CN103403141A - 微生物菌体干燥粉末的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于开发一种可在干燥状态下维持微生物所具有的酶活性的手段，提供一种维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法和由其得到的微生物菌体干燥粉末，该制造方法的特征在于，向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来对其进行干燥。

Description

微生物菌体干燥粉末的制造方法
技术领域
本发明涉及微生物菌体干燥粉末的制造方法，更具体地说，本发明涉及下述微生物菌体干燥粉末及其制造方法，该微生物菌体干燥粉末中，不论微生物为活菌还是死菌，均可在干燥状态下长期稳定地保持微生物所具有的酶活性。
背景技术
在微生物中，大量存在具有有用酶活性的微生物，它们被广泛用于糖质、氨基酸、磷脂质等功能性食品材料的制造中。其中，已知有大量可用于糖质材料、特别是低聚糖的制造中的微生物，例如，存在有关于利用属于独特掷孢酵母(Sporobolomycessingularis)的酵母菌所具有的β-半乳糖苷酶活性来制造半乳低聚糖的报告(专利文献1)，此外据报告，还制作出了独特掷孢酵母的β-半乳糖苷酶活性得到了提高的变异微生物(专利文献2)。
对于上述独特掷孢酵母所具有的β-半乳糖苷酶来说，与几种微生物所产生的酶同样，酶牢固地结合在微生物的细胞壁上，因而不论是在技术上还是在成本上，都难以在工业上进行该β-半乳糖苷酶的释放·精制。因此，将独特掷孢酵母所具有的β-半乳糖苷酶进行工业性应用的情况下，其是以希薄的微生物菌体液形式进行供给的，但存在着因该利用形态而导致的问题。
即，具有下述问题：由于其为相对于菌体含有数倍的水、缓冲液等的形态，因而在到达保存位置或利用位置的流通中要花费大量的成本；并且由于为液态物，因而难以针对微生物污染进行管理、不适于长期保存；进而，为了降低微生物污染的风险，有必要根据需要来进行生产。
特别是在想要使用独特掷孢酵母所具有的β-半乳糖苷酶在工业上以低成本进行半乳低聚糖的生产的情况下，上述问题的解决是极为重要的，希望开发出即使在干燥状态下也可维持微生物所具有的酶活性的手段。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公平5-58714号公报
专利文献2：日本专利第4071037号公报
专利文献3：日本特开平10-57031号公报
专利文献4：日本特开2002-17337号公报
发明内容
发明所要解决的课题
因而，本发明的课题在于提供一种可在干燥状态下长期稳定保持微生物所具有的酶活性的微生物菌体干燥粉末的制造方法。
解决课题的手段
本发明人为了解决这样的问题进行了深入研究，结果发现，在干燥微生物菌体与糖质共存的状态下，无论该干燥微生物为活菌还是死菌，均可长期维持微生物所具有的酶活性。
此外发现，在通过喷雾干燥法来制备干燥菌体粉末的情况下，通过预先向微生物菌体液中添加糖质、进行喷雾干燥，在干燥中酶滴度几乎不会降低。
并且发现，若利用这些性质，可以不受需要的制约来进行微生物的培养，并且还可大幅降低流通成本，从而完成了本发明。
即，本发明涉及维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其特征在于，向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来对其进行干燥。
此外，本发明涉及可长期保存的微生物菌体干燥粉末，其含有具有酶活性的微生物菌体、以及糖质。
发明的效果
根据本发明的方法，得到了即使长期保存1年以上微生物所具有的酶活性也几乎不会降低的微生物菌体粉末，因此从流通、生产这两个方面来看，具有极高的经济性。此外，在本发明的方法中，即使是在使用死菌作为微生物的情况下，其酶滴度也可得以维持，因而能够避免使用活菌的情况下所引起的微生物所产生的代谢物等所致的品质降低。利用本发明方法得到的微生物菌体干燥粉末在低聚糖生成反应中能够在实用方面没有问题地使用。
附图说明
图1为示出了对喷雾干燥物进行1年保存试验的结果的附图。
图2为示出了对冷冻干燥物进行1年保存试验的结果的附图。
图3为示出了喷雾干燥物在喷雾干燥后的滴度残存率的附图。
具体实施方式
作为可利用本发明的方法得到微生物菌体干燥粉末的微生物，为细菌、酵母、霉等微生物，只要为在细胞壁上结合有酶、或者在菌体内可产生酶，就可为任何微生物，进而可以为经各种处理后的微生物。例如，作为细菌，可以举出：嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、莱士曼氏乳杆菌(Lactobacillus leichmannii)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、两岐双岐杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。此外，作为酶没有特别限定，例如若为糖质分解酶，则可举出淀粉酶、蔗糖酶、α-和β-半乳糖苷酶、葡萄糖异构酶、α-和β-葡萄糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、α-和β-甘露糖苷酶、木聚糖酶等。这些微生物中，优选产生β-半乳糖苷酶的酵母。
上述微生物之中，作为产生β-半乳糖苷酶的酵母，可以举出掷孢酵母属、克鲁维酵母属、油脂酵母属、念珠菌属、隐球菌属、梗孢酵母(Sterigmatomyces)属、布勒拉孢菌属、本森顿酵母属、射出孢子形成酵母(Ballistosporomyces)属、フェロマイセス(Fellomyces)属、线黑粉酵母(Filobasidium)属、链担耳属、腥掷孢菌(Tilletiopsis)属、锁霉(Itersonilia)属、腥黑粉菌(Tilletia)属、啤酒酵母(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、汉森酵母(Hansenula)属、红酵母属、德巴利氏酵母(Debaryomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、球拟酵母(torulopsis)属等的酵母，特别优选掷孢酵母属、梗孢酵母属、克鲁维酵母属、隐球菌属、红酵母属、链担耳属、油脂酵母属，进一步优选属于掷孢酵母属、隐球菌属、红酵母属或链担耳属的微生物中的任意一种，特别是优选独特掷孢酵母、ステリグマトマイセス·エリビアエ(Sterigmatomyces elviae)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、红酵母(Rhodotorulalactosa)、小红酵母、大链担耳(Sirobasidium magnum)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，进而更优选独特掷孢酵母、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、红酵母(Rhodotorulalactosa)、大链担耳(Sirobasidium magnum)、小红酵母。
作为进一步优选使用的酵母的示例，可以举出独特掷孢酵母，作为其示例之一，独特掷孢酵母JCM5356可由理化学研究所生物资源中心(〒305-0074茨城县筑波市高野台3-1-1)有偿获取。
此外，作为其它示例，可以举出按照专利文献2记载的制作方法以β-半乳糖苷酶高产生变异微生物的形式得到的酵母。其中，具体地说，对于使用独特掷孢酵母JCM5356作为亲本株的由上述专利文献的工序(a)～(c)得到的酵母的示例，可以举出独特掷孢酵母ISK-＃4D4、独特掷孢酵母ISK-＃5A5、独特掷孢酵母ISK-＃2B6，它们于2002年4月10日分别作为FERM P-18818、FERM P-18819和FERM P-18817保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物包藏中心(〒305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。
在实施本发明的方法时，首先按照常规方法培养微生物，接下来使用例如德拉瓦尔型连续离心机或膜浓缩装置等进行集菌、清洗，制备微生物菌体液。
接下来按照常规方法向该微生物菌体液中加入作为稳定化剂的糖质并进行干燥即可。更具体地说，在利用喷雾干燥的情况下，向悬浮有微生物的微生物菌体液中加入必要量的糖质，在该状态下进行喷雾干燥，由此可得到目标微生物菌体干燥粉末。对于微生物菌体液中的菌体量并无特别限制，优选为1质量/体积%至10质量/体积%(下面简单示为“%”)、更优选为2%至6%。此外，对于所使用的糖质没有特别限制，可以使用单糖、2糖、3糖以上的低聚糖、多糖，作为单糖可示例出葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖；作为2糖可示例出乳糖、乳糖异构体、麦芽糖、蔗糖、海藻糖；作为3糖以上的低聚糖可以举出半乳低聚糖、麦芽低聚糖、果糖低聚糖等各种低聚糖；作为多糖可示例出糊精、淀粉。这些之中，从酶滴度的稳定化效果、干燥的容易性、和成本的方面考虑，优选为选自由乳糖、麦芽糖和糊精组成的组中的1种以上，特别优选使用乳糖和/或麦芽糖，进一步优选使用乳糖。
此时，对于在微生物菌体液中所添加的糖质的量没有特别限制，从酶滴度稳定化效果的方面考虑，优选相对于微生物菌体液为0.1%以上的量，更优选为0.5%以上的量，进一步优选为1%以上的量。另一方面，若微生物菌体液中所添加的糖质的量过多，则微生物菌体干燥粉末每单位重量的酶滴度会降低，因而糖质的量优选为30%以下、进一步优选为15%以下的量，更优选为10%以下的量、进一步优选为5%以下的量，进一步更优选为3%以下的量。基于上述理由，微生物菌体液中所添加的糖质的量相对于微生物菌体液优选为0.1%至30%的量、进一步优选为0.5%至15%的量，更优选为0.5%至10%的量、进一步优选为1%至10%的量，进一步更优选为1%至5%是量、更优选为1%至3%的量。
需要说明的是，在糖质可成为该酶的基质的情况下(例如，在产生β-半乳糖苷酶的微生物菌体液中加入作为稳定化剂的乳糖的情况下)，在从添加糖质到完成喷雾的期间，一部分或大部分糖质可能会发生反应，但不管反应的程度(分解度或聚合度)如何，糖质的效果均会得到发挥，因而并无特别问题。例如，在添加糖质后，即使在5℃～40℃进行1小时～40小时左右的反应，从酶滴度稳定化的方面考虑也是完全没有问题的。
此外，在糖质可成为该酶的基质的情况下，由于所添加的糖质会发生酶反应，因而在微生物菌体干燥粉末中除了含有所添加的糖质之外，有时还含有与之不同的糖质，但从酶滴度的稳定化的方面考虑是完全没有问题的。作为微生物菌体干燥粉末中所含有的糖质，可以举出单糖、2糖、3糖以上的低聚糖、多糖，作为单糖可示例出葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖；作为2糖可示例出乳糖、乳糖异构体、麦芽糖、蔗糖、海藻糖；作为3糖以上的低聚糖可示例出半乳低聚糖、果糖低聚糖等各种低聚糖；作为多糖可示例出糊精、淀粉。此外，在使用乳糖作为微生物菌体液中所添加的糖质的情况下，作为微生物菌体干燥粉末中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、半乳糖、乳糖、乳糖异构体、半乳低聚糖；在使用麦芽糖的情况下，作为微生物菌体干燥粉末中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖；在使用糊精的情况下，作为微生物菌体干燥粉末中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖、糊精；作为微生物菌体液中所添加的糖质，优选使用选自由乳糖、麦芽糖和糊精组成的组中的1种以上，因而在微生物菌体干燥粉末中优选含有选自由葡萄糖、半乳糖、乳糖、乳糖异构体、半乳低聚糖、麦芽糖、麦芽低聚糖、糊精组成的组中的1种以上的糖质。进一步地，作为微生物菌体液中所添加的糖质，更优选使用乳糖和/或麦芽糖，因而在微生物菌体干燥粉末中更优选含有选自由葡萄糖、半乳糖、乳糖、乳糖异构体、半乳低聚糖、麦芽糖、麦芽低聚糖组成的组中的1种以上的糖质。此外，由于更优选使用乳糖作为微生物菌体液中所添加的糖质，因而更优选含有选自由葡萄糖、半乳糖、乳糖、乳糖异构体、半乳低聚糖组成的组中的1种以上的糖质。
此外，作为喷雾干燥下的条件，只要为干燥室的入口·出口温度为酶不会显著失活的范围即可，此外，对于喷雾器转速、原液加料量等，根据其条件情况，可得到作为制品特性稍有不同的微生物菌体干燥粉末，但几乎不会影响最终的酶滴度，无需过多留意。具体地说，可示例出干燥室的入口温度为70℃～200℃、优选为110℃～180℃，出口温度为50℃～120℃、优选为70℃～90℃。此外可示例出喷雾器转速为10,000rpm～30,000rpm、原液加料量为0.2kg/小时～200kg/小时。这些喷雾干燥中，除喷雾器外，还可使用二流体喷嘴等喷雾方式来进行。需要说明的是，利用喷雾干燥法，在该干燥工序中微生物几乎全被杀死，可得到活菌数少的微生物菌体干燥粉末，因而是优选的。
另一方面，在利用冷冻干燥法的情况下，可利用常规方法向微生物菌体液中添加必要量的糖质，其后进行冷冻干燥。对于这种情况下的糖质添加量，相对于微生物菌体液也优选为0.1%至30%的量、进一步优选为0.5%至15%的量，更优选为0.5%至10%的量、进一步优选为1%至10%，进一步更优选为1%至5%的量、更优选为1%至3%的量。
如上所述得到的微生物菌体干燥粉末可在干燥状态下长期稳定保持该微生物所具有的酶活性。该微生物无论是活菌还是死菌均可，若考虑到微生物所产生的代谢物等所致的品质降低，则优选为死菌。
如上所述得到的微生物菌体干燥粉末含有相对于干燥微生物菌体为0.01倍量至30倍量的糖质，优选为0.05倍量至15倍量、进一步优选为0.05倍量至10倍量，更优选为0.1倍量至10倍量、进一步优选为0.1倍量至5倍量，进一步更优选为0.1倍量至3倍量。此外，对于其所含有的水含量没有特别限定，优选为10质量%以下。并且，干燥后的酶滴度优选为干燥前酶滴度的70%以上；在干燥方法为喷雾干燥的情况下，仅利用上述方法就可达成对酶滴度降低的抑制。需要说明的是，在冷冻干燥的情况下，与喷雾干燥不同，即使进行干燥酶滴度也不会降低，因而可以仅对微生物进行冷冻干燥而制成粉末，之后向其中添加粉末状的糖质。
此外，本发明中得到的微生物菌体干燥粉末具有即使在常温(25℃)下保存经过1年以上也可维持刚干燥后的微生物所具有的酶滴度这一特有效果。即，可长期维持刚干燥后的酶滴度的50%以上、进而80%～90%以上的高酶滴度。
迄今为止，已知为了提高微生物的存活率等，使用乳糖等作为赋形剂(专利文献3、4)；而本发明的方法中完全没有这样的提高/维持微生物的生存性等的想法，而是基于不同的技术思想而完成的。在本发明中，甚至可以说希望微生物自身死亡、而仅保存微生物所具有酶活性。
实施例
下面举出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。需要说明的是，在以下的实施例中，β-半乳糖苷酶滴度、残留水含量/固体成分含量、粒度分布和独特掷孢酵母的活菌数按下述方法测定。
(1)β-半乳糖苷酶滴度的测定法
(a)检测液的制备
在待测试样为浓缩液的情况下，在50mL容量的离心管中精确称量所述浓缩液约2.5g；此外，在待测试样为干燥物的情况下，在50mL容量的离心管中精确称量所述干燥物150mg～350mg左右，悬浮在50mM磷酸钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)(下文中称为“缓冲液”)中之后进行离心分离(20000G、15分钟)，清洗除去糖质。该清洗操作进行3次之后，转移到50mL容量瓶中，利用缓冲液进行定容、充分悬浮，作为检测液。
(b)测定
在100mL容量瓶中称量邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside；ONPG)0.3766g，在缓冲液中进行溶解·定容，制备12.5mM的溶液。在试验管中加入0.8mL该ONPG溶液，在30℃的恒温水槽中保持5分钟。向其中添加0.2mL检测液，充分混合，在30℃下反应10分钟后，加入0.25M碳酸钠溶液4mL，停止反应(试验系)。另外在试验管中加入ONPG溶液0.8mL与0.25M碳酸钠溶液4mL，进一步加入检测液0.2mL，充分混合(盲检系)。分别对试验系和盲检系进行离心分离(2000G、10分钟、15℃～20℃)，在波长420nm下对于所得到的上清进行吸光度测定，按照下式计算出单位数。需要说明的是，在上述反应条件下，将在1分钟内释放1μmol的o-硝基苯酚(o-nitrophenol；ONP)所需要的酶量作为1U。
【数1】
A1：试验液的吸光度
A2：盲检的吸光度
B：稀释倍率
此外，在对每单位干燥固体成分中的β-半乳糖苷酶滴度进行计算的情况下，使用按后述方法求出的固体成分含量来进行计算。
(2)残留水含量/固体成分含量
喷雾干燥时微生物菌体干燥粉末(下文中称为“干燥物”)的残留水分使用(株)Kett科学研究所制造的红外线水分计在105℃、15分钟的条件下进行测定。此外，对于在计算冷冻干燥物的固体成分含量和每单位量固体成分中的β-半乳糖苷酶滴度时所用的干燥原液与干燥物固体成分含量，由在105℃处理16小时时的干物重量进行计算。
(3)粒度分布
对于喷雾干燥物的粒度分布，使用Sympatec社制造的激光衍射式粒度分布测定装置(HELOS＆RODOS系统)进行干式测定。
(4)独特掷孢酵母活菌数
按照乳糖2.5%、酵母提取物0.5%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%、琼脂1.5%将它们溶解在水中，利用2N盐酸调整为pH5.0之后，进行高压釜灭菌(121℃、10分钟)，制作平底培养板(
Figure BDA0000374553440000082
90mm)。向其中涂抹利用生理食盐水溶解·稀释的样品100μL，在25℃培养约一周后，计数所生成的菌落，作为独特掷孢酵母活菌数。
实施例1
酵母菌体干燥粉末的制备：
将独特掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)YIT10047(ISK-＃＃2B6、下文中记为“Ss”)在含有葡萄糖5%、酵母提取物0.6%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)中于27℃进行4天好氧培养。将该培养液离心分离(10000G、30分钟)，向所得到的湿菌体中加入灭菌后的自来水进行充分悬浮。在相同条件下将其离心分离，将湿菌体利用少量的自来水悬浮，将该悬浮液作为Ss浓缩液(固体成分4.9%)。在Ss浓缩液20L中加入25%乳糖溶液5L然后充分进行搅拌，得到干燥原液。该操作在20℃以下进行。将该干燥原液作为试样使用，通过冷冻干燥法和喷雾干燥法制备酵母粉末。对于干燥原液中的固体成分含量(计算值)，Ss为约3.9%、乳糖为约5%。
喷雾干燥使用安装有旋转喷雾器的PILOT装置(PRODUCTION MINOR、GEAProcess Engineering(株))，在各种运转条件下实施喷雾干燥。其运转条件如表1所示。
此外，冷冻干燥使用冷冻干燥机RLE-206(共和真空技术(株))在棚温为25℃～30℃的条件下进行。
另外，将通过喷雾干燥和冷冻干燥得到的干燥物分别装入到带卡条(チャック付き)的塑料袋中并密闭，在5℃、25℃的恒温室中保存约1年，定期抽取一部分从而测定β-半乳糖苷酶滴度，由此来进行保存试验。
喷雾干燥后的物性试验：
对于通过喷雾干燥得到的干燥物，其具体的干燥条件和所得到的干燥物的评价示于表1。对于SD-1～3，尝试了通过降低旋转喷雾器的转速而增大液滴来变更干燥物粒度。此外，对于SD-4，尝试了通过将干燥温度提高5℃而增加加料量来提高生产效率。喷雾干燥的条件与所得到的制品的结果示于表1。
【表1】
Figure BDA0000374553440000091
由该结果可以明确，SD-1～3中，干燥后的滴度残存率(每单位量干燥物固体成分中的滴度相对于每单位量干燥原液固体成分中的滴度的比例)均较高、为95%左右，判断其为可实用化的水平。此外，在SD-4中，干燥温度上升5℃时，滴度残存率没有很大差异。
在Ss的喷雾干燥中，若将Ss浓缩液直接干燥，则每单位量的固体成分中的β-半乳糖苷酶滴度显著降低，因而可知，在干燥时通过添加乳糖可维持较高的酶滴度。
此外确认到，在SD-1～3中，随着喷雾器转速降低，平均粒径增大。
需要说明的是，尽管数据中未显示，但在使用这些干燥物进行实验室水平的低聚糖生成反应时，确认到糖组成的经时变化、到达终点所需要的时间等与干燥处理前的Ss浓缩液是同等的。
干燥物的保存试验：
对于喷雾干燥物与冷冻干燥物，在5℃、25℃进行约1年的保存试验。喷雾干燥物为干燥温度不同的SD-2与SD-4这2个被测物，冷冻干燥物为由Ss浓缩液[无乳糖：FD(-)]与干燥原液[乳糖5%：FD(+)]制备的2个被测物。对于各被测物每日进行经日采样，计算出滴度残存率(每单位量的保存后的干燥物固体成分中的滴度相对于每单位量的刚干燥后的干燥物固体成分中的滴度的比例)。喷雾干燥物的结果示于表2、图1，冷冻干燥物的结果示于表3、图2。
根据表2、图1的结果，在喷雾干燥物的保存中，SD-2与SD-4的稳定性同等，1年后的滴度残存率在5℃维持了试验开始时的大致100%，即使是在25℃也维持了95%左右。由该结果可知，喷雾干燥物的滴度稳定性非常高。另外确认到，保存1年后的4种喷雾干燥物的低聚糖生成能力与保存前等同。
此外，根据表3、图2的结果，在冷冻干燥物的保存中，稳定化剂(乳糖)的有无对滴度残存率有影响，在5℃、25℃时，添加了乳糖的FD(+)的滴度残存率均高于未添加乳糖FD(-)，保存1年后的滴度残存率为约85%～90%。
【表2】
SD-2(5°C) SD-2(25°C) SD-4(5°C) SD-4(25°C)
19天保存后 105.2 97.2 104.2 96.8
40天保存后 100.3 - 95.9 -
96天保存后 108.0 102.2 107.0 102.7
150天保存后 98.7 101.5 98.5 100.4
196天保存后 98.3 99.6 96.3 96.6
375天保存后 99.6 93.3 101.3 95.3
【表3】
FD(-)(5°C) FD(-)(25°C) FD(+)(5°C) FD(+)(25°C)
23天保存后 103.2 95.6 96.9 88.6
43天保存后 95.2 83.7 95.4 93.0
90天保存后 92.9 75.8 - -
183天保存后 86.9 61.5 92.7 85.3
356天保存后 80.4 47.2 89.4 84.3
实施例2
乳糖添加量的研究
酵母菌体干燥粉末的制备
在Ss浓缩液(固体成分5.0%)75mL中加入各种浓度的乳糖溶液25mL，按每份100mL制备含有乳糖0%～15%的干燥原液。使用二流体喷嘴式的实验用喷雾干燥装置(SD-1000、东京理科器械(株))，在入口温度：120℃、出口温度：约80℃、原液处理量：4mL/分钟的条件下对它们进行处理，回收包括附着在旋风分离器部的成分的物质，作为干燥物。
滴度的测定
对干燥原液、干燥物的滴度进行测定，计算出每单位量的干燥物固体成分中的滴度相对于每单位量的干燥原液固体成分中的滴度的比例(滴度残存率)。所得到的结果示于表4、表5、图3。
【表4】
SD-5 SD-6 SD-7 SD-8 SD-9 SD-10
乳糖浓度(%) 0 0.1 0.2 0.5 1 2
滴度残存率(%) 34.4 42.7 49.1 72.1 77.5 83.2
【表5】
SD-11 SD-12 SD-13 SD-14
乳糖浓度(%) 3 5 10 15
滴度残存率(%) 86.8 93.4 100.7 100.2
根据表4、表5、图3的结果，在整个干燥工序中作为滴度收率的指标的滴度残存率随着乳糖浓度的提高而提高，在0.1%以上的浓度下确认到效果，在0.5%以上的浓度下确认到明显效果。
实施例3
其他稳定化剂的研究：
(酵母菌体干燥粉末的制备)
对于糊精(NSD＃300、＃500；均来自San-ei Sucrochemical(株))、麦芽糖和乳糖进行喷雾干燥时的酶滴度维持效果(稳定化效果)的比较。在Ss浓缩液(固体成分5.0%)75mL中加入4%、20%、40%的稳定化剂溶液25mL，按每份100mL制备含有1%、5%、10%稳定化剂的干燥原液。使用二流体喷嘴式的实验用喷雾干燥装置(SD-1000、东京理科器械(株))，在入口温度：120℃、出口温度：约80℃、原液处理量：4mL/分钟的条件下对它们进行处理，回收包括附着在旋风分离器部的成分的物质，作为干燥物。
(滴度的测定)
对干燥原液与干燥物的滴度进行测定，计算出每单位量的干燥物固体成分中的滴度相对于每单位量的干燥原液固体成分中的滴度的比例(滴度残存率)。其结果示于表6。
【表6】
Figure BDA0000374553440000121
对于滴度残存率，共存有稳定化剂时高于未添加稳定化剂(34.4%、表4)时。特别是乳糖、麦芽糖等2糖类，它们的滴度残存率高于糊精；2糖类中，乳糖的滴度残存率高，可知其作为稳定化剂是优异的。
实施例4
糖组成的研究：
(酵母菌体干燥粉末的制备)
准备3份在Ss浓缩液(固体成分5.3%)7.8L中加入20%乳糖溶液2.6L并充分混合而成的液体，分别保持在10℃－1小时、5℃－40小时、40℃－18小时的条件下使其反应，制备糖组成不同的干燥原液。使用PILOT装置(PRODUCTION MINOR、GEAProcess Engineering(株))，在入口温度：120℃、出口温度：约80℃、喷雾器转速：12500rpm、原液处理量：4kg/小时的条件下将它们干燥。
(糖组成的分析)
在下述的HPLC条件下对反应后的干燥原液中的糖组成进行分析。其结果示于表7。
<HPLC条件>
柱：ShodexSUGAR KS-802(昭和电工(株)
溶剂：纯水
流速：0.5mL/分钟
温度：80℃
检测器：示差折射计
(滴度的测定)
对干燥原液与干燥物的滴度进行测定，计算出每单位量的干燥物固体成分中的滴度相对于每单位量的干燥原液固体成分中的滴度的比例(滴度残存率)。其结果示于表7。
【表7】
Figure BDA0000374553440000131
由表7的结果可知，不论乳糖与β-半乳糖苷酶的反应程度如何，均发挥出了滴度稳定效果。此外还确认到，能够利用单糖(葡萄糖、半乳糖)或半乳低聚糖作为稳定化剂。
实施例5
干燥温度的研究：
(酵母菌体干燥粉末的制备)
向Ss浓缩液(固体成分5.0%)中加入5N氢氧化钠溶液从而调整为pH4.5，在45℃保持9小时从而对Ss进行杀菌。在8L该液体中加入25%乳糖溶液2L进行充分混合，将混合液作为干燥原液，将干燥室的入口温度设为120℃、150℃、180℃，与其相对应地调整原液供给量以使出口温度为80℃，进行喷雾干燥。
(滴度的测定)
对干燥原液与干燥物的滴度进行测定，计算出每单位量的干燥物固体成分中的滴度相对于每单位量的干燥原液固体成分中的滴度的比例(滴度残存率)。其结果示于表8。
【表8】
120°C 150°C 180°C
滴度残存率(%) 103.6 96.8 90.7
原液供给量(kg/小时) 3.6 10.0 12.9
根据表8的结果，通过提高干燥时的入口温度，可使原液供给量增大，在入口温度为180℃时，为120℃时的约3.5倍。进而可知，即使将干燥时的入口温度设为180℃，干燥物的滴度也可维持90%以上，在该温度下可经济性良好地得到酵母菌体干燥粉末。
实施例6
对Ss以外的酵母的研究：
(酵母菌体干燥粉末的制备)
在26℃下，分别单独将罗伦隐球酵母(C.laurentii IFO18803)、红酵母(R.lactosaJCM1546)、大链担耳(S.magnum JCM6876)和小红酵母(R.minuta JCM8101)在含有乳糖5%、酵母提取物0.3%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)中进行好氧培养。对该培养液进行离心分离(10000G、30分钟)，在所得到的湿菌体中加入灭菌后的自来水进行充分悬浮。在相同条件下将其离心分离，将湿菌体悬浮在少量的自来水中，将悬浮液作为菌体浓缩液(固体成分约4%)。
向菌体浓缩液75mL中加入20%乳糖溶液25mL进行充分搅拌，制备干燥原液。该操作在20℃以下进行。除了该干燥原液之外，还使用水来代替乳糖溶液制备了干燥原液，对于各干燥原液利用喷雾干燥法制备得到酵母粉末。需要说明的是，对于干燥原液中的固体成分含量(计算值)，调整为菌体为约3%、乳糖为约5%。
喷雾干燥使用东京理科器械株式会社制造的二流体喷嘴型的喷雾干燥装置(SD-1000)，在干燥室的入口温度为120℃、出口温度为70℃～90℃下实施。
(滴度的测定)
对各酵母的干燥原液与干燥物的滴度进行测定，计算出每单位量的干燥物固体成分中的滴度相对于每单位量的干燥原液固体成分中的滴度的比例(滴度残存率)。此外，对于未添加乳糖的菌体浓缩液也同样地进行滴度测定，计算出滴度残存率。其结果示于表9。
【表9】
Figure BDA0000374553440000141
对于红酵母(R.lactosa)以外的3株酵母的喷雾干燥后的滴度残存率而言，与未添加乳糖时相比，添加乳糖5%时的滴度残存率均提高。对于红酵母，在添加乳糖5%时，滴度残存率为99.8%、极高。这些结果表明，通过添加乳糖所发挥出的抑制喷雾干燥后的β-gal滴度降低的效果并非特定于Ss，而是可广泛适用于酵母中的。
参考例
低聚糖生成试验：
(喷雾干燥物的悬浮液的制备)
称量相当于45U的量的上述实施例5中得到的干燥物(入口温度120℃)，将其加入到10ml的离子交换水中，进行悬浮从而得到悬浮液。
(低聚糖生成反应)
在60%乳糖溶液800mL中添加上述制备的干燥物的悬浮液的全部量然后进行混合，在65℃、pH6的条件下反应22小时。对此时的糖组成进行研究，结果示于表10。
【表10】
≥4糖 3糖 2糖 Glc Gla
1.0 30.0 58.0 10.7 0.3
如由表10的结果所明确，其示出了本发明的干燥物(微生物菌体干燥粉末)能够在低聚糖的生成反应中毫无实用性问题地进行使用。
工业实用性
利用本发明的方法得到的酵母菌体干燥粉末能够在干燥状态下长期稳定保持该酵母所具有的酶活性。即，即使在室温下保存，也能够保持干燥时的酶滴度而不会使其过分降低。
因而，在利用酵母所具有的酶活性时，处理简单、并且能够进行保存，因而无需根据需要进行生产，从而可在利用酶活性的产业中有利地进行应用。

Claims (13)

1.一种维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其特征在于，向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来对其进行干燥。
2.如权利要求1所述的维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其中，干燥为喷雾干燥或冷冻干燥。
3.如权利要求1或2所述的维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其中，将糖质按照相对于微生物菌体液为0.1质量/体积%至30质量/体积%进行添加。
4.如权利要求1至3任意一项所述的维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其中，干燥后的酶滴度为干燥前的酶滴度的70%以上。
5.如权利要求1至4任意一项所述的维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其中，在常温下保存1年后的酶滴度为刚干燥后的酶滴度的80%以上。
6.如权利要求1至5任意一项所述的维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其中，酶活性为β-半乳糖苷酶活性。
7.如权利要求1至6任意一项所述的维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其中，微生物为属于掷孢酵母属、隐球菌属、红酵母属或链担耳属中的任意一种微生物。
8.如权利要求1至7任意一项所述的维持了酶滴度的微生物菌体干燥粉末的制造方法，其中，糖质为选自由乳糖、麦芽糖和糊精组成的组中的1种以上。
9.一种能够长期保存的微生物菌体干燥粉末，其含有具有酶活性的微生物菌体、以及糖质。
10.如权利要求9所述的微生物菌体干燥粉末，其常温下保存1年后的酶滴度保持在刚干燥后的酶滴度的80%以上。
11.如权利要求9或10所述的微生物菌体干燥粉末，其中，糖质为选自由葡萄糖、半乳糖、乳糖、乳糖异构体、半乳低聚糖、麦芽糖、麦芽低聚糖和糊精组成的组中的1种以上。
12.如权利要求9至11任意一项所述的微生物菌体干燥粉末，其是通过向具有酶活性的微生物菌体液添加糖质、接下来对其进行干燥而得到的。
13.如权利要求9至12任意一项所述的微生物菌体干燥粉末，其中，干燥是利用喷雾干燥或冷冻干燥来进行的。
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