CN103562374A - 微生物的灭菌化方法 - Google Patents

微生物的灭菌化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103562374A
CN103562374A CN201280024214.1A CN201280024214A CN103562374A CN 103562374 A CN103562374 A CN 103562374A CN 201280024214 A CN201280024214 A CN 201280024214A CN 103562374 A CN103562374 A CN 103562374A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sterilizing
body fluid
enzyme
microbial bacteria
bacteria body
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201280024214.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103562374B (zh
Inventor
池田雅和
佐藤直
笠羽惠子
伊藤雅彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yakult Honsha Co Ltd
Original Assignee
Yakult Honsha Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yakult Honsha Co Ltd filed Critical Yakult Honsha Co Ltd
Publication of CN103562374A publication Critical patent/CN103562374A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103562374B publication Critical patent/CN103562374B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供能够容易地保存并利用具有酶活性的微生物菌体液的技术。该技术为下述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，该方法的特征在于，调整具有酶活性的微生物菌体液的pH，接下来将其加热处理；并且为下述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，该方法的特征在于，向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来将其加热处理。

Description

微生物的灭菌化方法
技术领域
本发明涉及微生物的灭菌化方法，更具体地说，本发明涉及在维持具有酶活性的微生物菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法。
背景技术
在微生物中，大量存在具有有用酶活性的微生物，在糖质、氨基酸、磷脂等功能性食品材料的制造中进行广泛应用。其中，已知有许多微生物可在糖质材料、特别是寡糖的制造中进行利用，例如，有人报告利用属于独特掷孢酵母(Sporobolomycessingularis)的酵母菌所具有的β-半乳糖苷酶活性来制造低聚半乳糖(专利文献1)。
然而，微生物通常通过加热处理进行灭菌化后进行保存等，在对上述这样的具有酶活性的微生物进行加热处理的情况下，微生物被灭菌化，但酶活性也会显著降低，具有实际上无法使用的问题。此外，作为在维持酶活性的情况下进行灭菌化的技术，有人还报告了将转化后的微生物利用25℃～35℃的醇等化学药品进行灭菌化并同时维持其酶活性的技术(专利文献2)，但该技术中要利用进行了基因重组的微生物、或者残存有灭菌化的处理中使用的醇等，因而具有灭菌化后的用途受限的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公平5-58714号公报
专利文献2：日本特开2002-355028号公报
发明内容
发明所要解决的课题
因而，本发明的课题在于提供一种能够容易地保存和利用具有酶活性的微生物菌体液的技术。
解决课题的手段
本发明人为了解决这样的问题对微生物基于加热处理所致的灭菌化的条件进行了深入研究，结果发现，通过在用于将具有酶活性的微生物菌体液中的微生物灭菌化的加热处理前调整pH、或在加热处理时有糖质存在，能够在维持酶效价的情况下进行灭菌化，从而完成了本发明。此外还发现，如上所述进行了灭菌化的微生物菌体液维持了灭菌化前的微生物菌体液的酶效价，从而完成了本发明。
即，本发明涉及一种在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其特征在于，调整具有酶活性的微生物菌体液的pH，接下来将其加热处理。
此外，本发明涉及一种灭菌化微生物菌体液，其特征在于，其维持了灭菌化前的微生物菌体液的酶效价。
进一步地，本发明涉及一种在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其特征在于，向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来将其加热处理。
本发明还进一步涉及一种灭菌化微生物菌体液，其含有糖质、且维持了灭菌化前的微生物菌体液的酶效价。
发明效果
利用本发明的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，能够在维持具有酶活性的微生物菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化。此外，利用该方法能提高酶的热稳定性，能够在更宽的温度条件下在维持酶效价的同时进行灭菌化。因此，能够容易地对灭菌化后的微生物菌体液进行保存和利用。即，在微生物存活的情况下，在保存中会由微生物产生一些代谢物，微生物菌体液的品质会降低，可能还会对酶效价的保存稳定性带来影响；而在灭菌化的情况下，则不会产生这类问题，因而灭菌化微生物菌体液的酶效价的保存稳定性优异。
此外，本发明的灭菌化微生物菌体液是在维持酶活性的状态下被灭菌化的，因而能够容易地保存和利用。
进一步地，在使上述灭菌化微生物菌体液干燥来制成灭菌化微生物菌体干燥粉末时，能够在更长期间下稳定地保存和利用。
附图说明
图1为示出了实施例9中在乳糖浓度2质量/体积%下将Ss浓缩液在45℃或50℃下保持5小时进行加热处理后的效价残存率的图。
图2为示出了实施例9中在乳糖浓度2质量/体积%下将Ss浓缩液在45℃或50℃下保持18小时进行加热处理后的效价残存率的图。
图3为示出了实施例9中在乳糖浓度5质量/体积%下将Ss浓缩液在45℃或50℃下保持5小时进行加热处理后的效价残存率的图。
图4为示出了实施例9中在乳糖浓度5质量/体积%下将Ss浓缩液在45℃或50℃下保持18小时进行加热处理后的效价残存率的图。
图5为示出了实施例11中使用各种浓度的氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液调整Ss培养液的pH后的效价残存率的图。
具体实施方式
本发明的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法(下面称为“本发明方法”)可以通过下述方法实施：调整具有酶活性的微生物菌体液的pH，接下来将其加热处理的方法(下面称为“本发明方法1”)；或者向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来将其加热处理的方法(下面称为“本发明方法2”)。
根据本发明方法，作为灭菌化的微生物，例如为细菌、酵母、霉菌等微生物，只要为在细胞壁上结合酶、或者在菌体内和/或菌体外产生酶的微生物也即具有酶活性的微生物，就没有特别限定。作为这些具有酶活性的微生物，可以举出例如：属于链球菌属、乳酸菌属、芽胞杆菌属、双歧杆菌属等的细菌；属于掷孢酵母属、布勒掷孢酵母属、克鲁维酵母属、油脂酵母属、假丝酵母属、隐球菌属、梗孢酵母属、本森顿酵母属、掷孢霉菌属(バリストスポロマイセス属)、Fellomyces(フェロマイセス)属、线黑粉酵母属、链担耳属、腥掷孢菌属、锁霉属、腥黑粉菌属、酵母属、裂殖酵母属、汉森酵母属、赤酿母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母菌属等的酵母。此外，作为酶，可以举出例如淀粉酶、蔗糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖异构酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、木聚糖酶等糖质分解酶等的酶。
上述具有酶活性的微生物中，优选具有β-半乳糖苷酶活性的微生物。作为这样的微生物，可以举出：属于掷孢酵母属、布勒掷孢酵母属、克鲁维酵母属、油脂酵母属、假丝酵母属、隐球菌属、梗孢酵母属、本森顿酵母属、掷孢霉菌属、Fellomyces属、线黑粉酵母属、链担耳属、腥掷孢菌属、锁霉属、腥黑粉菌属、酵母属、裂殖酵母属、汉森酵母属、赤酿母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母菌属等的酵母；属于链球菌属、乳酸菌属、芽胞杆菌属、双歧杆菌属的细菌。
此外，上述具有β-半乳糖苷酶活性的微生物中，优选酵母或细菌，特别是进一步优选酵母。作为具体的具有β-半乳糖苷酶活性的酵母，特别可以举出独特掷孢酵母、艾尔维梗孢酵母(Sterigmatomyces elviae)、罗伦隐球酵母、红酵母、大链担耳、产油油脂酵母。作为具体的具有β-半乳糖苷酶活性的细菌，特别可以举出嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳链球菌、唾液乳杆菌、赖氏乳杆菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌。
作为特别优选使用的具有β-半乳糖苷酶活性的酵母，可以举出独特掷孢酵母，作为其一例的独特掷孢酵母JCM5356(ATCC24193)可由理化学研究所BioResourceCenter(邮编351-0198日本国埼玉县和光市广泽2-1)或ATCC(10801UniversityBoulevard Manassas,VA20110USA)等有偿获得。
此外，作为独特掷孢酵母的其它示例，可以举出利用日本特开2003-325166号公报所记载的制作方法以β-半乳糖苷酶高产突变微生物的形式得到的酵母。其中，具体地说，以使用上述独特掷孢酵母JCM5356作为亲本株通过上述专利文献的工序(a)～(c)而得到的酵母为例，可以举出独特掷孢酵母ISK-＃4D4、独特掷孢酵母ISK-＃5A5、独特掷孢酵母ISK-＃＃2B6，它们于2002年4月10日分别以FERM P-18818、FERMP-18819和FERM P-18817保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。
上述将微生物灭菌化的本发明方法中，对于调节具有酶活性的微生物菌体液的pH、接下来将其加热处理的方法(本发明方法1)进行说明。在本发明方法1的实施中，首先按照常规方法利用培养基等对具有酶活性的微生物进行培养，得到培养液。该培养液可直接作为微生物菌体液使用，也可以使用离心分离装置或膜浓缩装置等适当进行清洗·浓缩，将浓缩液作为微生物菌体液使用。该微生物菌体液的固体成分含量没有特别限定，具体可示例出0.5%～10%。需要说明的是，本说明书中的“固体成分含量”是指微生物菌体液中的菌体的固体成分含量，例如，在微生物菌体液中含有培养基成分的情况下，来自该培养基成分的固体成分不包括在本说明书中的“固体成分含量”中。
接下来调整该微生物菌体液的pH。pH的范围没有特别限定，但从能够在更宽的温度范围中更高地维持酶效价的方面考虑，优选为3.5～6.5、更优选为4.2～6.3、进一步优选为4.5～5.7。该pH的调整中所用的物质没有特别限定，酸、碱、盐均可使用，具体地说，适宜使用盐酸、乙酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等水溶液或磷酸钠缓冲液等各种缓冲液；从pH调整后效价不会降低的方面考虑，优选使用碳酸盐，更优选使用选自由碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾和碳酸氢铵组成的组中的1种或2种以上碳酸盐。
需要说明的是，从进一步提高酶的热稳定性、能够更高地维持酶效价的方面考虑，优选在pH调整前向微生物菌体液中添加糖质、和/或在pH调整后且加热处理前向微生物菌体液中添加糖质。此处所使用的糖质没有特别限制，单糖、2糖、3糖以上的寡糖、多糖均可使用。作为单糖，可以举出葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖等；作为2糖，可以举出乳糖、乳糖异构体、麦芽糖、蔗糖、海藻糖等；作为3糖以上的寡糖，可以举出低聚半乳糖、麦芽低聚糖、低聚果糖等各种寡糖等；作为多糖，可以举出糊精、淀粉等。这些糖质中，从酶效价的维持效果或成本的方面考虑，优选为选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖、低聚半乳糖和糊精组成的组中的1种以上，特别优选使用选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖和低聚半乳糖组成的组中的1种以上。在微生物菌体液中添加的糖质的量没有特别限制，糖质添加量的下限相对于微生物菌体液例如优选为0.2质量/体积%(下文中简称为“%”)以上、更优选为0.5%以上、进一步优选为2%以上。此外，向微生物菌体液中添加糖质的时期、方法也没有特别限定，例如可以举出添加另外制备的糖质的浓溶液的方法；但若向微生物菌体液中添加的糖质溶液的量过多，则微生物菌体液中的菌体浓度变得稀薄，可能会产生每单位重量的微生物菌体液中的酶效价降低的问题，由于该原因，糖质添加量的上限优选为30%以下、更优选为15%以下、进一步优选为10%以下。根据上述内容，添加到微生物菌体液中的糖质的量优选为0.2%～30%、更优选为0.5%～15%、进一步优选为0.5%～10%、特别优选为2%～10%。
此外，在添加至微生物菌体液中的糖质可作为该酶的底物的情况下(例如，在向具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的菌体液中添加乳糖的情况下)，从糖质添加到加热处理结束为止，糖质的一部分或大部分也可能会进行酶反应，但是，不论反应程度(分解度或聚合度)如何，均可发挥出基于添加糖质所致的效果，因而从酶效价稳定化的方面考虑完全没有问题。例如，在糖质添加后，不论是保持该状态或是进行冷却处理或加热处理，从酶效价稳定化的方面考虑，均完全没有问题。此外，在上述情况下，在微生物菌体液中可能会含有通过所添加的糖质进行酶反应而生成的其它糖质，即使存在有这样的糖质，从酶效价稳定化的方面考虑也完全没有问题。作为添加到微生物菌体液中的糖质进行酶反应而生成的糖质，可以举出单糖、2糖、3糖以上的寡糖、多糖，作为单糖可以举出葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖等，作为2糖可以举出乳糖、乳糖异构体、麦芽糖、蔗糖、海藻糖等，作为3糖以上的寡糖可以举出低聚半乳糖、低聚果糖等各种寡糖，作为多糖可以举出糊精、淀粉等。具体地说，在添加到具有糖质分解酶(例如β-半乳糖苷酶)活性的微生物菌体液中的糖质为乳糖的情况下，由于乳糖会进行酶反应，因而作为微生物菌体液中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、半乳糖、乳糖、乳糖异构体、低聚半乳糖；在所添加的糖质为麦芽糖的情况下，作为微生物菌体液中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖；在所添加的糖质为糊精的情况下，作为微生物菌体液中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖、糊精。需要说明的是，由于优选使用选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖、低聚半乳糖和糊精组成的组中的1种以上作为添加在微生物菌体液中的糖质，因而在添加了这些糖质的微生物菌体液中优选含有这些糖质和由这些糖质进行酶反应而生成的糖质，具体地说，优选含有选自由乳糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖异构体、低聚半乳糖、麦芽糖、麦芽低聚糖和糊精组成的组中的1种以上的糖质。此外，由于更优选使用选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖和低聚半乳糖组成的组中的1种以上作为添加在微生物菌体液中的糖质，因而更优选在微生物菌体液中含有选自由乳糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖异构体、低聚半乳糖、麦芽糖和麦芽低聚糖组成的组中的1种以上的糖质。
如上所述进行了pH调整后，进行加热处理。加热处理的方法没有特别限定，可以应用连续进行的基于板式热交换装置的方法、通过分批处理进行的利用加热蒸气或温水对装入有菌体液的罐进行加热的方法等，为了进行温度调节从而尽量防止酶的失活，优选通过分批处理进行的利用加热蒸气或温水对装入有菌体液的罐进行加热的方法。对于分批处理时的加热处理，只要为可在维持酶效价的情况下将微生物灭菌化的条件就没有特别限定，优选为40℃～50℃、更优选为40℃～48℃、进一步优选为40℃～46℃。此外，在分批处理中，在pH调整前向微生物菌体液中添加糖质和/或在pH调整后且加热处理前向微生物菌体液中添加糖质的情况下，优选为40℃～60℃、更优选为40℃～55℃、进一步优选为40℃～50℃。此外，加热时间也没有特别限定，优选为1小时以上、更优选为6小时以上。但是，由于若加热时间过长则酶效价有时会降低，因而优选为24小时以下、更优选为20小时以下、进一步优选为18小时以下。根据上述内容，加热时间优选为1小时～24小时、更优选为1小时～20小时、进一步优选为1小时～18小时、再一步优选为6小时～24小时、进而优选为6小时～20小时、再优选为6小时～18小时。此外，在加热处理前添加了糖质的情况下，加热时间优选为1小时～24小时、进一步优选为4小时～20小时、更优选为5小时～18小时。需要说明的是，本发明方法1中的灭菌化是指微生物的活菌通过加热处理降低至1000cfu/mL以下，希望降低至优选为100cfu/mL以下、更优选为10cfu/mL以下。
此外，通过如上所述进行加热处理，在维持微生物菌体液的酶效价的情况下将微生物菌体液中的微生物灭菌化。此处的维持酶效价是指加热处理后(灭菌化后)的酶效价为加热处理前(灭菌化前)的酶效价的80%以上，优选为90%以上、更优选为95%以上。
加热处理后的微生物菌体液(灭菌化微生物菌体液)可以在25℃以下、优选0℃～5℃的低温条件下长期保存。并且，这些加热处理后的微生物菌体液能够在利用酶活性的各种用途中加以利用。
此外，对于加热处理后的微生物菌体液，可以进一步利用喷雾干燥、冷冻干燥等公知的干燥手段进行干燥，制成灭菌化微生物菌体干燥粉末。此时，为了防止干燥工序或干燥后的保存所致的酶效价的降低，也可以向加热处理后的微生物菌体液中添加糖质。作为所使用的糖质没有特别限制，单糖、2糖、3糖以上的寡糖、多糖均可使用。作为单糖可以举出葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖等，作为2糖可以举出乳糖、乳糖异构体、麦芽糖、蔗糖、海藻糖等，作为3糖以上的寡糖可以举出低聚半乳糖、麦芽低聚糖、低聚果糖等各种寡糖，作为多糖可以举出糊精、淀粉等。这些糖质中，从酶效价的维持效果、干燥的容易性或成本的方面考虑，优选使用选自由乳糖、麦芽糖和糊精组成的组中的1种以上，特别优选使用乳糖和/或麦芽糖，进一步优选使用乳糖。所添加的糖质的量没有特别限定，糖质添加量的下限相对于微生物菌体液例如优选为0.1%以上、更优选为0.5%以上、进一步优选为1%以上。若在微生物菌体液中添加的糖质量过多，则在将微生物菌体液制成干燥粉末的情况下，每单位重量的微生物菌体干燥粉末的酶效价会降低，因而糖质添加量的上限优选为30%以下、更优选为15%以下、进一步优选为10%以下、再一步优选为5%以下、更进一步优选为3%以下。根据上述内容，添加在微生物菌体液中的糖质的量相对于微生物菌体液优选为0.1%～30%、更优选为0.5%～15%、进一步优选为0.5%～10%、进而优选为1%～10%、进而更优选为1%～5%、再一步优选为1%～3%。此外，糖质的添加方法没有特别限定，例如可举出添加另外制备的糖质的浓溶液的方法。干燥的程度没有特别限定，例如可进行至干燥粉末中的水含量大致为10%以下为止。利用该干燥，与液体的情况相比，可在维持刚干燥后酶效价的80%以上的酶效价的情况下保存更长期间、例如可保存1年以上。此外，这些灭菌化微生物菌体干燥粉末能够在利用酶活性的各种用途中加以利用。
需要说明的是，作为上述喷雾干燥的条件，对于干燥室的入口·出口温度，只要为酶不会显著失活的范围即可；此外，对于喷雾器转速、原液加料量等，尽管依其条件情况可得到作为制品的特性稍有不同的微生物菌体干燥粉末，但由于对最终的酶效价几乎没有影响，因而无需过分留意。具体地说，可示例出干燥室的入口温度为70℃～200℃、优选为110℃～180℃、出口温度为50℃～120℃、优选为70℃～90℃。此外，喷雾器转速可示例出10,000rpm～30,000rpm、原液加料量可示例出0.2kg/小时～200kg/小时。对于这些喷雾干燥，除了喷雾器外，也可以使用二流体喷嘴等喷雾方式来进行。需要说明的是，从可在工业上连续生产的方面考虑，优选使用喷雾干燥法。
上述得到的加热处理后的微生物菌体液和灭菌化微生物菌体干燥粉末可分别单独或组合含有来制成酶组合物。在该酶组合物中，还可在不会影响酶活性的范围内添加稀释剂、赋形剂、表面活性剂、防腐剂等。并且，该酶组合物也能够在利用酶活性的各种用途中加以利用。
接下来，对上述的将微生物灭菌化的本发明方法中的向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质、接下来将其加热处理的方法(本发明方法2)进行说明。在本发明方法2的实施中，首先按照常规方法利用培养基等对具有酶活性的微生物进行培养，得到培养液。该培养液可直接作为微生物菌体液使用，也可进一步使用离心分离装置或膜浓缩装置等适当进行清洗·浓缩，将浓缩液作为具有酶活性的微生物菌体液使用。该微生物菌体液的固体成分含量没有特别限定，具体可示例出0.5%～10%。需要说明的是，如上所述，本说明书中的“固体成分含量”是指微生物菌体液中的菌体的固体成分含量，例如，在微生物菌体液中含有培养基成分的情况下，来自该培养基成分的固体成分不包括在本说明书中的“固体成分含量”中。
接下来向该微生物菌体液中添加糖质。此处所使用的糖质没有特别限制，单糖、2糖、3糖以上的寡糖、多糖均可使用。作为单糖，可以举出葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖等；作为2糖，可以举出乳糖、乳糖异构体、麦芽糖、蔗糖、海藻糖等；作为3糖以上的寡糖，可以举出低聚半乳糖、麦芽低聚糖、低聚果糖等各种寡糖等；作为多糖，可以举出糊精、淀粉等。这些糖质中，从酶效价的维持效果或成本的方面考虑，优选为选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖、低聚半乳糖和糊精组成的组中的1种以上，特别优选使用选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖和低聚半乳糖组成的组中的1种以上。添加到微生物菌体液中的糖质的量没有特别限制，糖质添加量的下限相对于微生物菌体液例如优选为0.2%以上、更优选为0.5%以上、进一步优选为2%以上。此外，向微生物菌体液中添加糖质的时期、方法也没有特别限定，例如可举出添加另外制备的糖质的浓溶液的方法；但若向微生物菌体液中添加的糖质溶液的量过多，则微生物菌体液中的菌体浓度变得稀薄，可能会产生每单位重量的微生物菌体液中的酶效价降低的问题，由于该原因，糖质添加量的上限优选为30%以下、更优选为15%以下、进一步优选为10%以下。根据上述内容，添加到微生物菌体液中的糖质的量优选为0.2%～30%、更优选为0.5%～15%、进一步优选为0.5%～10%、特别优选为2%～10%。
如上所述向微生物菌体液中添加了糖质后，进行加热处理。加热处理的方法没有特别限定，可以应用连续进行的基于板式热交换装置的方法、通过分批处理进行的利用加热蒸气或温水对装入有菌体液的罐进行加热的方法等，为了进行温度调节从而尽量防止酶的失活，优选通过分批处理进行的利用加热蒸气或温水对装入有菌体液的罐进行加热的方法。对于分批处理时的加热处理，只要为可在维持酶效价的情况下将微生物灭菌化的条件就没有特别限定，优选为40℃～60℃、更优选为40℃～55℃、进一步优选为40℃～50℃。并且，加热时间也没有特别限定，优选为1小时以上、更优选为4小时以上、进一步优选为5小时以上。但是，由于若加热时间过长则酶效价有时会降低，因而优选为24小时以下、更优选为20小时以下、进一步优选为18小时以下。根据上述内容，加热时间优选为1小时～24小时、进一步优选为4小时～20小时、更优选为5小时～18小时。需要说明的是，本发明方法2中的灭菌化是指微生物的活菌通过加热处理降低至1000cfu/mL以下，希望降低至优选为100cfu/mL以下、更优选为10cfu/mL以下。
此外，通过如上所述进行加热处理，在维持微生物菌体液的酶效价的情况下将微生物菌体液中的微生物灭菌化。此处的维持酶效价是指加热处理后(灭菌化后)的酶效价为加热处理前(灭菌化前)的酶效价的80%以上，优选为90%以上、更优选为95%以上。
需要说明的是，在添加至微生物菌体液中的糖质可作为该酶的底物的情况下(例如，在向具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的菌体液中添加乳糖的情况下)，从糖质添加到加热处理结束为止，糖质的一部分或大部分也可能会进行酶反应，但是，不论反应程度(分解度或聚合度)如何，均可发挥出添加糖质所致的效果，因而从酶效价稳定化的方面考虑完全没有问题。例如，在糖质添加后，不论是保持该状态或是进行冷却处理或加热处理，从酶效价稳定化的方面考虑，均完全没有问题。此外，在上述情况下，在微生物菌体液中可能会含有通过所添加的糖质进行酶反应而生成的其它糖质，即使存在有这样的糖质，从酶效价稳定化的方面考虑也完全没有问题。作为微生物菌体液中所含有的糖质，可以举出单糖、2糖、3糖以上的寡糖、多糖，作为单糖可以举出葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖等，作为2糖可以举出乳糖、乳糖异构体、麦芽糖、蔗糖、海藻糖等，作为3糖以上的寡糖可以举出低聚半乳糖、低聚果糖等各种寡糖，作为多糖可以举出糊精、淀粉等。具体地说，在添加到具有糖质分解酶(例如β-半乳糖苷酶)活性的微生物菌体液中的糖质为乳糖的情况下，由于乳糖会进行酶反应，因而作为微生物菌体液中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、半乳糖、乳糖、乳糖异构体、低聚半乳糖；在所添加的糖质为麦芽糖的情况下，作为微生物菌体液中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖；在所添加的糖质为糊精的情况下，作为微生物菌体液中所含有的糖质，可以举出葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖、糊精。需要说明的是，由于优选使用选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖、低聚半乳糖和糊精组成的组中的1种以上作为添加在微生物菌体液中的糖质，因而在添加了这些糖质的微生物菌体液中优选含有这些糖质和由这些糖质进行酶反应而生成的糖质，具体地说，优选含有选自由乳糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖异构体、低聚半乳糖、麦芽糖、麦芽低聚糖和糊精组成的组中的1种以上的糖质。此外，由于更优选使用选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖和低聚半乳糖组成的组中的1种以上作为添加在微生物菌体液中的糖质，因而更优选在微生物菌体液中含有选自由乳糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖异构体、低聚半乳糖、麦芽糖和麦芽低聚糖组成的组中的1种以上的糖质。
加热处理后的微生物菌体液(灭菌化微生物菌体液)可以在25℃以下、优选0℃～5℃的低温条件下长期保存。并且，这些加热处理后的微生物菌体液能够在利用酶活性的各种用途中加以利用。
此外，对于加热处理后的微生物菌体液，可以进一步利用喷雾干燥、冷冻干燥等公知的干燥手段进行干燥，制成灭菌化微生物菌体干燥粉末。干燥的程度没有特别限定，例如可进行至干燥粉末中的水含量大致为10%以下为止。利用该干燥，与液体的情况相比，可在维持刚干燥后酶效价的80%以上的酶效价的情况下保存更长期间、例如可保存1年以上。此外，这些灭菌化微生物菌体干燥粉末能够在利用酶活性的各种用途中加以利用。
需要说明的是，作为上述喷雾干燥的条件，对于干燥室的入口·出口温度，只要为酶不会显著失活的范围即可；此外，对于喷雾器转速、原液加料量等，尽管依其条件情况可得到作为制品的特性稍有不同的微生物菌体干燥粉末，但由于对最终的酶效价几乎没有影响，因而无需过分留意。具体地说，可示例出干燥室的入口温度为70℃～200℃、优选为110℃～180℃、出口温度为50℃～120℃、优选为70℃～90℃。此外，喷雾器转速可示例出10,000rpm～30,000rpm、原液加料量可示例出0.2kg/小时～200kg/小时。对于这些喷雾干燥，除了喷雾器外，也可以使用二流体喷嘴等喷雾方式来进行。需要说明的是，从可在工业上连续生产的方面考虑，优选使用喷雾干燥法。
上述得到的加热处理后的微生物菌体液和灭菌化微生物菌体干燥粉末可分别单独或组合含有来制成酶组合物。在该酶组合物中，还可在不会影响酶活性的范围内添加稀释剂、赋形剂、表面活性剂、防腐剂等。并且，该酶组合物也能够在利用酶活性的各种用途中加以利用。
实施例
下面举出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。需要说明的是，在以下的实施例中，按下述方法测定和分析β-半乳糖苷酶效价、固体成分含量、微生物菌体干燥粉末的残留水分、粒度分布、独特掷孢酵母的活菌数和糖组成。
(1)β-半乳糖苷酶效价的测定法
(a)检液的制备
在50mL容量瓶中精确称量约2.5g～约6.0g的微生物菌体液，利用50mM磷酸钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)(下文中称为“缓冲液”)定容，使其充分溶解或悬浮，制成检液。此外，在微生物菌体液含有糖质(乳糖)的情况下，在50mL容量的离心管中精确称量其约2.5g，悬浮在缓冲液中之后，离心分离(20,000G、15分钟)进行清洗，除去糖质。该清洗操作进行3次后，转移至50mL容量瓶中，利用缓冲液定容，使其充分悬浮，制成检液。进一步地，在待检试样为微生物菌体干燥粉末(下文中称为“干燥品”)的情况下，将其约150mg～350mg利用同样的操作清洗后制成检液。
(b)测定
在100mL容量瓶中称量邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside；ONPG)0.3766g，在缓冲液中进行溶解·定容，制备12.5mM的溶液。向试验管中加入该ONPG溶液0.8mL，在30℃的恒温水槽中保持5分钟。向其中添加检液0.2mL进行良好混合，在30℃下反应10分钟后，加入0.25M碳酸钠溶液4mL停止反应(试验系)。另外地向试验管中加入ONPG溶液0.8mL与0.25M碳酸钠溶液4mL，进一步加入检液0.2mL进行良好混合(盲检系)。分别对试验系和盲检系施以离心分离(2,000G、10分钟、15℃～20℃)，在波长420nm下对于所得到的上清进行吸光度测定，通过下式计算出单位数。需要说明的是，将在上述反应条件下在1分钟内释放出1μmol的邻硝基苯酚(o-nitrophenol；ONP)所需要的酶量作为1U。
[数1]
Figure BDA0000417114730000121
A1：试验液的吸光度
A2：盲检的吸光度
B：稀释倍率
*U/g
(2)固体成分含量
在铝盘中精确称量5g～10g、或5mL～10mL灭菌化处理前后的微生物菌体液，在105℃下干燥16小时。由该操作中的干燥前后的重量计算出固体成分含量(质量%)。此外，在喷雾干燥中，对于在计算单位固体成分中的β-半乳糖苷酶效价时所用的干燥原液与干燥品的固体成分含量，也在同样的条件下求得。需要说明的是，在微生物菌体液为培养液时(含有培养基成分时)，在离心管中精确称量，进行离心清洗除去培养基成分后，将全部量的清洗菌体转移至铝盘中，利用与上述同样的操作进行干燥，计算出固体成分含量。
(3)残留水分量
喷雾干燥中的干燥品的残留水分量使用(株)Kett科学研究所制造的红外线水分计在105℃、15分钟的条件下进行测定。
(4)粒度分布
对于干燥品的粒度分布，使用Sympatec社制造的激光衍射式粒度分布测定装置(HELOS＆RODOS系统)进行干式测定。
(5)独特掷孢酵母的活菌数
按照乳糖为2.5%、酵母浸膏为0.5%、磷酸一钾为0.1%、硫酸镁为0.05%、琼脂为1.5%进行溶解，利用2N盐酸调整为pH5.0后，进行高压釜灭菌(121℃、10分钟)，制作平板(φ90mm)。在其上涂抹100μL利用生理盐水溶解·稀释后的样品，在25℃下培养约1周后，计数活菌菌落，作为独特掷孢酵母的活菌数。
(6)糖组成分析
对于糖组成，使用HPLC在下述条件下分析。
[HPLC条件]
柱：Shodex SUGAR KS-802(昭和电工(株))
溶剂：纯水
流速：0.5mL/分钟
温度：80℃
检测器：差示折射计
实施例1
微生物的灭菌化：
(1)培养
将独特掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)YIT10047(ISK-＃＃2B6、下文中记为“Ss”)利用含有葡萄糖5%、酵母浸膏1.0%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)在27℃下进行4天好氧培养。将该培养液离心分离(10000G、30分钟)，向所得到的湿菌体中加入灭菌的自来水进行充分悬浮。在相同条件下将其离心分离，将湿菌体悬浮在少量的自来水中，以使固体成分含量为5%左右，将悬浮液作为Ss浓缩液。
(2)灭菌化<pH与加热温度的研究>
利用5N氢氧化钠溶液将上述(1)中得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.0%)的pH阶段性地调整为3.5～6.3。将它们与pH未调整(pH3.1)的Ss浓缩液在35℃、40℃、45℃、50℃或55℃下保持18小时，进行加热处理。加热处理前后的Ss活菌数的结果和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表1。
[表1]
Figure BDA0000417114730000151
-：未试验
在将pH调整为3.5、4.0后进行加热处理的情况下，在40℃～45℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率在45℃为80%以上、在40℃为90%以上。此外，在pH3.5的情况下，在35℃也被灭菌化，且效价残存率为90%以上。在调整为pH4.2、4.7、5.0、5.8或6.3进行加热处理的情况下，在40℃～45℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率为90%以上。另一方面，在未进行pH的调整而进行加热处理的情况(pH3.1)下，在40℃的加热温度下Ss被灭菌化，且虽效价残存率为90%以上，但其值为92.2%，与进行了pH调整的情况相比，效价残存率低。进一步地，在45℃时，效价残存率低于80%，可推测，相比于其它pH条件，能够进行灭菌化且可维持酶效价的温度条件窄了5℃以上。
(3)灭菌化<加热温度的详细研究>
将与上述(1)同样得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.6%)的pH利用5N氢氧化钠溶液调整为4.0、4.5、4.9、5.7或6.5。将它们在44℃、46℃、48℃、50℃或52℃保持5小时或18小时，进行加热处理。加热处理前后的Ss的活菌数和效价残存率的结果列于表2(加热处理5小时)、表3(加热处理18小时)。
[表2]
Figure BDA0000417114730000161
[表3]
对于5小时的加热处理，在调整为pH4.0后进行加热处理的情况下，在44℃～48℃的加热温度下，Ss被灭菌化，且效价残存率在48℃时为80%以上、在44℃～46℃时为90%以上。在调整为pH4.5后进行加热处理的情况下，在46℃～50℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率在50℃时为80%以上、在46℃～48℃时为90%以上。在调整为pH4.9或5.7后进行加热处理的情况下，在44℃～50℃的加热温度下，Ss被灭菌化，且效价残存率为90%以上。特别是在46℃～50℃的加热温度下，Ss为10cfu/mL以下。在调整为pH6.5后进行加热处理的情况下，在44℃～48℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率在48℃时为80%以上、在44℃～46℃时为90%以上。特别是在46℃～48℃时Ss为10cfu/mL。
此外，对于18小时的加热处理，在调整为pH4.0后进行加热处理的情况下，在44℃～46℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率在46℃时为80%以上、在44℃时为90%以上。在调整为pH4.5、4.9或5.7后进行加热处理的情况下，在44℃～48℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率在48℃时为80%以上、在44℃～46℃时为90%以上。在调整为pH6.5后进行加热处理的情况下，在44℃～46℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率为90%以上。
(4)灭菌化<加热时间的研究>
将与上述(1)同样地得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.0%)的pH利用5N氢氧化钠溶液调整为4.5，保持在40℃或45℃下进行加热处理。加热处理中的Ss的活菌数的经时测定结果列于表4。
[表4]
Figure BDA0000417114730000171
Ss活菌数在40℃、45℃的加热温度下均经时减少，在40℃的加热处理下，在6小时为1000cfu/mL以下、在9小时为10cfu/mL以下。此外，在45℃的加热处理下，在1小时为1000cfu/mL以下、在2小时为10cfu/mL以下。
(5)灭菌化<与乳糖的组合>
对于与上述(1)同样地得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.6%)，制备利用5N氢氧化钠溶液调整为pH4.5的样品、按1%添加乳糖的样品(未进行pH调整)、按1%添加乳糖后将pH调整为4.5的样品这3种，在50℃下保持18小时进行加热处理(试验I)。还利用同样的操作实施添加2%乳糖的情况(试验II)。各Ss悬浮液的效价残存率列于表5。需要说明的是，加热处理后的Ss活菌数全部为10cfu/mL以下。
[表5]
仅调整pH 仅添加乳糖 pH调整+乳糖添加
试验I 61.8 72.0 87.9
试验II 62.9 84.3 94.4
在试验I、II中，与进行pH调整或乳糖添加的单独处理时的效价残存率相比，组合进行了pH调整与乳糖添加时的效价残存率均更高。可知基于pH调整的效价稳定效果在乳糖存在下也并未改变而仍可发挥，并且效价残存率增高。
实施例2
干燥品的制备：
将与实施例1同样地得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.3%)的pH利用5N氢氧化钠溶液调整为4.5，在40℃下保持18小时，进行加热处理。向该灭菌化Ss浓缩液7.8L中加入8%、20%、40%乳糖溶液2.6L进行充分混合，制备固体成分含量为Ss：约4%、乳糖：2%、5%、10%的干燥原液。使用喷雾干燥的中试装置(PRODUCTION MINOR、GEA Process Engineering(株))，在入口温度：120℃、出口温度：约80℃、喷雾器转速：12,500rpm、原液处理量：4Kg/小时的条件下，分别将这些干燥原液与未添加乳糖的灭菌化Ss浓缩液进行干燥，得到良好的干燥品。它们的效价残存率(干燥品的单位固体成分的效价相对于干燥原液的单位固体成分的效价的比例)、平均粒径、残留水分的测定结果列于表6。
[表6]
在干燥原液中的乳糖浓度为0～10%时，得到了干燥后的效价残存率为90%以上的干燥品。需要说明的是，这些干燥品的Ss活菌数均为10cfu/mL以下，加热处理前后的效价残存率均为90%以上。
实施例3
寡糖生成试验：
(1)干燥品的悬浮液的制备
在上述实施例2中得到的干燥品中，分别称量45U相当量的制品1与制品2，将它们分别加入到10ml的离子交换水中进行悬浮。
(2)寡糖生成反应
将上述(1)中制备的干燥品的悬浮液的总量或利用与实施例1相同的方法得到的Ss浓缩液的45U相当量分别添加到60%乳糖溶液800mL中进行混合，在65℃、pH6的条件下反应22小时。研究此时的糖组成，将结果列于表7。
[表7]
Figure BDA0000417114730000191
在干燥品的悬浮液与Ss浓缩液(活菌悬浮液)中，所生成的糖组成或反应速度没有很大差别，可知能够将干燥品用于寡糖的制造中。
实施例4
微生物的灭菌化：
(1)培养
与实施例1的(1)同样地得到Ss浓缩液(固体成分含量5.8%)。
(2)灭菌化<乳糖的浓度与加热温度的研究>
将上述(1)中得到的Ss浓缩液与乳糖溶液按3：1混合，制备含有0.2%～15%乳糖的Ss浓缩液。将它们与未添加乳糖的Ss浓缩液在35℃、40℃、45℃、50℃或55℃下保持18小时，进行加热处理。加热处理前后的Ss的活菌数的测定结果和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表8。
[表8]
Figure BDA0000417114730000201
-：未试验
在添加0.2%乳糖并进行加热处理的情况下，在40℃～45℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率在45℃时为80%以上、在40℃时为90%以上。在添加0.5%～1%乳糖并进行加热处理的情况下，在40℃～45℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率为90%以上。在添加2%～5%乳糖并进行加热处理的情况下，在40℃～50℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率为90%以上。在添加10%～15%乳糖并进行加热处理的情况下，在40℃～55℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率为90%以上。另一方面，在未添加乳糖就进行加热处理的情况下，在40℃的加热温度下Ss被灭菌化，且效价残存率为90%以上，但45℃时的效价残存率低于80%，可推测，相比于添加了乳糖的情况，能够灭菌化且可维持酶效价的温度条件窄了5℃以上。
(3)灭菌化<糖质的种类的研究>
对于糊精(NSD＃300、San-ei Sucrochemical(株))、低聚半乳糖3糖以上成分、乳糖、麦芽糖和葡萄糖，比较进行灭菌化时的酶活性的稳定化效果。将与上述(1)同样地得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.6%)与8%、20%的糖质溶液以3：1混合，制备含有2%或5%糖质的Ss浓缩液。将它们在45℃或50℃下保持18小时，进行加热处理。加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表9。需要说明的是，加热处理前的Ss活菌数为108cfu/mL，但在加热处理后，在任何糖质、任何浓度下均降低至10cfu/mL以下，被灭菌化。
[表9]
Figure BDA0000417114730000211
糖质无添加时的效价残存率在45℃的加热温度下为72.7%、在50℃的加热温度下为29.5%。与此相对，在有任一糖质共存时，效价残存率高，除了在50℃的加热温度下共存有糊精的情况以外，其它的效价残存率均提高至80%以上。
(4)灭菌化<加热时间的研究>
将与上述(1)同样地得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.0%)与20%乳糖溶液以3：1混合，制备含有5%乳糖的Ss浓缩液，保持在40℃、45℃下进行加热处理。加热处理中的Ss的活菌数的经时测定结果列于表10。
[表10]
Figure BDA0000417114730000212
Ss活菌数在40℃、45℃的加热温度下均经时减少，在40℃的加热处理中，在4小时为1000cfu/mL以下、在5小时为10cfu/mL以下。此外，在45℃的加热处理中，在1小时为10cfu/mL以下。
(5)灭菌化<糖组成的研究>
将与上述(1)同样地得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.3%)与8%、20%、40%乳糖溶液以3：1混合，制备含有2%、5%、10%乳糖的Ss浓缩液。将它们在40℃下保持18小时进行加热处理。在下述的HPLC条件下对加热处理后的糖组成进行分析。其结果列于表11。此外，对加热处理前的效价进行测定，残存效价的计算结果也一并列于表11。需要说明的是，加热处理前的Ss活菌数为108cfu/mL，加热处理后均降低至10cfu/mL以下，被灭菌化。
[表11]
对于含有乳糖的Ss浓缩液(活菌悬浮液)，在加热处理中乳糖受到β-半乳糖苷酶的作用，但可知不管其反应程度如何，均能维持效价稳定效果。此外还确认到，即使在Ss浓缩液中存在有由所添加的乳糖进行酶反应而生成的单糖(葡萄糖、半乳糖)或低聚半乳糖，酶效价的稳定化也没有问题，还确认到单糖或低聚半乳糖可作为糖质加以利用。
实施例5
干燥品的制备：
将与实施例1同样地得到的Ss浓缩液(固体成分含量5.3%)与8%、20%、40%乳糖溶液以3：1进行混合，制备固体成分含量为Ss：4%、乳糖：2%、5%、10%的干燥原液。将它们在40℃下保持18小时，进行加热处理。使用喷雾干燥的中试装置(PRODUCTION MINOR、GEA Process Engineering(株))，在入口温度：120℃、出口温度：约80℃、喷雾器转速：12500rpm、原液处理量：4Kg/小时的条件下对该灭菌化Ss浓缩液进行干燥，得到良好的干燥品。对它们的效价残存率(干燥品的单位固体成分的效价相对于干燥原液的单位固体成分的效价的比例)、平均粒径、残留水分进行测定。其结果列于表12。
[表12]
Figure BDA0000417114730000231
在干燥原液中的乳糖浓度为2%～10%时，得到了干燥后的效价残存率为90%以上的微生物菌体干燥品。需要说明的是，这些干燥品的Ss活菌数均为10cfu/mL以下，加热处理前后的效价残存率均为90%以上。
实施例6
寡糖生成试验：
(1)干燥品的悬浮液的制备
在上述实施例5中得到的干燥品中，分别称量45U相当量的制品5与制品6，将它们分别加入到10ml的离子交换水中进行悬浮。
(2)寡糖生成反应
将上述(1)中制备的干燥品的悬浮液的总量或利用与实施例1相同的方法得到的Ss浓缩液45U相当量分别添加到60%乳糖溶液800mL中进行混合，在65℃、pH6的条件下反应22小时。研究此时的糖组成，将结果列于表13。
[表13]
Figure BDA0000417114730000232
在干燥品的悬浮液与Ss浓缩液(活菌悬浮液)中，所生成的糖组成没有很大差别，可知能够将干燥品用于寡糖的制造中。
实施例7
微生物的灭菌化：
(1)培养
与实施例1的(1)同样地得到Ss浓缩液(固体成分含量5.2%)。
(2)灭菌化<乳糖的浓度与加热温度的研究>
将上述(1)中得到的Ss浓缩液与乳糖溶液按3：1混合，制备含有2%～5%乳糖的Ss浓缩液。将它们与未添加乳糖的Ss浓缩液在50℃下保持18小时，进行加热处理。加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表14。需要说明的是，加热处理后的Ss活菌数均为10cfu/ml以下。
[表14]
乳糖浓度(w/v) 效价残存率(%)
2% 85.2
3% 95.8
4% 98.2
5% 102.0
在乳糖浓度为2%～5%时，效价残存率高于80%。此外可知，在乳糖浓度为3%以上时，效价残存率高于90%。
实施例8
微生物的灭菌化：
(1)培养
实施例1的(1)同样地得到了Ss浓缩液(固体成分含量5.4%)。
(2)灭菌化<与乳糖的组合>
对于上述(1)中得到的Ss浓缩液，制备利用2N氢氧化钠溶液调整为pH4.5的样品、按1%添加乳糖的样品(未进行pH调整)、按1%添加乳糖后将pH调整为4.5的样品这3种，在45℃下保持18小时进行加热处理(试验III)。还利用同样的操作实施添加2%乳糖的情况(试验IV)。各Ss悬浮液的效价残存率列于表15。需要说明的是，加热处理后的Ss活菌数全部为10cfu/mL以下。
[表15]
仅调整pH 仅添加乳糖 pH调整+乳糖添加
试验III 97.2 100.2 102.9
试验IV 98.3 102.0 103.1
在试验III、IV中，与进行pH调整或乳糖添加的单独处理时的效价残存率相比，组合进行了pH调整与乳糖添加时的效价残存率均更高。可知基于pH调整的效价稳定效果在乳糖存在下也未改变而仍可发挥，并且效价残存率增高。
(3)灭菌化<与乳糖的组合>
对于上述(1)中得到的Ss浓缩液，制备利用2N氢氧化钠溶液调整为pH4.5、5.0、5.5的样品、按2%添加乳糖的样品(未进行pH调整)、按2%添加乳糖后将pH调整为4.5、5.0、5.5的样品这3种，在50℃保持5小时或18小时进行加热处理。各Ss悬浮液的效价残存率列于表16。需要说明的是，加热处理后的Ss活菌数全部为10cfu/mL以下。
[表16]
Figure BDA0000417114730000251
在各情况下，与进行pH调整或乳糖添加的单独处理时的效价残存率相比，组合进行了pH调整与乳糖添加时的效价残存率均更高。并且，在加热保持时间为18小时的情况下，通过调整为pH4.5～5.5，即使在乳糖为2%时效价残存率也为90%以上。
实施例9
微生物的灭菌化：
(1)培养
将Ss在含有葡萄糖2%、酵母浸膏0.4%、磷酸一钾0.05%、硫酸镁0.025%的培养基(pH5)中于27℃进行4天好氧培养。将该培养液离心分离(10000G、30分钟)，向所得到的湿菌体中加入灭菌的自来水进行充分悬浮。在相同条件下将其离心分离，向所得到的湿菌体中加入乳糖溶液和灭菌水，制备含有2%或5%乳糖、且菌体浓度为2.5%、4.5%和6.5%(w/v)的Ss浓缩液。
(2)灭菌化<乳糖的浓度与加热温度的研究>
将上述(1)中得到的Ss浓缩液在45℃或50℃保持5小时或18小时，进行加热处理。加热处理前后的Ss的活菌数的测定和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)示于图1～4。
在各菌体浓度下，灭菌化后的效价残存率均为80%以上，效价残存率未确认到差异。特别是在乳糖浓度为5%的情况下，在各菌体浓度下，灭菌化后的效价残存率均为90%以上。
实施例10
微生物的灭菌化：
(1)培养
将Ss利用含有葡萄糖4%、酵母浸膏0.8%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)在27℃下进行4天好氧培养，得到Ss培养液(固体成分含量2.5%)。
(2)灭菌化
利用2N氢氧化钠溶液将上述(1)中得到的Ss培养液的pH阶段性地调整为3.5～5.0。将它们与未进行pH调整的Ss培养液在40℃或45℃下保持5小时或18小时，进行加热处理。加热处理后的Ss的活菌数的结果和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表17。
[表17]
Figure BDA0000417114730000271
在各培养液中，均是灭菌化处理时的pH越高则效价残存率越增高。此外，在各培养液中，满足效价残存率为80%以上、Ss活菌数为10cfu/ml以下的均是pH调整为4.0以上、在45℃进行5小时加热处理的情况。此外，调整为pH5.0、在45℃下进行18小时加热处理的情况也满足上述效价残存率的条件。
实施例11
pH调节剂的研究：
(1)培养
将Ss利用含有葡萄糖4%、酵母浸膏0.8%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)在27℃进行4天好氧培养，得到Ss培养液(固体成分含量2.8%)。
(2)pH调整
向上述(1)中得到的Ss培养液中滴加0.5N、2N或5N氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液、10%或20%碳酸钠溶液将pH调整为5.0。pH调整后的β-半乳糖苷酶效价相对于pH调整前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)见图5。
在使用氢氧化钠或氢氧化钠作为pH调节剂的情况下，在刚调整pH后效价降低7%～8%。另一方面，在使用碳酸钠作为pH调节剂的情况下，几乎没有发生效价降低。
实施例12
pH调节剂的研究：
(1)培养
将Ss利用含有葡萄糖5%、酵母浸膏1%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)在27℃进行4天好氧培养，得到Ss培养液(固体成分含量2.5%)。
(2)灭菌化
利用2N氢氧化钠或20%碳酸钠溶液将上述(1)中得到的Ss培养液的pH阶段性地调整为4.0～5.0。将它们在40℃或45℃下保持5小时或18小时，进行加热处理。加热处理后的Ss的活菌数和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)列于表18。
[表18]
Figure BDA0000417114730000291
对于灭菌化处理前后的效价残存率和Ss活菌数，未确认到pH调节剂所致的差异。
实施例13
干燥品的制备：
(1)Ss浓缩液的制备
将Ss利用含有葡萄糖4%、酵母浸膏0.8%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)在27℃进行4天好氧培养。对该培养液进行离心分离(10000G、30分钟)，回收菌体浓缩液。向其中加入灭菌的自来水充分悬浮进行清洗后，在相同条件下进行离心分离，调整成固体成分为5%左右，将其作为Ss浓缩液(固体成分含量5.1%)。
(2)Ss培养液的制备
将Ss利用含有葡萄糖4%、酵母浸膏0.8%、磷酸一钾0.1%、硫酸镁0.05%的培养基(pH5)在27℃下进行4天好氧培养，得到Ss培养液。
(3)Ss浓缩液的灭菌化(pH调整)
将上述(1)中得到的Ss浓缩液的pH利用20%碳酸钠溶液调整为4.8±0.2。将该Ss浓缩液在45℃保持7小时，进行加热处理。加热处理后的Ss的活菌数的结果和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表19。此外，在即将干燥前在灭菌化的Ss浓缩液中以5：1混合24%乳糖溶液，制备含有4%乳糖的干燥原液。
(4)Ss浓缩液的灭菌化(乳糖共存)
将上述(1)中得到的Ss浓缩液与24%乳糖溶液以5：1混合，制备含有4%乳糖的Ss浓缩液。将该Ss浓缩液在50℃保持7小时，进行加热处理。加热处理后的Ss的活菌数的结果和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表19。将灭菌化后的Ss浓缩液直接作为干燥原液。
(5)Ss浓缩液的灭菌化(pH调整·乳糖共存的合用)
将上述(1)中得到的Ss浓缩液与24%乳糖溶液按10：1混合，制备含有2.2%乳糖的Ss浓缩液。进一步地将该Ss浓缩液的pH利用20%碳酸钠溶液调整为4.8±0.2。将该Ss浓缩液在50℃保持7小时，进行加热处理。加热处理后的Ss的活菌数的结果和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表19。此外，在即将干燥前在灭菌化的Ss浓缩液中以11：1混合24%乳糖溶液，制备含有4%乳糖的干燥原液。
(6)Ss培养液的灭菌化(pH调整)
将上述(2)中得到的Ss培养液的pH利用20%碳酸钠溶液调整为4.8±0.2。将该Ss培养液在45℃下保持7小时，进行加热处理。加热处理后的Ss的活菌数的结果和加热处理后的β-半乳糖苷酶效价相对于加热处理前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)的结果列于表19。此外，对灭菌化后的Ss培养液进行离心分离(16000G)，回收湿菌体。向其中加入灭菌的自来水进行充分悬浮，将固体成分调整为5%左右，得到灭菌化的Ss浓缩液(固体成分含量5.2%)。在即将干燥前在该灭菌化的Ss浓缩液中以5：1混合24%乳糖溶液，制备含有4%乳糖的干燥原液。
(7)喷雾干燥
使用喷雾干燥的中试装置(PRODUCTION MINOR、GEA ProcessEngineering(株))，在入口温度：120℃、出口温度：80℃、喷雾器转速：15000rpm、原液处理量：约4.5kg/小时的条件对上述(3)～(6)中得到的干燥原液进行干燥，得到良好的干燥品。对这些干燥品的效价残存率、平均粒径、残留水分进行测定。其结果列于表19。
[表19]
Figure BDA0000417114730000311
在全部的灭菌化条件下，均得到了效价残存率为90%以上、且Ss活菌数小于10cfu/ml的良好的干燥品。
实施例14
保存试验：
将实施例2中制备的干燥品(制品1～3)和实施例5中制备的干燥品(制品5～7)分别在5℃或25℃下保存360天。对保存后的β-半乳糖苷酶效价相对于保存前的β-半乳糖苷酶效价的比例(效价残存率)进行测定。其结果列于表20。
[表20]
Figure BDA0000417114730000312
可知即使在5℃或25℃下保存360天，效价残存率也为80%以上。
实施例15
微生物的灭菌化：
除了不使用Ss而使用独特掷孢酵母JCM5356(ATCC24193)以外，与实施例1同样地进行微生物的灭菌化，结果效价残存率等得到了大致同样的结果。例如，在pH5.0、45℃下进行加热处理时，效价残存率为80%以上。
实施例16
灭菌化<糖组成的研究>：
除了不使用Ss而使用独特掷孢酵母JCM5356(ATCC24193)以外，与实施例4同样地进行微生物的灭菌化，结果效价残存率等得到了大致同样的结果。例如，在乳糖浓度5%、45℃下进行加热处理时，效价残存率为80%以上。
工业实用性
根据本发明方法，能够在维持具有酶活性的微生物菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化。因此，利用本发明方法处理后的微生物菌体液的操作简单，并且能够保存，因而能够有利地在利用酶活性的产业中加以利用。

Claims (42)

1.一种在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其特征在于，调整具有酶活性的微生物菌体液的pH，接下来将其加热处理。
2.如权利要求1所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，将微生物菌体液的pH调整为3.5～6.5。
3.如权利要求1或2所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，加热处理在40℃～50℃进行1小时以上。
4.如权利要求1～3的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，微生物具有β-半乳糖苷酶活性。
5.如权利要求1～4的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，微生物为酵母。
6.如权利要求5所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，酵母为独特掷孢酵母。
7.如权利要求1～6的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，加热处理后的酶效价为加热处理前的酶效价的80%以上。
8.如权利要求1～7的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，在pH调整前向微生物菌体液中添加糖质、和/或在pH调整后且加热处理前向微生物菌体液中添加糖质。
9.如权利要求8所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，糖质以0.2质量/体积%～30质量/体积%进行添加。
10.如权利要求1～9的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，使用碳酸盐进行pH调整。
11.一种灭菌化微生物菌体液，其特征在于，其维持了灭菌化前的微生物菌体液的酶效价。
12.如权利要求11所述的灭菌化微生物菌体液，其中，微生物具有β-半乳糖苷酶活性。
13.如权利要求11或12所述的灭菌化微生物菌体液，其中，微生物为酵母。
14.如权利要求13所述的灭菌化微生物菌体液，其中，酵母为独特掷孢酵母。
15.如权利要求11～14的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，灭菌化后的酶效价为灭菌化前的酶效价的80%以上。
16.如权利要求11～15的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，维持了酶效价的灭菌化微生物菌体液是如下得到的：调整具有酶活性的微生物菌体液的pH，接下来将其加热处理。
17.如权利要求16所述的灭菌化微生物菌体液，其中，将微生物菌体液的pH调整为3.5～6.5。
18.如权利要求16或17所述的灭菌化微生物菌体液，其中，加热处理在40℃～50℃进行1小时以上。
19.如权利要求16～18的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，在pH调整前向微生物菌体液中添加糖质、和/或在pH调整后且加热处理前向微生物菌体液中添加糖质。
20.如权利要求19所述的灭菌化微生物菌体液，其中，糖质以0.2质量/体积%～30质量/体积%进行添加。
21.如权利要求16～20的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，使用碳酸盐进行pH调整。
22.一种灭菌化微生物菌体干燥粉末，其是通过将权利要求11～21的任一项所述的灭菌化微生物菌体液干燥而得到的。
23.一种酶组合物，其含有权利要求11～21的任一项所述的灭菌化微生物菌体液和/或权利要求22所述的灭菌化微生物菌体干燥粉末。
24.一种在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其特征在于，向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来将其加热处理。
25.如权利要求24所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，加热处理在40℃～55℃进行1小时以上。
26.如权利要求24或25所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，微生物具有β-半乳糖苷酶活性。
27.如权利要求24～26的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，微生物为酵母。
28.如权利要求27所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，酵母为独特掷孢酵母。
29.如权利要求24～28的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，糖质以0.2质量/体积%～30质量/体积%进行添加。
30.如权利要求24～29的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，糖质为选自由乳糖、葡萄糖、麦芽糖、低聚半乳糖和糊精组成的组中的1种以上。
31.如权利要求24～30的任一项所述的在维持菌体液的酶效价的情况下将微生物灭菌化的方法，其中，加热处理后的酶效价为加热处理前的酶效价的80%以上。
32.一种灭菌化微生物菌体液，其特征在于，其含有糖质且维持了灭菌化前的微生物菌体液的酶效价。
33.如权利要求32所述的灭菌化微生物菌体液，其中，微生物具有β-半乳糖苷酶活性。
34.如权利要求32或33所述的灭菌化微生物菌体液，其中，微生物为酵母。
35.如权利要求34所述的灭菌化微生物菌体液，其中，酵母为独特掷孢酵母。
36.如权利要求32～35的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，糖质以0.2质量/体积%～30质量/体积%包含在所述灭菌化微生物菌体液中。
37.如权利要求32～36的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，糖质为选自由乳糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖异构体、低聚半乳糖、麦芽糖、麦芽低聚糖和糊精组成的组中的1种以上。
38.如权利要求32～37的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，灭菌化后的酶效价为灭菌化前的酶效价的80%以上。
39.如权利要求32～38的任一项所述的灭菌化微生物菌体液，其中，含有糖质且维持了酶效价的灭菌化微生物菌体液是如下得到的：向具有酶活性的微生物菌体液中添加糖质，接下来将其加热处理。
40.如权利要求39所述的灭菌化微生物菌体液，其中，加热处理在40℃～55℃进行1小时以上。
41.一种灭菌化微生物菌体干燥粉末，其是通过将权利要求32～40的任一项所述的灭菌化微生物菌体液干燥而得到的。
42.一种酶组合物，其含有权利要求32～40的任一项所述的灭菌化微生物菌体液和/或权利要求41所述的灭菌化微生物菌体干燥粉末。
CN201280024214.1A 2011-05-20 2012-05-18 微生物的灭菌化方法 Active CN103562374B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-113171 2011-05-20
JP2011113171 2011-05-20
JP2011113170 2011-05-20
JP2011-113170 2011-05-20
PCT/JP2012/062746 WO2012161108A1 (ja) 2011-05-20 2012-05-18 微生物の死菌化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103562374A true CN103562374A (zh) 2014-02-05
CN103562374B CN103562374B (zh) 2016-10-12

Family

ID=47217185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280024214.1A Active CN103562374B (zh) 2011-05-20 2012-05-18 微生物的灭菌化方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20140113350A1 (zh)
EP (1) EP2711416B1 (zh)
JP (2) JP5901625B2 (zh)
KR (1) KR102014732B1 (zh)
CN (1) CN103562374B (zh)
AU (1) AU2012260004B2 (zh)
WO (1) WO2012161108A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101920899B1 (ko) * 2011-04-14 2019-02-13 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤 미생물 균체 건조분말의 제조방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003144144A (ja) * 2001-11-09 2003-05-20 Mitsui Chemicals Inc 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法
JP2006262865A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Showa Sangyo Co Ltd 分岐構造を有する３〜４糖類を含む非還元糖質及び／又は／還元糖質の新規用途、並びに臭い低減剤と製造方法
JP2008255296A (ja) * 2007-04-09 2008-10-23 Nippon Shokubai Co Ltd 液体洗浄剤組成物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62208293A (ja) 1986-03-07 1987-09-12 Yakult Honsha Co Ltd ビフイドバクテリウム菌増殖促進因子の製造法
JP3130972B2 (ja) 1991-08-30 2001-01-31 京セラ株式会社 セラミック基板およびその製造方法
JPH11169179A (ja) * 1997-12-17 1999-06-29 Yakult Honsha Co Ltd β−ガラクトシダーゼ、その製造方法、及び該β−ガラクトシダーゼを含有する発酵乳
JP4039041B2 (ja) 2000-12-04 2008-01-30 住友化学株式会社 死菌化方法
JP4071037B2 (ja) 2002-05-09 2008-04-02 株式会社ヤクルト本社 β−ガラクトシダーゼ高産生変異微生物の作出方法および当該方法により作出される変異微生物ならびにその利用
JP2006223268A (ja) * 2005-02-21 2006-08-31 Yakult Honsha Co Ltd ガラクトシル２糖類の製造法
KR101920899B1 (ko) * 2011-04-14 2019-02-13 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤 미생물 균체 건조분말의 제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003144144A (ja) * 2001-11-09 2003-05-20 Mitsui Chemicals Inc 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法
JP2006262865A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Showa Sangyo Co Ltd 分岐構造を有する３〜４糖類を含む非還元糖質及び／又は／還元糖質の新規用途、並びに臭い低減剤と製造方法
JP2008255296A (ja) * 2007-04-09 2008-10-23 Nippon Shokubai Co Ltd 液体洗浄剤組成物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEHRAN MIROLIAEI ET AL.: "Thermal denaturation of yeast alcohol dehydrogenase and protection of secondary and tertiary structural changes by sugars: CD and fluorescence studies", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》, 31 December 2007 (2007-12-31) *
杨小民 等: "不同糖对纤维素酶保护的机理研究", 《清华大学学报(自然科学版)》, vol. 40, no. 2, 31 December 2000 (2000-12-31) *
谢毅 等: "乳酸克鲁维酵母(Kluveromces lactis ) β -半乳糖苷酶的稳定性研究", 《复旦学报(自然科学版)》, vol. 38, no. 5, 31 October 1999 (1999-10-31) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2711416A1 (en) 2014-03-26
EP2711416A4 (en) 2014-12-31
US20180362948A1 (en) 2018-12-20
AU2012260004B2 (en) 2016-11-10
US10760066B2 (en) 2020-09-01
US20140113350A1 (en) 2014-04-24
CN103562374B (zh) 2016-10-12
KR102014732B1 (ko) 2019-08-27
WO2012161108A1 (ja) 2012-11-29
JPWO2012161108A1 (ja) 2014-07-31
JP6067800B2 (ja) 2017-01-25
KR20140010392A (ko) 2014-01-24
JP2015192683A (ja) 2015-11-05
JP5901625B2 (ja) 2016-04-13
AU2012260004A1 (en) 2014-01-16
EP2711416B1 (en) 2017-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103403141B (zh) 微生物菌体干燥粉末的制造方法
Degeest et al. Effect of medium composition and temperature and pH changes on exopolysaccharide yields and stability during Streptococcus thermophilus LY03 fermentations
Goodell et al. Suppression of lytic effect of beta lactams on Escherichia coli and other bacteria.
AU2001258817B2 (en) New cyclodextrin glucanotransferase, method of manufacturing same, and method of manufacturing cyclodextrin employing this enzyme
CN100469892C (zh) 葡聚糖的生产方法和制备方法
Roscoe et al. The biosynthesis of 5-hydroxymethyldeoxyuridylic acid in bacteriophage-infected Bacillus subtilis
AU2006311107A1 (en) Process for the production of oligosaccharides
Yu et al. Immobilization of whole cells of Lactococcus lactis containing high levels of a hyperthermostable β-galactosidase enzyme in chitosan beads for efficient galacto-oligosaccharide production
CN115521889A (zh) 一株产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌WL02及其用途
Perdana et al. Inactivation of Lactobacillus plantarum WCFS1 during spray drying and storage assessed with complementary viability determination methods
Van Alphen et al. Pores in the outer membrane of Escherichia coli K12. Involvement of proteins b and c in the permeation of cephaloridine and ampicillin
CN103562374A (zh) 微生物的灭菌化方法
TW202128571A (zh) 污泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製劑、污泥分解方法及污泥分解裝置
Weinhäusel et al. A new maltodextrin-phosphorylase from Corynebacterium callunae for the production of glucose-1-phosphate
TWI784019B (zh) 半乳糖寡糖的製造方法
Cheung et al. Monovalent cations enable cell wall turnover of the turnover-deficient lyt-15 mutant of Bacillus subtilis
Sani et al. Characterization and some reaction-engineering aspects of thermostable extracellular β-galactosidase from a new Bacillus species
JP6713607B2 (ja) グリコーゲンホスホリラーゼ製剤の製造方法
Wannasutta et al. Identification of endophytic actinobacteria from Jerusalem artichoke and examination of inulinase gene and enzyme properties
Al-Zahrani et al. Isolation and identification of Lactobacillus plantarum KM5 from camel milk for β-galactosidase production
Mowafi Fermentation of different sugars by Bifidobacteria
JPS6119483A (ja) アルカリ性セルラ−ゼの製造法
이동구 Enzymatic production of functional indigestible isomaltooligosaccharides using glucansucrases from Leuconostoc mesenteroides B-512FMCM and L. mesenteroides NRRL B-1355CF10
JPH062057B2 (ja) 新規β−ガラクトシダ−ゼＡ及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant