，保藏日期：昭和56年5月1日，国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(〒292－0818日本千叶县木更津市上总镰足2－5－8 120号室))。
使上述微生物干燥而得到干燥菌体的方法没有特别限定，只要采用本领域技术人员公知的喷雾干燥、冷冻干燥等即可。作为具体的方法，例如可举出日本专利第3504365号、日本特开2010－4787号公报、G.L.DE ANTONI et al.,“Trehalose,a Cryoprotectant forLactobacillus bulgaricus”,Cryobiology 26,p.149－153,1989.、国际公开WO2017/073752号等中记载的方法等。这些方法中，优选国际公开WO2017/073752号中记载的方法。
更具体而言，国际公开WO2017/073752号中记载的方法如下进行。
首先，依照常规方法培养微生物，接着，依照常规方法进行收集微生物。此外，在微生物的培养或收集微生物的期间或前后可以根据需要进行清洗。
将收集微生物而得的微生物菌体加入到含有保护剂、抗氧化剂和螯合剂的水溶液、优选由保护剂、抗氧化剂和螯合剂构成的水溶液的分散介质(以下，也将其简称为“分散介质”)中并使其悬浮，如果将该悬浮液干燥，则可得到微生物干燥菌体。
上述分散介质中使用的水没有特别限定，例如可以使用纯化水、去离子水等能够饮用的水。
上述分散介质中使用的保护剂没有特别限定，例如可举出谷氨酸钠、谷氨酸钾等谷氨酸或其盐、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等二醣类、甘油、麦芽糊精、环糊精、脱脂奶粉等。这些保护剂中，优选使用谷氨酸或其盐和/或二醣类，更优选谷氨酸钠和/或海藻糖。上述分散介质中的保护剂的含量没有特别限定，例如，优选1～40质量％，更优选5～30质量％。
另外，上述分散介质中使用的抗氧化剂没有特别限定，例如可以使用抗坏血酸钠、抗坏血酸钙等抗坏血酸或其盐、维生素E、儿茶素、谷胱甘肽、虾青素等，这些抗氧化剂中，优选抗坏血酸钠。上述分散介质中的抗氧化剂的含量没有特别限定，例如，优选0.01～10质量％，更优选0.05～5质量％。
进而，上述分散介质中使用的螯合剂没有特别限定，例如可以使用乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠等柠檬酸或其盐、植酸等。上述分散介质中的螯合剂的含量没有特别限定，例如，优选0.1～10质量％，更优选0.5～5质量％。
作为上述分散介质的优选形态，可举出含有谷氨酸钠、海藻糖、抗坏血酸钠和柠檬酸钠的水溶液。
使微生物菌体悬浮于上述分散介质的量没有特别限定，例如，作为悬浮液中的微生物菌体数，为1.0×105～4.0×1014cfu/mL左右，更优选1.0×107～4.0×1013cfu/mL左右。
使上述悬浮液干燥的方法没有特别限定，例如可以利用冷冻干燥、喷雾干燥等公知的干燥方法，为了提高在干燥工序中的微生物的存活率，优选冷冻干燥。作为冷冻干燥法中的干燥条件，例如可举出在－35℃～－45℃进行6～12小时的冷冻处理后，在12℃～32℃进行40～90小时的干燥处理的条件。
以上述方式得到的微生物干燥菌体接着施行变温处理。另外，在变温处理前，该微生物干燥菌体例如也可以将微生物干燥菌体用研磨机粉碎，在通常的大气组成下不进行脱气地每0.2g填充于由羟丙基甲基纤维素等形成的胶囊中，与脱氧剂一起装入到由铝等形成的袋等中，以该状态进行变温处理。
变温处理通常施加一定时间以上的微生物干燥菌体被保存的与室温不同的温度负荷。具体而言，实施1或2种以上选自以下的(a)和(b)中的处理：
(a)进行1天以上的加热至30℃以上的处理；
(b)进行1天以上的冷却至10℃以下的处理。
这些(a)和(b)的处理可以单独实施各处理，或者组合实施各处理，或者反复实施各处理。
作为上述(a)的处理的优选的例子，可举出以下处理。
(a1)进行1天以上、优选2天的加热至30℃以上、优选35～37℃的处理
(a2)进行1天以上、优选1天的加热至30℃以上、优选35～37℃的处理
作为上述(b)的处理的优选的例子，可举出以下处理。
(b1)进行1天以上、优选1天的冷却至10℃以下、优选2～10℃的处理
作为变温处理的优选的例子，例如是实施上述(a)，或实施上述(b)后进一步实施(a)，作为更优选的例子，是实施上述(a1)，或实施上述(b1)后进一步实施(a1)，或实施上述(a2)，作为特别优选的例子，是实施上述(a1)。
这样的变温处理在加热时可以利用干燥机、高压釜等能够加热的装置来实施，在冷却时可以利用冰箱、冰柜等能够冷却的装置来实施。此外，在这些变温处理时，压力等没有特别限定。
如此得到的微生物干燥菌体保存6个月后的情况是具有未对微生物干燥菌体实施变温处理时的110％以上的存活性，保存12个月后的情况是具有未对微生物干燥菌体实施变温处理时的120％以上的存活性，优选具有130～140％的存活性。
该高存活性微生物干燥菌体能够用于与以往的微生物干燥菌体相同的用途。具体而言，可以通过直接或者与通常添加到食品中的其它食品材料混合而利用于食品、饮料。作为食品，例如可举出火腿、香肠等食用肉加工食品、鱼糕、竹轮等水产加工食品、面包、糕点、黄油、酸奶、发酵乳等。另外，作为饮料，例如可举出清凉饮料、乳制品乳酸菌饮料、乳酸菌饮料等。进而，作为食品和饮料的形态，可举出通常使用的食品和饮料的形态，例如粉末、颗粒等固体状、糊状、液状等。另外，微生物干燥菌体也可以进行例如片剂、散剂、咀嚼剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂等制剂化。
实施例
以下，举出实施例来详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例任何限定。此外，在以下的实施例中，干酪乳杆菌的活菌数通过以下的方法进行测定。
＜干酪乳杆菌活菌数的测定法＞
将干酪乳杆菌干燥菌体用生理盐水(0.85质量％氯化钠)进行逐步稀释。将稀释液1mL用加入了BCP的平板计数琼脂培养基进行混合稀释，在37℃培养72小时后，对产生的菌落进行计数，乘以稀释率，作为干酪乳杆菌活菌数。
实施例1
干酪乳杆菌干燥菌体的制备和变温处理：
将干酪乳杆菌YIT 9029在含有酵母提取物1质量％、磷酸二氢钾0.1质量％、磷酸氢二钾0.2质量％、乳糖2质量％的培养基(pH 7)中在37℃厌氧培养20小时。培养结束后，冷却至液体温度成为20℃以下，用5N的氢氧化钠溶液，将pH调节成7.0。将对该培养液进行离心分离(14000G，4℃，30分钟)而得到的菌体回收，并将菌体以成为2.0×1011cfu/mL的方式悬浮于以成为谷氨酸钠10质量％、海藻糖10质量％、抗坏血酸钠1质量％、柠檬酸钠1质量％的组成且总量成为1000mL的方式进行制备的分散介质中。将该菌体悬浮液分注于托盘中，通过冷冻干燥法制备干燥菌体。应予说明，冷冻干燥使用冷冻干燥机(TAKARA FREEZE-DRYER TF20-80TANNS：TakaraATM株式会社制)，以在棚温-40℃下9小时，然后在20℃下80小时的条件进行。将得到的干燥菌体用研磨机粉碎，在通常的大气组成下未进行脱气地每0.2g填充于胶囊(羟丙基甲基纤维素制)中，与脱氧剂(三菱瓦斯化学株式会社制)一起装入到铝袋中。
将上述得到的刚制造后的铝袋在35℃加热2天后，在22℃保存6个月(实施方法1)。另外，将上述得到的刚制造后的铝袋在2℃冷却1天，进一步在35℃加热2天后，在22℃保存6个月(实施方法2)。进而，将上述得到的刚制造后的铝袋在37℃加热1天后，在22℃保存6个月(实施方法3)。应予说明，以将上述得到的铝袋在22℃保存6个月的情况作为比较。将测定保存前后的活菌数而得到的结果示于表1。另外，由这些活菌数并使用下式算出存活率，进而，使用下式算出各实施方法相对于比较方法(无变温处理)提高了多少存活性。将这些结果也示于表1。
[表1]
保存前 保存6个月后 存活率 存活性的提高率
比较方法 2730亿个/g 618亿个/g 22.6％ -
实施方法1 2730亿个/g 745亿个/g 27.3％ 121％
实施方法2 2730亿个/g 700亿个/g 25.6％ 113％
实施方法3 2730亿个/g 720亿个/g 26.4％ 117％
[数学式1]
存活率(％)＝(保存后的活菌数/保存前的活菌数)×100
[数学式2]
存活性的提高率(％)＝(实施方法的存活率/比较方法的存活率)×100
根据该结果可知，实施方法的保存6个月后的存活率为25％以上，实施方法具有未实施变温处理时(比较方法)的至少110％以上的存活性。
实施例2
干酪乳杆菌干燥菌体的长期保存：
将实施例1中得到的保存6个月后的干燥菌体在22℃进一步保存6个月，将通过与实施例1相同的方法测定保存前后的活菌数而得到的结果示于表2。另外，通过与实施例1相同的方法算出存活率和存活性的提高率。这些结果也示于表2。
[表2]
保存前 保存12个月后 存活率 存活性的提高率
比较方法 2730亿个/g 440亿个/g 16.1％ -
实施方法1 2730亿个/g 590亿个/g 21.6％ 134％
实施方法2 2730亿个/g 575亿个/g 21.1％ 131％
实施方法3 2730亿个/g 580亿个/g 21.2％ 132％
由该结果可知，实施方法的保存12个月后的存活率为21％以上，实施方法具有未实施变温处理时(比较方法)的至少130％以上的存活性。
产业上的可利用性
本发明能够利用于微生物的干燥菌体的制造。
以上

Claims (8)

1.一种高存活性微生物干燥菌体的制造方法，其特征在于，对微生物干燥菌体实施变温处理。
2.根据权利要求1所述的高存活性微生物干燥菌体的制造方法，其中，变温处理实施1或2种以上选自以下的(a)和(b)中的处理：
(a)进行1天以上的加热至30℃以上的处理，
(b)进行1天以上的冷却至10℃以下的处理。
3.根据权利要求1或2所述的高存活性微生物干燥菌体的制造方法，其中，具有未对微生物干燥菌体实施变温处理时的110％以上的存活性。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的高存活性微生物干燥菌体的制造方法，其中，微生物干燥菌体为乳杆菌属的乳酸菌的干燥菌体。
5.一种微生物干燥菌体的存活性改善方法，其特征在于，对微生物干燥菌体实施变温处理。
6.根据权利要求5所述的微生物干燥菌体的存活性改善方法，其中，变温处理实施1或2种以上选自以下的(a)和(b)中的处理：
(a)进行1天以上的加热至30℃以上的处理，
(b)进行1天以上的冷却至10℃以下的处理。
7.根据权利要求5或6所述的微生物干燥菌体的存活性改善方法，其中，具有未对微生物干燥菌体实施变温处理时的110％以上的存活性。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的微生物干燥菌体的存活性改善方法，其中，微生物干燥菌体为乳杆菌属的乳酸菌的干燥菌体。
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