CN110914444A - 低聚半乳糖的制造方法 - Google Patents

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Abstract

通过特征在于在5～60mM的钠离子和0.5～8mM的镁离子的存在下使β‑半乳糖苷酶与底物反应的低聚半乳糖的制造方法，提供改善3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度的方法。

Description

低聚半乳糖的制造方法
技术领域
本发明涉及使用了β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖的制造方法，更具体而言，涉及通过使β-半乳糖苷酶在规定浓度的特定的金属离子的共存下作用于底物而改善3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度的方法。
背景技术
已知β-半乳糖苷酶对将乳糖等的β-D-半乳糖苷键水解的反应进行催化，并且也对半乳糖基转移反应进行催化，被用于在肠内选择性地使双歧杆菌增殖的低聚半乳糖的制造。
对于这种使用了β-半乳糖苷酶的反应而言，研究了改善半乳糖基的转移率的方法。例如提出了通过提高底物的乳糖浓度以使β-半乳糖苷酶发挥作用，而提高转移率的方法(专利文献1)。
通过使用了β-半乳糖苷酶的半乳糖基转移反应得到的产物中，除了β-D-吡喃半乳糖基(1-4)β-D-吡喃半乳糖基-D葡萄糖(4’-GL)等3糖以上的低聚半乳糖之外，例如还有可能含有β-D-吡喃半乳糖基(1-6)-D-葡萄糖等转移2糖，但是从改善双歧杆菌增殖促进效果等观点考虑，寻求进一步提高3糖以上的低聚半乳糖的生成量的技术。另外，从降低制造成本以及改善生产效率的观点考虑，缩短直至3糖以上的低聚半乳糖的生成量成为最大为止的反应时间是重要的，期待改善反应速度的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公平5-22517号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，在使用了β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖的制造方法中，提供改善3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度的方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题而深入研究，结果发现通过在特定浓度范围的钠离子和镁离子的存在下使β-半乳糖苷酶与底物反应，3糖以上的低聚半乳糖的生成量增大并且可以缩短直至生成量最大为止的反应时间，从而完成了本发明。
即，本发明为一种低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，在5～60mM的钠离子和0.5～8mM的镁离子的存在下使β-半乳糖苷酶与底物反应。
发明的效果
根据本发明的制造方法，可以提高3糖以上的低聚半乳糖的生成量的同时，反应速度也改善，能够缩短直至达到最大的生成量为止的反应时间。因此可以良好地、低成本地生产3糖以上的低聚半乳糖。
具体实施方式
本发明的低聚半乳糖的制造方法的特征在于，在5～60mM的钠离子和0.5～8mM的镁离子的存在下使β-半乳糖苷酶与底物反应。低聚半乳糖包括通式Gal-(Gal)n-Glc(Gal表示半乳糖残基、Glc表示葡萄糖、n表示1～6的整数)所示的3糖以上的低聚半乳糖。
β-半乳糖苷酶为对将乳糖、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷等的β-半乳糖苷键水解的反应进行催化的酶；对半乳糖基转移反应进行催化的酶。作为本发明中使用的β-半乳糖苷酶，没有特别限制，但是从3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度改善的观点考虑，优选为源自属于克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、链球菌(Streptcoccus)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、双歧杆菌(Bifidobacterium)属或芽胞杆菌(Bacillus)属等的微生物的β-半乳糖苷酶，进一步优选为源自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、嗜热链球菌(Streptcoccus thermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的β-半乳糖苷酶，特别优选为源自属于克鲁维酵母属的微生物的β-半乳糖苷酶，进一步优选为源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶。
作为上述β-半乳糖苷酶的市售品，可列举出例如源自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的GODO-YNL(合同酒精株式会社制)、Maxilact LG5000(DSM公司制)、源自脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)的Lactozym 3000L(Novozymes A/S公司制)、源自嗜热链球菌(Streptcoccus thermophilus)的Lactase Y-ST(YakultPharmaceutical Industry Co.,Ltd.制)等。
作为具有β-半乳糖苷酶活性的微生物或源自该微生物的β-半乳糖苷酶的形态，没有特别限定，可列举出例如培养液、利用离心分离、膜处理等将培养液浓缩而成的菌体浓缩液或粒料、干燥菌体、菌体破碎物、粗酶溶液、纯化酶溶液、酶粉末等，它们根据公知方法制造。
例如使用具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的情况下，根据公知的微生物的培养方法培养，直接使用所得到的培养液或者根据需要实施公知的离心分离、膜处理、干燥、破碎等处理而以菌体浓缩液或粒料、干燥菌体、菌体破碎物液等形式使用。菌体可以直接为活菌体，也可以实施有机溶剂处理、冷冻干燥处理等而形成死菌体。
另外，使用源自具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的β-半乳糖苷酶的情况下，对于纯化条件、纯化度没有特别限制，可以使用通常的纯化手法。根据公知方法培养该微生物后，利用离心分离、膜处理等分离手段将菌体分离，培养上清液中含有β-半乳糖苷酶的情况下，将其回收，可以形成粗酶溶液。另外，菌体内含有β-半乳糖苷酶的情况下，通过均化器、超声波处理将菌体进行物理地破碎或者使用细胞壁溶解酶等进行酶处理，由此得到菌体内提取液，可以形成粗酶溶液。对于这些粗酶溶液，可以通过适当组合硫酸铵盐析处理、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、吸附色谱、亲和色谱等而形成纯化度高的纯化酶溶液。
作为上述β-半乳糖苷酶发挥作用的底物，包括半乳糖基的受体和供体中的任意种都作用的单独的底物的情况、和半乳糖基的受体和供体另外共存的情况。作为成为半乳糖基的供体的底物，可列举出乳糖、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷等。另外，作为成为半乳糖基的受体的底物，可列举出乳糖、低聚半乳糖、葡萄糖、甘油等。
底物的浓度根据其种类等适当设定，例如使用乳糖的情况下，从3糖以上的低聚半乳糖的生成量和生成速度的改善效果的观点考虑，其浓度优选为5～65质量％、更优选15～60质量％。另外，β-半乳糖苷酶的添加量可以符合所希望的反应时间适当调整，但是相对于1g乳糖优选为10～1000U、更优选30～800U。反应温度等可以根据所使用的β-半乳糖苷酶的最适温度等适当设定。例如使用源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶的情况下，反应温度优选为30～50℃、更优选40～50℃。需要说明的是，酶活性(U)的测定如下所述。
[β-半乳糖苷酶酶活性(U)的测定法]
将稀释酶试样0.5mL取到试管，加入以形成0.1mM的方式加入有氯化锰的100mM的KH2PO4-NaOH缓冲液(pH 6.5、以下称为“缓冲液”)0.5mL进行混合后，在37℃下保温3分钟。加入预先在37℃下保温的0.1％的邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(以下称为“ONPG”)溶液1.0mL并快速混合，准确地在37℃下保温1分钟。加入0.2M的碳酸钠溶液2.0mL并快速混合，停止反应(试验系)。另外，将稀释酶试样0.5mL取到试管，加入缓冲液0.5mL进行混合后，加入0.2M的碳酸钠溶液2.0mL，在37℃下保温3分钟，加入预先在37℃下保温的ONPG溶液0.1mL进行混合，准确地在37℃下保温1分钟(盲测系)。将蒸馏水作为对照测定试验系和盲测系的420nm的吸光度，通过下式算出酶活性(U)
酶活性*＝(A1-A2)×10×B
A1：试验系的吸光度
A2：盲测系的吸光度
B：稀释倍率
*U/ml
本发明中，使上述β-半乳糖苷酶在钠离子和镁离子的存在下与底物反应。反应体系中的钠离子的浓度为5～60mM。另一方面，镁离子的浓度为0.5～8mM、更优选1.5～8mM。钠离子浓度大于60mM的情况、镁离子浓度大于8mM的情况下，将所得到的低聚半乳糖脱盐进行纯化时的负荷增大，所以不优选。通过钠离子和镁离子以这种范围共存，可以改善3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度。钠离子和镁离子可以以固体或缓冲液的形态将氯化物、碳酸盐、乙酸盐、磷酸盐等盐添加到反应体系，从添加后的pH变化小的观点考虑，优选为氯化钠和氯化镁。
通常利用β-半乳糖苷酶进行的半乳糖基转移反应由于与底物的水解反应竞争，因此若β-半乳糖苷酶作用于底物则产生所希望的低聚半乳糖的同时，由于竞争的水解反应而生成葡萄糖、半乳糖等单糖，另外，暂时生成的低聚半乳糖也受到水解。如此半乳糖基转移反应与水解反应竞争，并且随之作为半乳糖基的供体和受体，也有可能产生多种组合，因此进行控制以使特定的供体与受体之间的半乳糖基转移反应优先、生成所希望的低聚半乳糖是困难的。与此相对地，本发明中，通过在特定的浓度范围的钠离子和镁离子的存在下使β-半乳糖苷酶作用于底物，低聚半乳糖中，特别是可以增加3糖以上的低聚半乳糖的生成量，进而可以提高其反应速度而缩短直至生成量成为最大为止的达到时间，因此能够效率良好、低成本地生产3糖以上的低聚半乳糖。
另外，本发明的方法也可以适用于通过2种β-半乳糖苷酶发挥作用的依次反应进行的低聚半乳糖的制造中的二次反应。即，作为一次反应，使具有β-半乳糖苷酶活性的微生物或源自该微生物的β-半乳糖苷酶与底物反应后，作为二次反应，使与一次反应中使用的β-半乳糖苷酶不同的β-半乳糖苷酶在5～60mM的钠离子和0.5～8mM的镁离子的存在下作用于一次反应液，由此可以减少未反应的底物的同时增大低聚半乳糖的生成量。
作为一次反应中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的微生物，例如优选为属于掷孢酵母(Sporobolomyces)属、曲霉(Aspergillus)属、芽胞杆菌(Bacillus)属的微生物，特别优选属于掷孢酵母属的微生物，进而独特掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)从3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度改善的观点考虑优选。
作为一次反应中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的微生物或源自该微生物的β-半乳糖苷酶的形态，没有特别限定，可列举出例如培养液、利用离心分离、膜处理等将培养液浓缩而成的菌体浓缩液或粒料、干燥菌体、菌体破碎物、粗酶溶液、纯化酶溶液、酶粉末等，它们根据公知方法制造。
例如使用具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的情况下，根据公知的微生物的培养方法培养，直接使用所得到的培养液或者根据需要实施公知的离心分离、膜处理、干燥、破碎等处理而以菌体浓缩液或粒料、干燥菌体、菌体破碎物液等形式使用。菌体可以直接为活菌体，也可以实施有机溶剂处理、冷冻干燥处理等而形成死菌体。
另外，使用源自具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的β-半乳糖苷酶的情况下，对于纯化条件、纯化度没有特别限制，可以使用通常的纯化手法。根据公知方法培养该微生物后，利用离心分离、膜处理等分离手段将菌体分离，培养上清液中含有β-半乳糖苷酶的情况下，将其回收，可以形成粗酶溶液。另外，菌体内含有β-半乳糖苷酶的情况下，通过均化器、超声波处理将菌体进行物理地破碎或者使用细胞壁溶解酶等进行酶处理，由此得到菌体内提取液，可以形成粗酶溶液。对于这些粗酶溶液，可以通过适当组合硫酸铵盐析处理、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、吸附色谱、亲和色谱等，从而形成纯化度高的纯化酶溶液。
一次反应中，使上述具有β-半乳糖苷酶活性的微生物或源自该微生物的β-半乳糖苷酶与乳糖等底物反应。反应条件可以根据所使用的具有β-半乳糖苷酶活性的微生物或源自该微生物的β-半乳糖苷酶的特性适当设定。例如作为具有β-半乳糖苷酶活性的微生物，使用独特掷孢酵母，作为底物使用乳糖的情况下，从低聚半乳糖的生成量和生成速度的改善效果的观点考虑，乳糖的浓度优选为10～60质量％、更优选40～50质量％。另外，独特掷孢酵母的添加量相对于1g乳糖优选为0.03～0.3U、更优选0.2～0.3U。另外，反应温度为30～70℃左右，若反应24～96小时左右即可。
二次反应中，使与一次反应中使用的β-半乳糖苷酶不同的β-半乳糖苷酶在特定的浓度范围的钠离子和镁离子的存在下作用于一次反应中得到的一次反应液。
对于二次反应中使用的β-半乳糖苷酶没有特别限制，但是从3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度的改善的观点考虑，优选为源自属于克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、链球菌(Streptcoccus)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、双歧杆菌(Bifidobacterium)属或芽胞杆菌(Bacillus)属等的微生物的β-半乳糖苷酶，进一步优选为源自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、嗜热链球菌(Streptcoccus thermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的β-半乳糖苷酶，特别优选为源自属于克鲁维酵母属的微生物的β-半乳糖苷酶，进一步优选为源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶。
通过使上述β-半乳糖苷酶在特定浓度范围的钠离子和镁离子的存在下作用于一次反应液，3糖以上的低聚半乳糖的生成量增加。进而，其反应速度也改善，直至3糖以上的低聚半乳糖的生成量成为最大为止的反应时间缩短。二次反应液中的钠离子的浓度为5～60mM。另一方面，镁离子的浓度为0.5～8mM、更优选1.5～8mM。钠离子浓度大于60mM的情况、镁离子浓度大于8mM的情况下，将低聚半乳糖脱盐进行纯化时的负荷增大，所以不优选。通过钠离子和镁离子以这种浓度范围存在，可以改善低聚半乳糖的生成量和生产效率。钠离子和镁离子可以以固体或缓冲液的形态将氯化物、碳酸盐、乙酸盐、磷酸盐等盐添加到反应体系，从添加后的pH变化小的观点考虑，优选为氯化钠和氯化镁。
一次反应液中的残留乳糖的浓度从3糖以上的低聚半乳糖的生成量和反应速度的改善效果的观点考虑，优选为5～65质量％、更优选15～60质量％。另外，β-半乳糖苷酶的添加量相对于1g残留乳糖优选为10～1000U、更优选30～800U。反应温度等可以根据所使用的β-半乳糖苷酶的最适温度等适当设定。例如使用源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶的情况下，从3糖以上的低聚半乳糖的生成量和生成速度的改善效果的观点考虑，反应温度优选为30～50℃、更优选40～50℃。
如上所述生成了低聚半乳糖的反应液可以直接用作食品原材料，或者适当进行利用活性炭进行的脱色、利用硅藻土进行的过滤、利用离子交换树脂进行的脱盐、利用浓缩机进行的浓缩，以液糖形式，或通过喷雾干燥机等进行粉末化而用作食品原材料。例如也能够直接用作蔗糖或者添加于发酵乳、乳酸菌饮料、面包、果酱、点心类等饮食品。对于此时的添加浓度没有特别限定，若鉴于风味、物性等适当确定即可。除了这种食品以外，也可以用于化妆品、药物等。
以下列举出实施例对于本发明进行更具体说明，但是本发明不被它们任何限制。
实施例
实施例1
在100mL容量锥形瓶称量药典等级的乳糖15g，加入用去离子水制造(不含有钠离子和镁离子)的Bis-Tris缓冲液(pH 6.8)85g(乳糖浓度15％)。在沸水浴中完全溶解乳糖后，在45℃的恒温水槽中冷却。向其中加入2.6M的氯化钠以使钠离子浓度为15mM，另外，加入0.75M的氯化镁以使镁离子浓度形成下述表1中记载的浓度，向它们中每1g乳糖添加600U的GODO-YNL(源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶、合同酒精株式会社制)在40℃下反应。对于这些反应液经时取样直至第7小时，在沸水浴中升温至90℃使酶失活后，残留2糖和3糖以上的低聚半乳糖的比率基于下述条件通过HPLC分析来测定。各镁离子浓度下的3糖以上的低聚半乳糖的生成量成为最大时的测定结果如表1所示。需要说明的是，残留2糖中包括未反应的乳糖和转移2糖。
<HPLC条件>
色谱柱：Shodex SUGAR KS-802
流动相：纯化水
流速：0.5mL/分钟
检测：差示折射计
[表1]
Figure BDA0002349341250000091
实施例2
添加2.6M的氯化钠以使钠离子浓度为30mM，除此之外与实施例1同样地操作，测定残留2糖和3糖以上的低聚半乳糖的比率。结果如表2所示。
[表2]
Figure BDA0002349341250000101
实施例3
使反应液中的乳糖浓度为45％、添加2.6M的氯化钠以使钠离子浓度为5mM，每1g乳糖添加250U的GODO-YNL，在45℃下反应，除此之外与实施例1同样地操作，测定残留2糖和3糖以上的低聚半乳糖的比率。结果如表3所示。
[表3]
Figure BDA0002349341250000102
实施例4
使反应液中的乳糖浓度为45％、添加2.6M的氯化钠以使钠离子浓度为60mM，每1g乳糖添加250U的GODO-YNL，在45℃下反应，除此之外与实施例1同样地操作，测定残留2糖和3糖以上的低聚半乳糖的比率。结果如表4所示。
[表4]
Figure BDA0002349341250000111
由表1和表2可知，钠离子浓度为15mM及30mM时，通过以0.5mM以上添加镁离子，直至3糖以上的低聚半乳糖的生成量成为最大为止的反应时间与镁离子浓度为0mM及0.1mM的情况相比缩短到一半以下。另外示出随着镁离子浓度的增加、3糖以上的低聚半乳糖的生成量增加。进而可知，钠离子浓度为15mM时，通过以1.5mM以上添加镁离子，直至3糖以上的低聚半乳糖的生成量成为最大为止的反应时间进一步缩短。另外，由表3及表4可知，钠离子浓度为5mM、60mM时，通过以0.5mM以上添加镁离子，直至3糖以上的低聚半乳糖的生成量成为最大为止的反应时间与镁离子浓度为0mM及0.1mM的情况相比缩短，示出随着镁离子浓度的增加、特别是镁离子浓度为1.5mM以上时，3糖以上的低聚半乳糖的生成量增加。
产业上的可利用性
根据本发明，可以在短的反应时间内提高3糖以上的低聚半乳糖的生成量，因此作为工业上的低聚半乳糖的制造方法是有用的。

Claims (3)

1.一种低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，在5～60mM的钠离子和0.5～8mM的镁离子的存在下使β-半乳糖苷酶与底物反应。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，镁离子的浓度为1.5～8mM。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，β-半乳糖苷酶源自属于克鲁维酵母属的微生物。
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