JPH03151875A - β―ガラクトシダーゼの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、β−ガラクトシダーゼ産生能のある微生物が
産生したβ−ガラクトシダーゼを菌体から取り出すこと
なく酵素反応に利用するためにβ−ガラクトシダーゼ含
有菌体を保存する場合および有機溶媒処理や界面活性剤
処理を施す場合における菌体内β−ガラクトシダーゼの
安定化法に関するものである。

〔従来の技術〕

β−ガラクトシダーゼは、乳糖を加水分解するだけでな
く、乳糖にβ−ガラクトシル転移反応を生じさせて一般
式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｍ−Ｇｌｃ　（但し式中Ｇｓｌは
ガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは１〜
４の整数である）で示されるガラクトオリゴ糖を生成さ
せるので、該ガラクトオリゴ糖を製造するのに有用な酵
素である。

これらの酵素反応に使用する場合、β−ガラクトシダー
ゼとしては、精製したものやいわゆる固定化酵素とした
ものを使用するほか、この酵素を産生した微生物の菌体
内にあるものをそのまま使用することもできる。

菌体内にある酵素をそのまま酵素反応に利用する方法は
、酵素の採取、精製が不要であり且つ反応液の処理が簡
単であるから、コスト的に有利な方法となる。

しかしながら、菌体内にある酵素を菌体外物質の反応に
効率よく関与させるためには菌体を有機溶媒や界面活性
剤で処理する必要があるが、この過程で菌体内酵素の一
部が失活してしまうという問題点がある。また、実際に
酵素反応に使用するまでの保存中に、酵素が失活したり
菌体が腐敗したりするという問題もある。

上述のような理由によるβ−ガラクトシダーゼの失活を
防ぐための手段としては、従来、グリセリン、ソルビト
ール等を菌体と共存させておく方法があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、上記従来の方法のいずれとも異なる手
段により菌体内β−ガラクトシダーゼを安定化する方法
を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、一般弐Ｇ＊Ｉ−（Ｇａｌ）ｍ−Ｇｌｃ　（但
し式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース
残基、ｎは１〜４の整数である）で示されるガラクトオ
リゴ糖をβ−ガラクトシダーゼ含有菌体と共存させるこ
とにより菌体内β−ガラクトシダーゼを安定化するもの
である。

上記ガラクトオリゴ糖は、特公昭５８−２０２６６号公
報、特開昭６３−９１０９２号公報等に記載されている
ように、乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させてβ−
ガラクトシル転移反応を生じさせることにより製造する
ことができる。なお、上記酵素反応は乳糖の加水分解を
伴うので、反応生成物はガラクトオリゴ糖のほかにグル
コース、ガラクトース、その他転移二糖類、未反応乳糖
などを含む糖混合物になるが、本発明の安定化法にはこ
れからガラクトオリゴ糖を完全に精製して用いる必要は
なく、ガラクトオリゴ糖含有率が約３０％以上のもので
あれば、他の、’ＭＭとの混合物のままで用いてもよい
。

本発明の安定化法は、菌種に制限なく微生物菌体内に存
在するβ−ガラクトシダーゼに対して適用可能であるが
、菌体内にあるβ−ガラクトシダーゼをそのまま酵素反
応に利用させる場合における利用微生物としては、酵素
を産生させるための培養工程における増殖性、β−ガラ
クトシダーゼ産生能等の点で、ストレフトコッカス・サ
ーモフィルス、アスペルギルス・オリゼ、ラクトバチル
ス・ブルガリクス、その他バチルス属、ビフィドバクテ
リウム属、クリペロマイセス属等の細菌の外、ブレラ・
シンギュラリスなどの酵母が本質的に優れている。

本発明の方法において酵素安定化のために使用するガラ
クトオリゴ糖は、保存中または有機溶媒処理もしくは界
面活性剤処理における菌体内酵素の失活を防止するほか
、雑菌汚染による菌体の腐敗を防止して酵素含有菌体の
安定性を確保することによっても菌体内β−ガラクトシ
ダーゼ活性の維持を可能にする。

本発明の安定化法を実施する場合は、常法によりβ−ガ
ラクトシダーゼ産生菌を培養したのちβ−ガラクトシダ
ーゼを菌体内に蓄積した菌体を採取し、無菌水で洗浄後
、緩衝液に懸濁させ、ここにガラクトオリゴ糖を添加し
て冷暗所に保存する。添加量は、多いほど安定化効果は
あるが、添加後の菌液中の濃度で５％以上、好ましくは
１０％以上が適当である。必要に応じて、培養終了後任
意の過程で酵素反応の反応効率を高めるための有機溶媒
（たとえばエタノール）にょる処理、あるいは界面活性
剤（たとえばシ！糖脂肪酸エステル、リゾホスホリピド
、キラヤサポニン等）の添加と加熱を行う場合も、処理
前にガラクトオリゴ糖の添加を行う。

〔実施例〕 以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、実施例
におけるβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の測定は下記の
０ＮＰＧ法により行なった。

Ｃ０ＮＰＧ法〕 基質：　０．０３Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，２
）に溶解した・−ニトロフェニル−β−トガラクトピラ
ノシド（濃度０．３７６６４／１００１１）を用いる。

試験酵素液：菌体酵素液１１を０．０３Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７１）　９ａｌに懸濁し、さらに希釈し
て０．１５〜０３０＋＋／ａｔとして試験に供する。

試験方法二基質溶液０．８１をとり、まず４０　”Ｏで
約５分間予熱する。これに酵素液０．２１を加え、正確
に１０分間反応させた後、０．２５Ｍ炭酸ナトリウム４
１を加えて反応を停止させる。また、空試験として、基
質溶液０４ｍ１に炭酸ナトリウム溶液４１、酵素液０．
２１を順に加え、同様に操作する。反応停止後の４２０
　＋ｎにおける吸光度を測定する。０−ニトロフェノー
ルで標準線を作成し、酵素活性を算定する。

実施例１ ストレフトコッカス・サーモフィルスの種培養液をスキ
ムミルク酵素分解培地１ａ当たり０．５１接種し、３７
°Ｃで１６時間培養する。培養液を遠心分離して菌体を
集め、得られた菌体を無菌水に懸濁後、遠心分離して洗
浄する。洗浄菌体をｐＨ７，０の０．０３Ｎリン酸カリ
ウム緩衝液に懸濁し、等量の安定他剤溶液を加え、懸濁
液２０ｍ１あたり０．６ｍｌのショ糖脂肪酸エステル（
第−工業製薬株式会社製：商品名Ｄ　Ｋ　Ｓ　Ｌ−１８
Ａ）３８％溶液を加えて５０℃で３０分間加熱し、冷却
後、所定の温度で２週間保存する。保存試験を終わった
後、β−ガラクトシダーゼの残存活性を測定する。

安定化剤としてガラクトオリゴ糖、グリセリン、または
ソルビトールを用いて上記試験を行なった結果を表１に
示す。表示した数値は、保存開始直前のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を１００としたときの残存活性である。また
、上記と同じ保存試料を１５℃または２５°Ｃで４週間
保存した後、−絞細菌数を測定した。その結果を表２に
示す。

表１ （注）ガラクトオリゴ糖溶液Ｉ：乳糖をβ−ガラクトシ
ダーゼで処理して得られた糖液（固形分濃度７５％、固
形分中ガラクトオリゴ糖３５％）ガラクトオリゴ糖溶液
■：上記溶液Ｉの１／２希釈液表２ 実施例２ 実施例１の場合と同様にして界面活性剤処理β−ガラク
トシダーゼ含有菌体を製造するに当たり、界面活性剤処
理の時間を１５分〜９０分の範囲で変更し、界面活性剤
処理による酵素活性の低下に及ぼす安定化剤の影響を調
べた。その結果を表３に示す。表示した数値は、安定他
剤無添加で３０分加熱の場合を１００とした相対活性で
ある。

表３ いる従来の安定化法と同等またはそれ以上の安定化を達
成することができる。

特に、乳糖からガラクトオリゴ糖を製造する工程に菌体
内β−ガラクトシダーゼを使用する場合において本発明
の安定化法を採用すると、酵素反応生成物が安定化剤と
同一物質になるので、反応開始前に菌体から安定化剤を
分離する必要がなく、また、反応生成物中に安定化剤が
残存しても製品ガラクトオリゴ糖の品質を低下させるこ
とがないことも、本発明の有利な点である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）β−ガラクトシダーゼ産生能のある微生物が産生
   したβ−ガラクトシダーゼを菌体から取出すことなく酵
   素反応に利用する場合において、一般式Ｇａｌ−（Ｇａ
   ｌ）＿ｎ−Ｇｌｃ （但し、式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグル
   コース残基、ｎは１〜４の整数である） で示されるガラクトオリゴ糖をβ−ガラクトシダーゼ含
   有菌体と共存させることを特徴とする菌体内β−ガラク
   トシダーゼの安定化法。
2. （２）乳糖をβ−ガラクトシダーゼで処理して得られる
   ガラクトオリゴ糖含有糖液をβ−ガラクトシダーゼ含有
   菌体と共存させる請求項１記載の安定化法。
3. （３）ストレフトコッカス・サーモフィルスが産生した
   菌体内β−ガラクトシダーゼの安定化を行う請求項１記
   載の安定化法。