KR20200026274A - 갈락토올리고당의 제조 방법 - Google Patents
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
Abstract
5~60mM의 나트륨 이온 및 0.5~8mM의 마그네슘 이온의 존재 하에서, β-갈락토시다아제를 기질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조 방법에 의해, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도를 향상시키는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 β-갈락토시다아제를 사용한 갈락토올리고당의 제조 방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 β-갈락토시다아제를 소정의 농도에 있어서의 특정한 금속 이온의 공존 하에서 기질에 작용시킴으로써 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도를 향상하는 방법에 관한 것이다.
β-갈락토시다아제는 유당 등의 β-D-갈락토시드 결합을 가수분해하는 반응과 함께, 갈락토실기 전이 반응도 촉매하는 것이 알려져 있고, 장내에서 선택적으로 비피더스균을 증식시키는 갈락토올리고당의 제조에 사용되고 있다.
이러한 β-갈락토시다아제를 사용한 반응에 있어서, 갈락토실기의 전이율을 향상시키는 방법이 검토되고 있다. 예를 들면, 기질의 유당 농도를 높여서 β-갈락토시다아제를 작용시킴으로써 전이율을 높이는 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1).
β-갈락토시다아제를 사용한 갈락토실기 전이 반응에 의한 생성물에는 β-D-갈락토피라노실(1-4)β-D-갈락토피라노실-D 글루코오스(4'-GL) 등의 3당 이상의 갈락토올리고당 외, 예를 들면 β-D-갈락토피라노실(1-6)-D-글루코오스 등의 전이 2당이 포함될 수 있지만, 비피더스균 증식 촉진 효과의 향상 등의 점으로부터, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량을 보다 높이는 기술이 요구되고 있다. 또한, 제조 비용의 저감 및 생산 효율의 개선의 관점으로부터는 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 최대가 될 때까지의 반응 시간을 단축하는 것이 중요하여 반응 속도를 향상시키는 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 과제는 β-갈락토시다아제를 사용한 갈락토올리고당의 제조 방법에 있어서, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도를 향상시키는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 행한 결과, 특정한 농도 범위의 나트륨 이온 및 마그네슘 이온의 존재 하에서, β-갈락토시다아제를 기질과 반응시킴으로써, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 증대하고, 또한, 생성량이 최대에 이르기까지의 반응 시간을 단축할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 5~60mM의 나트륨 이온 및 0.5~8mM의 마그네슘 이온의 존재 하에서, β-갈락토시다아제를 기질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조 방법이다.
본 발명의 제조 방법에 의하면, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량을 높일 수 있음과 아울러, 반응 속도도 향상하고, 최대의 생성량에 도달할 때까지의 반응시간을 단축하는 것이 가능하다. 그 때문에 3당 이상의 갈락토올리고당을 효율적으로 저비용으로 생산할 수 있다.
본 발명의 갈락토올리고당의 제조 방법은 5~60mM의 나트륨 이온 및 0.5~8mM의 마그네슘 이온의 존재 하에서, β-갈락토시다아제를 기질과 반응시키는 것을 특징으로 한다. 갈락토올리고당에는 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(Gal은 갈락토오스 잔기, Glc는 글루코오스, n은 1~6의 정수를 나타낸다)으로 나타내어지는 3당 이상의 갈락토올리고당이 포함된다.
β-갈락토시다아제는 락토오스나 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 등의 β-갈락토시드 결합을 가수분해하는 반응이나, 갈락토실기 전이 반응을 촉매하는 효소이다. 본 발명에서 사용하는 β-갈락토시다아제로서는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도의 향상의 점으로부터, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 스트렙토코커스(Streptcoccus)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 또는 바실루스(Bacillus)속 등에 속하는 미생물 유래의 것이 바람직하고, 또한 클루이베로마이세스·락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스·프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 스트렙토코커스·써모필루스(Streptcoccus thermophilus), 락토바실루스·불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 비피도박테리움·브리브(Bifidobacterium breve) 유래의 것이 바람직하고, 특히 클루이베로마이세스속에 속하는 미생물 유래의 β-갈락토시다아제가 바람직하고, 또한 클루이베로마이세스·락티스 유래의 β-갈락토시다아제가 바람직하다.
상기 β-갈락토시다아제의 시판품으로서, 예를 들면 클루이베로마이세스·락티스(Kluyveromyces lactis) 유래의 GODO-YNL(GODO SHUSEI Co., Ltd. 제품), 막실락트 LG5000(DSM사 제품)이나 클루이베로마이세스·프라길리스(Kluyveromyces fragilis) 유래의 락토자임 3000L(Novozymes A/S 제품), 스트렙토코커스·써모필루스(Streptcoccus thermophilus) 유래의 락타아제 Y-ST(Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 제품) 등을 들 수 있다.
β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물 또는 상기 미생물 유래의 β-갈락토시다아제의 형태로서는 특별하게 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 배양액, 배양액을 원심 분리나 막처리 등에 의해 농축한 균체 농축액 또는 펠렛, 건조 균체, 균체 파쇄물, 조효소 용액, 정제 효소 용액, 효소 분말 등이 열거되고, 이들은 공지의 방법을 따라서 조제된다.
예를 들면, β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물을 사용하는 경우, 공지의 미생물의 배양 방법을 따라서 배양하고, 얻어진 배양액을 그대로 사용하거나, 필요에 따라서 공지의 원심분리, 막처리, 건조, 파쇄 등의 처리를 실시하고, 균체 농축 액 또는 펠렛, 건조 균체, 균체 파쇄물액 등으로서 사용한다. 균체는 생균체 그대로이어도 되고, 유기 용제 처리, 동결 건조 처리 등을 실시하여 사균체로 한 것이어도 된다.
또한, β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물 유래의 β-갈락토시다아제를 사용하는 경우, 정제 조건, 정제도에 특별히 제약은 없고, 일반적인 정제 방법을 사용할 수 있다. 상기 미생물을 공지의 방법을 따라서 배양한 후, 원심분리, 막처리 등의 분리 수단으로 균체를 분리하고, 배양 상청 중에 β-갈락토시다아제가 포함되는 경우에는 이것을 회수하고, 조효소 용액으로 할 수 있다. 또한, 균체 내에 β-갈락토시다아제가 포함되는 경우에는 균체를 호모지나이저나 초음파 처리에 의해 물리적으로 파쇄하거나, 세포벽 용해 효소 등을 이용하여 효소적으로 처리함으로써, 균체 내 추출액을 얻어 조효소 용액으로 할 수 있다. 이들의 조효소 용액을 황안염석 처리, 투석, 겔여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 적당하게 조합함으로써, 정제도가 높은 정제 효소 용액으로 해도 된다.
상기 β-갈락토시다아제를 작용시키는 기질로서는 갈락토실기의 수용체 및 공여체 중 어느 것으로 해도 작용하는 단독의 기질인 경우와, 갈락토실기의 수용체와 공여체가 별도 공존하고 있는 경우가 포함된다. 갈락토실기의 공여체가 되는 기질로서는 유당, o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 등이 열거된다. 또한, 갈락토실기의 수용체가 되는 기질로서는 유당, 갈락토올리고당, 글루코오스, 글리세롤 등이 열거된다.
기질의 농도는 그 종류 등에 따라 적당하게 설정되지만, 예를 들면 유당을 사용하는 경우, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 생성 속도의 향상 효과의 점으로부터, 그 농도는 5~65질량%인 것이 바람직하고, 15~60질량%가 보다 바람직하다. 또한, β-갈락토시다아제의 첨가량은 소망의 반응 시간에 따라서 적당하게 조정할 수 있지만, 유당 1g당 10~1000U가 바람직하고, 30~800U가 보다 바람직하다. 반응 온도 등은 사용하는 β-갈락토시다아제의 최적 온도 등에 따라 적당하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 클루이베로마이세스·락티스 유래의 β-갈락토시다아제를 사용하는 경우, 반응 온도는 30~50℃가 바람직하고, 40~50℃가 보다 바람직하다. 또한, 효소 활성(U)의 측정은 다음과 같다.
[β-갈락토시다아제 효소 활성(U)의 측정법]
희석 효소 시료 0.5mL를 시험관에 취하고, 0.1mM이 되도록 염화 망간을 가한 100mM의 KH2PO4-NaOH 완충액(pH 6.5, 이하, 「완충액」이라고 한다) 0.5mL를 가해서 혼합한 후, 37℃에서 3분간 보온한다. 미리 37℃에서 보온해 둔 0.1%의 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(이하, 「ONPG」이라고 한다) 용액 1.0mL를 가해서 즉시 혼합하고, 정확하게 37℃에서 1분간 보온한다. 0.2M의 탄산나트륨 용액 2.0mL를 가하여 즉시 혼합하고, 반응을 정지한다(시험계). 별도로, 희석 효소 시료 0.5mL를 시험관에 취하고, 완충액 0.5mL를 가하여 혼합한 후, 0.2M의 탄산나트륨 용액 2.0mL를 가하고, 37℃에서 3분간 보온하고, 미리 37℃로 보온해 둔 ONPG 용액 0.1mL를 가해서 혼합하고, 정확하게 37℃에서 1분간 보온한다(블라인드 시험계). 증류수를 대조로 하여 시험계 및 블라인드 시험계의 420nm의 흡광도를 측정하고, 다음식에 의해 효소 활성(U)을 산출했다.
[수식 1]
효소 활성*=(A1-A2)×10×B
A1 : 시험계의 흡광도
A2 : 블라인드 시험계의 흡광도
B : 희석 배율
* U/ml
본 발명에서는 상기 β-갈락토시다아제를 나트륨 이온 및 마그네슘 이온의 존재 하에서 기질에 반응시킨다. 반응계에 있어서의 나트륨 이온의 농도는 5~60mM이다. 한편, 마그네슘 이온의 농도는 0.5~8mM이며, 보다 바람직하게는 1.5~8mM이다. 나트륨 이온 농도가 60mM 보다 큰 경우나 마그네슘 이온 농도가 8mM 보다 큰 경우에는 얻어진 갈락토올리고당을 탈염해서 정제할 때의 부하가 커져 바람직하지 않다. 나트륨 이온 및 마그네슘 이온을 이러한 범위에서 공존시킴으로써, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도를 향상할 수 있다. 나트륨 이온 및 마그네슘 이온은 염화물, 탄산염, 아세트산염, 인산염 등의 염을 고체 또는 완충액의 형태로 반응계에 첨가할 수 있고, 첨가 후의 pH 변화가 적은 점으로부터, 염화 나트륨 및 염화 마그네슘이 바람직하다.
일반적으로 β-갈락토시다아제에 의한 갈락토실기 전이 반응은 기질의 가수분해 반응과 경합하기 때문에, 기질에 β-갈락토시다아제를 작용시키면, 소망의 갈락토올리고당이 생산됨과 아울러, 경합하는 가수분해 반응에 의해 글루코오스나 갈락토오스(galactose)등의 단당이 생성하고, 또 일단 생성된 갈락토올리고당도 가수분해를 받는다. 이와 같이 갈락토실기 전이 반응과 가수 분해 반응이 경합하고, 게다가 그것에 따라 갈락토실기의 공여체와 수용체로서도 다양한 조합이 발생할 수 있기 때문에, 특정한 공여체와 수용체 간의 갈락토실기 전이 반응을 우선시키고, 소망의 갈락토올리고당이 생성되도록 제어하는 것은 곤란하게 된다. 이에 대하여 본 발명에서는 특정한 농도 범위의 나트륨 이온 및 마그네슘 이온의 존재 하에서 β-갈락토시다아제를 기질에 작용시킴으로써, 갈락토올리고당 중에서도 특히 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량을 증가시킬 수 있고, 또한 그 반응 속도를 높여서 생성량이 최대가 될 때까지의 도달 시간을 단축할 수 있기 때문에, 3당 이상의 갈락토올리고당을 효율적으로 저비용으로 생산하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명의 방법은 2종의 β-갈락토시다아제를 작용시키는 순차 반응에 의한 갈락토올리고당의 제조에 있어서의 2차 반응에도 적용할 수 있다. 즉, 1차 반응으로서, β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물 또는 상기 미생물 유래의 β-갈락토시다아제를 기질에 반응시킨 후, 2차 반응으로서, 1차 반응에 사용한 것과 다른 β-갈락토시다아제를, 5~60mM의 나트륨 이온 및 0.5~8mM의 마그네슘 이온의 존재 하에서 1차 반응액에 작용시킴으로써 미반응의 기질을 감소시킴과 아울러, 갈락토올리고당의 생성량을 증대시킬 수 있다.
1차 반응에 사용하는 β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물로서는 예를 들면, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 바실루스(Bacillus)속에 속하는 미생물이 바람직하고, 특히 스포로볼로마이세스속에 속하는 미생물이 바람직하고, 또한 스포로볼로마이세스·싱귤러리스(Sporobolomyces singularis)가 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도의 향상의 점으로부터 바람직하다.
1차 반응에 있어서 사용하는 β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물 또는 상기 미생물 유래의 β-갈락토시다아제의 형태로서는 특별하게 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 배양액, 배양액을 원심 분리나 막 처리 등에 의해 농축한 균체 농축 액 또는 펠렛, 건조 균체, 균체 파쇄물, 조효소 용액, 정제 효소 용액, 효소 분말 등이 열거되고, 이들은 공지의 방법을 따라서 조제된다.
예를 들면, β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물을 사용하는 경우, 공지의 미생물의 배양 방법을 따라서 배양하고, 얻어진 배양액을 그대로 사용하거나, 필요에 따라서 공지의 원심 분리, 막 처리, 건조, 파쇄 등의 처리를 실시하고, 균체 농축액 또는 펠렛, 건조 균체, 균체 파쇄물액 등으로서 사용한다. 균체는 생균체 그대로이어도 되고, 유기 용제 처리, 동결 건조 처리 등을 실시해서 사균체로 한 것이어도 된다.
또한, β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물 유래의 β-갈락토시다아제를 사용하는 경우, 정제 조건, 정제도에 특별히 제약은 없고, 일반적인 정제 방법을 사용할 수 있다. 상기 미생물을 공지의 방법을 따라서 배양한 후, 원심 분리, 막 처리 등의 분리 수단으로 균체를 분리하고, 배양 상청 중에 β-갈락토시다아제가 포함되는 경우에는 이것을 회수하여 조효소 용액으로 할 수 있다. 또한, 균체 내에 β-갈락토시다아제가 포함되는 경우에는 균체를 호모지나이저나 초음파 처리에 의해 물리적으로 파쇄하거나, 세포벽 용해 효소 등을 이용하여 효소적으로 처리함으로써, 균체 내 추출액을 얻어 조효소 용액으로 할 수 있다. 이들의 조효소 용액을 유안염석 처리, 투석, 겔여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 적당하게 조합함으로써, 정제도가 높은 정제 효소 용액으로 해도 된다.
1차 반응에 있어서, 상기 β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물 또는 상기 미생물 유래의 β-갈락토시다아제를 유당 등의 기질에 반응시킨다. 반응 조건은 사용하는 β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물 또는 상기 미생물 유래의 β-갈락토시다아제의 특성에 따라 적당하게 설정할 수 있다. 예를 들면, β-갈락토시다아제 활성을 갖는 미생물로서 스포로볼로마이세스·싱귤러리스를 사용하고, 기질로서 유당을 사용하는 경우, 갈락토올리고당의 생성량 및 생성 속도의 향상 효과의 점으로부터, 유당의 농도는 10~60질량%가 바람직하고, 40~50질량%가 보다 바람직하다. 또한, 스포로볼로마이세스·싱귤러리스의 첨가량은 유당 1g당 0.03~0.3U가 바람직하고, 0.2~0.3U가 보다 바람직하다. 또한, 반응 온도는 30~70℃정도이고, 24~96시간정도 반응시키면 된다.
2차 반응에서는 1차 반응에서 얻어진 1차 반응액에, 특정한 농도 범위의 나트륨 이온 및 마그네슘 이온의 존재 하에서, 1차 반응에 사용한 것과는 다른 β-갈락토시다아제를 작용시킨다.
2차 반응에 있어서 사용되는 β-갈락토시다아제는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도 향상의 점으로부터, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 스트렙토코커스(Streptcoccus)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속 또는 바실루스(Bacillus)속 등에 속하는 미생물 유래의 것이 바람직하고, 또한 클루이베로마이세스·락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스·프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 스트렙토코커스·써모필루스(Streptcoccus thermophilus), 락토바실루스·불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 비피도박테리움·브리브(Bifidobacterium breve) 유래의 것이 바람직하고, 특히 클루이베로마이세스속에 속하는 미생물 유래의 β-갈락토시다아제가 바람직하고, 또한 클루이베로마이세스·락티스 유래의 β-갈락토시다아제가 바람직하다.
상기 β-갈락토시다아제를 특정한 농도 범위의 나트륨 이온 및 마그네슘 이온의 존재 하에서 1차 반응액에 작용시킴으로써, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 증가한다. 또한, 그 반응 속도도 향상하고, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 최대가 될 때까지의 반응 시간이 단축된다. 2차 반응액에 있어서의 나트륨 이온의 농도는 5~60mM이다. 한편, 마그네슘 이온의 농도는 0.5~8mM이고, 보다 바람직하게는 1.5~8mM이다. 나트륨 이온 농도가 60mM보다 큰 경우나 마그네슘 이온 농도가 8mM보다 큰 경우에는 갈락토올리고당을 탈염해서 정제할 때의 부하가 커져 바람직하지 않다. 나트륨 이온 및 마그네슘 이온을 이러한 농도 범위에서 존재시킴으로써, 갈락토올리고당의 생성량 및 생산 효율을 향상할 수 있다. 나트륨 이온 및 마그네슘 이온은 염화물, 탄산염, 아세트산염, 인산염 등의 염을 고형 또는 완충액의 형태로 반응계에 첨가할 수 있고, 첨가 후의 pH 변화가 적은 점으로부터, 염화나트륨 및 염화마그네슘이 바람직하다.
1차 반응액에 있어서의 잔존 유당의 농도는 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 반응 속도 향상 효과의 점으로부터, 5~65질량%가 바람직하고, 15~60질량%가 보다 바람직하다. 또한, β-갈락토시다아제의 첨가량은 잔존 유당 1g당 10~1000U가 바람직하고, 30~800U가 보다 바람직하다. 반응 온도 등은 사용하는 β-갈락토시다아제의 최적 온도 등에 따라 적당하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 클루이베로마이세스·락티스 유래의 β-갈락토시다아제를 사용하는 경우, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량 및 생성 속도의 향상 효과의 점으로부터, 반응 온도는 30~50℃가 바람직하고, 40~50℃가 보다 바람직하다.
이상과 같이 해서 갈락토올리고당이 생성한 반응액은 그대로 또는 적당하게 활성탄에 의한 탈색이나 규조토에 의한 여과, 이온 교환 수지에 의한 탈염, 농축기에 의한 농축을 행하고, 액당으로서, 또는 분무 건조기 등에 의해 분말화해서 식품소재로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 그대로 테이블 슈거로서 이용하거나, 발효유, 유산균 음료, 빵, 잼이나 과자류 등의 음식품에 첨가하는 것도 가능하다. 그 때의 첨가 농도에는 특별하게 한정되지 않고, 풍미나 물성 등을 감안하여 적당하게 결정하면 된다. 이러한 식품 이외에도, 화장품, 의약품 등에도 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 하등 제약되지 않는다.
실시예
실시예 1
100mL 용적의 삼각 플라스크에 일본 약전 그레이드의 유당을 15g 칭량하고, 탈이온수로 조제한(나트륨 이온과 마그네슘 이온이 포함되어 있지 않음) Bis-Tris완충액(pH6.8)을 85g 가했다(유당 농도 15%). 비등수욕 중에서 유당을 완전하게 용해한 후에, 45℃의 항온 수조 중에서 냉각했다. 이것에 2.6M의 염화나트륨을 나트륨 이온 농도가 15mM이 되도록 첨가하고, 또한 0.75M의 염화마그네슘을 마그네슘 이온 농도가 하기 표 1에 기재된 농도가 되도록 첨가하고, 이들에 GODO-YNL(클루이베로마이세스·락티스 유래의 β-갈락토시다아제, GODO SHUSEI Co., Ltd. 제품)을 유당 1g당 600U 첨가해서 40℃에서 반응시켰다. 이들 반응액을 경시적으로 7시간째까지 샘플링하고, 비등수욕 중에서 90℃까지 승온해서 효소를 실활시킨 후, 잔류 2당과 3당 이상의 갈락토올리고당의 비율을 하기 조건에 기초하는 HPLC 분석에 의해 측정했다. 각 마그네슘 이온 농도에 있어서의 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 최대가 되었을 때의 측정 결과를 표 1에 나타낸다. 또한, 잔류 2당에는 미반응의 유당 및 전이 2당이 포함된다.
<HPLC 조건>
컬럼: Shodex SUGAR KS-802
이동층: 정제수
유속: 0.5mL/min
검출: 시차굴절계
실시예 2
2.6M의 염화나트륨을 나트륨 이온 농도가 30mM이 되도록 첨가한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 잔류 2당과 3당 이상의 갈락토올리고당의 비율을 측정했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
실시예 3
반응액 중의 유당 농도를 45%로 하고 2.6M의 염화나트륨을 나트륨 이온 농도가 5mM이 되도록 첨가하고, GODO-YNL을 유당 1g당 250U 첨가해서 45℃에서 반응시킨 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 나머지 2당과 3당 이상의 갈락토올리고당의 비율을 측정했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
실시예 4
반응액 중의 유당 농도를 45%로 하고, 2.6M의 염화나트륨을 나트륨 이온 농도가 60mM이 되도록 첨가하고, GODO-YNL을 유당 1g당 250U 첨가해서 45℃에서 반응시킨 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 잔류 2당과 3당 이상의 갈락토올리고당의 비율을 측정했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
표 1 및 표 2로부터 나트륨 이온 농도가 15mM 및 30mM이고, 마그네슘 이온을 0.5mM 이상이 되도록 첨가함으로써 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 최대가 될 때까지의 반응 시간이 마그네슘 이온 농도가 0mM 및 0.1mM인 경우와 비교해서 절반 이하로 단축되는 것이 명백해졌다. 또한, 마그네슘 이온 농도의 증가에 따라, 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 증가하는 것이 나타내어졌다. 또한, 나트륨 이온 농도가 15mM인 경우, 마그네슘 이온을 1.5mM 이상이 되도록 첨가함으로써 3당 이상 갈락토올리고당의 생성량이 최대가 될 때까지의 반응 시간이 보다 단축되는 것이 명백해졌다. 또한, 표 3 및 표 4로부터 나트륨 이온 농도가 5mM, 60mM인 경우, 마그네슘 이온을 0.5mM 이상이 되도록 첨가함으로써 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 최대가 될 때까지의 반응 시간이 마그네슘 이온 농도가 0mM 및 0.1mM의 경우와 비교해서 단축되는 것이 명백하게 되고, 마그네슘 이온 농도의 증가에 따라, 특히 마그네슘 이온 농도가 1.5mM 이상이고 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량이 증가하는 것이 나타내어졌다.
산업상의 이용 가능성
본 발명에 의하면, 짧은 반응 시간으로 3당 이상의 갈락토올리고당의 생성량을 높일 수 있기 때문에, 공업적인 갈락토올리고당의 제조 방법으로서 유용하다.
Claims (3)
- 5~60mM의 나트륨 이온 및 0.5~8mM의 마그네슘 이온의 존재 하에서, β-갈락토시다아제를 기질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서,
마그네슘 이온의 농도가 1.5~8mM인 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
β-갈락토시다아제가 클루이베로마이세스속에 속하는 미생물 유래의 것인 제조 방법.
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