CN103289936B

CN103289936B - 一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法

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Publication number: CN103289936B
Application number: CN201310237741.7A
Authority: CN
Inventors: 黄翔峰; 刘佳; 陆丽君; 朱其玮; 申昌明; 王珅
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103289936A

Abstract

本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种利用城市生活污水厂剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，包括以下步骤：(1)取污水处理厂剩余污泥，进行超声预处理，随后进行固液分离得到澄清的污泥提取液；(2)污泥提取液经过pH调整及投加额外碳源后，形成完整培养基，灭菌后，接种生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液，发酵培养，即得到生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1。与现有技术相比，本发明使用污泥提取液作为生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1的发酵生产，能够降低其成产成本，且相比无机盐培养基培养，能够有效提高菌体产量，缩短发酵时间，同时获得的菌体破乳性能保持在较高水平，有利于生物破乳剂的推广应用，同时能够为剩余污泥减量及资源化提供新的途径。

Description

一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，涉及利用废弃物生产高效生物破乳菌的技术，尤其是涉及一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法。

背景技术

基于活性污泥的生化处理会在净化污水的同时产生大量的剩余污泥。其处理处置给人们带来了众多技术和经济投入上的问题及挑战。目前，最常用的剩余污泥处置方法是填埋或者土地利用，占用了大量的空间资源。同时，其中蕴藏的大量的物质能量资源也被浪费。如果能在污泥最终处置前采用适当的方法对其中的资源进行利用，就能使这种废弃物产生新的价值。

超声法是一种常见的用于破解剩余污泥的预处理方法，其具有操作简单、处理效率高等特点。在对剩余污泥进行超声的过程中，超声波能够引起产生极端高温高压的“空穴现象”，产生的水力剪切力以及释放的羟基自由基会对污泥絮体产生一系列的物理化学作用，达到破解污泥的效果。采用低频高声能密度的超声波能有效的打碎污泥絮体并溶解其中的菌体细胞，令其中的有机物和无机物进入液相，从而得到一种富含碳、氮、磷和其他各类营养元素的液体。这使得剩余污泥具备了能够生产具有特定附加值生物制品的潜力。目前，已有使用污泥直接发酵生产生物农药苏云金杆菌以及污泥水解液异养培养小球藻的例子，能够获得与培养基发酵相接近的结果。

目前在石油开采行业所用的原油脱水剂多为化学破乳剂，但化学破乳剂在实际应用中存在对油品的选择性强，在自然界中难以降解，易对环境造成污染等缺陷。生物破乳剂是生物表面活性剂的一种，能够对乳状液进行破乳，可广泛应用于原油乳状液破乳、含油废水处理、食品加工、生物制药等领域，实现乳状液油水的分离。与化学破乳剂相比，生物破乳剂具有高效、低毒性、易生物降解等特点。Alcaligenessp.TR-1是从长期受石油污染的油田土壤中筛选得到的一株生物破乳菌，在原油乳状液和模型乳状液中具有较好的破乳效果。然而，目前破乳菌Alcaligenes sp.TR-1的生产方式仍以无机盐培养基(MMSM)发酵为主，人工配制培养基使得破乳菌的生产成本较高，占生产成本的70％以上，限制了破乳菌的进一步推广。故降低原料的成本是破乳菌能够在实际应用中广泛推广的关键因素。

城市生活污水厂剩余污泥富含碳、氮、磷、无机盐及微量金属元素，且具有一定的天然缓冲能力，是破乳菌Alcaligenes sp.TR-1生长所需营养元素的优质来源。使用经过超声处理所得的剩余污泥提取液进行破乳菌Alcaligenes sp.TR-1的培养，能为生物破乳剂提供一种低成本的生产方法，同时也为剩余污泥的减量与资源化提供了一条新途径。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生产成本极低、生产效率高、菌体产量高的利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)取城市生活污水处理厂剩余污泥，进行超声预处理，随后进行固液分离得到澄清的污泥提取液；

(2)污泥提取液经过pH调整及投加额外碳源后，形成完整培养基，灭菌后，接种生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液，发酵培养，即得到生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1。

所述的生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1为从长期受石油污染的油田土壤中筛选得到的一株产碱杆菌，现以超低温冻结的方式保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2007年8月24日，保藏编号为CGMCC NO.2142，分类命名：产碱杆菌。生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1的基本培养方式为无机盐培养基(MMSM)培养，pH为7.0～10.0，发酵条件为恒温摇床中，30℃～35℃，130rpm～150rpm发酵7天；每升无机盐培养基含有以下成分：NH₄NO₃4.0g，K₂HPO₄4.0g，KH₂PO₄6.0g，MgSO₄·7H₂00.2g，微量元素溶液1ml，其中每升微量元素溶液中包含CaCl₂·2H₂O1000mg，FeSO₄·7H₂O1000mg，EDTA1400mg，无机盐培养基中添加体积分数1％～4％的液体石蜡作为碳源。

所述的污水处理厂剩余污泥为城市生活污水厂剩余污泥，污泥浓度为15.0g/L～20.0g/L。

所述的超声预处理的条件为：超声频率20kHz，超声能量(Specific Energy)为443kJ kg^-1TS～56647kJ kg^-1TS，实现超声能量的超声功率为10W～100W，超声时间为5min～64min。

所述的固液分离采用高速离心与过滤组合的方式，高速离心的转速为10000rpm～12000rpm，时间为10min～20min；过滤采用0.45μm微孔滤膜，固液分离后可得澄清的污泥提取液。

所述的污泥提取液含有有机碳、氨氮、有机氮组分以及磷、钾、钙、钠、镁、铝、铁元素，且具备一定酸碱缓冲能力。其能够为Alcaligenes sp.TR-1的发酵生产提供部分碳源，以及全部的氮源、磷源以及各类微量元素。

使用稀HCl溶液或稀NaOH溶液调整污泥提取液的pH值在7.0～10.0范围内。

步骤(2)所述的额外碳源为液体石蜡，液体石蜡的投加比例以体积分数计为1％～4％。

步骤(2)所述的灭菌的条件为高压120～125℃灭菌20min。

所述的生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液为经无机盐培养基培养基发酵7天后得到的Alcaligenes sp.TR-1菌体全培养液；生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液的接种比例以体积分数计为5％～15％。

步骤(2)所述的发酵培养的条件为：恒温摇床发酵，温度为30℃～35℃，摇床转速130～150rpm，发酵2～7天。

使用污泥提取液培养生物破乳菌所得产量较传统无机盐培养基有显著提高，最高可达2.03g/L(干粉固体，普通无机盐培养基为1.207g/L)，超过无机盐培养基培养的菌体68.3％。且根据Alcaligenes sp.TR-1在污泥提取液中的生长特性，菌体在发酵过程中第二天即能完成大部分的生长，缩短发酵时间能够提高生产效率。对模型乳状液(W/O)的破乳能力(破乳菌干粉投加量均为1000mg/L)相差不大，保持在较高的水平，在80％以上。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明使用的剩余污泥为污水处理过程中产生的废弃物，来源充足，作为生产生物破乳菌的原料，几乎无需投入成本。

(2)本发明中，使用剩余污泥提取液培养生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1，相比传统的无机盐培养基，能够有效提高菌体的产量，同时仍具有稳定高效的破乳能力。

(3)本发明中，使用剩余污泥提取液培养生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1，相比传统的无机盐培养基，所需的发酵时间更短，生产效率更高。

(4)剩余污泥作为污水处理的废弃产物，未经妥善处理会对环境造成严重危害，本发明将剩余污泥进行超声处理并固液分离，把获得的污泥提取液作为生产高附加值的生物破乳菌的原料，是剩余污泥资源化的一种新途径，对剩余污泥的处理处置与环境保护有重要意义。

附图说明

图1为生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1在超声能量为3540kJ·kg-1TS所获得的污泥提取液与MMSM培养基中的生长特性曲线；

图2为生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1在超声能量为42485kJ·kg-1TS所获得的污泥提取液与MMSM培养基中的生长特性曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1.剩余污泥取自上海市曲阳污水处理厂污泥浓缩池。污泥的性质如表1所示。使用超声细胞破碎仪对剩余污泥进行处理。超声所用的污泥体积为0.35L，超声能量为3540·kJ kg^-1TS，实现超声能量的超声功率和超声时间分别为10W-40min、20W-20min、80W-5min。将经过超声的剩余污泥在高速离心机中于12000rpm的转速下离心10min，随后经0.45μm微孔滤膜过滤，获得澄清的污泥提取液。污泥提取液中包含的有机碳、氮(包括氨氮及有机氮)、磷及各类微量元素浓度如表2所示。

表1.污泥样品基本情况

表2.超声条件为3540kJ kg^-1TS污泥提取液组分

2.使用1mol/L NaOH溶液将污泥提取液的pH值调至7.0，以100ml为一份分装至摇瓶中，加入4％(v/v)液体石蜡，形成完整培养基。进行121℃，20min灭菌处理，随后以10％(v/v)生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液进行接种，在恒温摇床中于35℃，130rpm的条件下发酵7天。使用无机盐培养基(MMSM)作为对照。

3.上述接种所用的Alcaligenes sp.TR-1全培养液为使用无机盐培养基(MMSM)培养所得的菌体全培养液。无机盐培养基的(1L)组成为NH₄NO₃4.0g，K₂HPO₄4.0g，KH₂PO₄6.0g，MgSO₄·7H₂00.2g，微量元素溶液1ml，碳源为液体石蜡4％(v/v)，pH＝7。其中微量元素溶液(1L)包含CaCl₂·2H₂O1000mg，FeSO₄·7H₂O1000mg，EDTA1400mg。

4.菌体产量的测定方法为：将培养后的菌体全培养液在12000rpm高速离心10min，获得湿菌，使用正己烷洗提离心3次，-50℃冷冻干燥24h得到菌体干粉，称重得到菌体质量，根据全培养液体积计算菌体产量。

5.菌体破乳性能的测试方法为：将菌体干粉加蒸馏水配成浓度为10g/L的菌悬液用于破乳实验，采用的模型乳状液为W/O型。破乳实验采用瓶试法：在20mL具塞刻度试管内加入18mL乳状液和2mL破乳菌溶液，手摇120次，置于35℃恒温水浴中，定时读取脱出油和脱出水的体积，计算破菌24h破乳率为菌体破乳性能。具体计算公式如下：

6.菌体产量：使用超声条件为3540kJ·kg^-1TS所得的污泥提取液所得菌体产量为1.33g/L。无机盐培养基(MMSM)培养所得的Alcaligenes sp.TR-1菌体的产量1.21g/L。超声条件为3540kJ·kg^-1TS所得的污泥提取液中破乳菌产量超过无机盐培养基(MMSM)9.9％。

7.破乳试验：使用超声条件为3540kJ·kg^-1TS所得的菌体24h破乳效率为82.1％。使用无机盐培养基(MMSM)培养所得菌体的24h破乳率为92.5％。污泥提取液培养菌体的破乳能力略低于无机盐培养基(MMSM)，但仍维持在较高水平，与无机盐培养基(MMSM)仅相差10.4％。

8.监测Alcaligenes sp.TR-1菌体在超声条件3540kJ·kg^-1TS所获得的污泥提取液与无机盐培养基(MMSM)中的生长规律，如图1所示。可以发现，7天的培养过程中，无机盐培养基(MMSM)中菌体的生长在前6天呈现一个逐渐上升的过程，并从第六天开始进入稳定期，菌体的生长在第六天才趋于完成；而在污泥提取液中，菌体在培养的第一和第二天即能完成大部分的生长，从第三天开始进入稳定期。表明菌体在污泥提取中可以使用更短的时间完成发酵，能够节省发酵生产所需的时间，发酵时间可以根据实际情况在选择2至7天。

9.比较而言，Alcaligenes sp.TR-1菌体在污泥提取液中所获得的生物量更高，且培养的所需的时间更短，相比于无机盐培养基(MMSM)，不仅节省了成本投入，同时提高了时间效率。污泥提取液培养的Alcaligenes sp.TR-1菌体破乳性能略低于无机盐培养基(MMSM)，但仍在较高水平。

实施例2

与实施例1不同的是，使用用超声条件为42485kJ·kg^-1TS的污泥提取液进行Alcaligenes sp.TR-1的发酵培养，实现超声能量的超声功率和超声时间分别为80W-60min、100W-48min。污泥提取液中包含的有机碳、氮(包括氨氮及有机氮)、磷及各类微量元素浓度如表3所示。

表3.超声条件为42485kJ kg^-1TS污泥提取液组分

使用用超声条件为42485kJ·kg^-1TS的污泥提取液培养Alcaligenes sp.TR-1获得的菌体产量为1.93g/L，超过无机盐培养基(MMSM)培养菌体的59.5％。菌体的24h破乳效率为84.4％，与无机盐培养基(MMSM)相差8.1％。监测Alcaligenessp.TR-1菌体在超声条件42485kJ·kg^-1TS所获得的污泥提取液与无机盐培养基(MMSM)中的生长规律，如图2所示。与实施例1相同，在污泥提取液中，菌体在培养的第一和第二天即能完成大部分的生长，从第三天开始进入稳定期。表明菌体在污泥提取中可以使用更短的时间完成发酵，能够节省发酵生产所需的时间，发酵时间可以根据实际情况在选择2至7天。

实施例3

与实施例2不同的是，向污泥提取液中投加石蜡的体积分数为2％。其他操作与实施例2相同。所得菌体产量为1.66g/L，超过无机盐培养基(MMSM)培养菌体的37.5％。菌体的24h破乳效率为84.0％，与无机盐培养基(MMSM)相差8.5％。其他操作方式与实施例2相同。

实施例4

与实施例2不同的是，向完整培养基中接种Alcaligenes sp.TR-1全培养液的体积分数为15％，其他操作与实施例2相同。获得的菌体产量为1.97g/L，超过无机盐培养基(MMSM)培养菌体的63.2％。菌体的24h破乳效率为84.5％，与无机盐培养基(MMSM)相差7.9％。

实施例5

与实施例2不同的是，恒温摇床中的发酵条件为30℃，转速150rpm，其他操作与实施例2相同。获得的菌体产量为1.89g/L，超过无机盐培养基(MMSM)培养菌体的56.5％。菌体的24h破乳效率为84.4％，与无机盐培养基(MMSM)相差8.1％。

Claims

1.一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(2)污泥提取液经过pH调整及投加额外碳源后，形成完整培养基，灭菌后，接种生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液，发酵培养，即得到生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1；

步骤(2)所述的额外碳源为液体石蜡，液体石蜡的投加比例以体积分数计为1％～4％；

所述的生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1为产碱杆菌，现以超低温冻结的方式保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.2142；

生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1的基本培养方式为无机盐培养基培养，pH为7.0～10.0，发酵条件为恒温摇床中，30℃～35℃，130rpm～150rpm发酵7天；

每升无机盐培养基含有以下成分：NH₄NO₃ 4.0g，K₂HPO₄ 4.0g，KH₂PO₄ 6.0g，MgSO₄·7H₂0 0.2g，微量元素溶液1ml，其中每升微量元素溶液中包含CaCl₂·2H₂O 1000mg，FeSO₄·7H₂O 1000mg，EDTA 1400mg，无机盐培养基中添加体积分数1％～4％的液体石蜡作为碳源；

所述的超声预处理的条件为：超声频率20kHz，超声能量为443kJ kg^-1TS～56647kJ kg^-1 TS，实现超声能量的超声功率为10W～100W，超声时间为5min～64min。

2.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，其特征在于，所述的污水处理厂剩余污泥为城市生活污水厂剩余污泥，污泥浓度为15.0g/L～20.0g/L。

3.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，其特征在于，所述的固液分离采用高速离心与过滤组合的方式，高速离心的转速为10000rpm～12000rpm，时间为10min～20min；过滤采用0.45μm微孔滤膜。

4.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，其特征在于，调整污泥提取液的pH值在7.0～10.0范围内。

5.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述的灭菌的条件为高压120～125℃灭菌20min。

6.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，其特征在于，所述的生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液为经无机盐培养基培养基发酵7天后得到的Alcaligenes sp.TR-1菌体全培养液；生物破乳菌Alcaligenes sp.TR-1全培养液的接种比例以体积分数计为5％～15％。

7.根据权利要求1所述的一种利用剩余污泥超声提取液生产生物破乳菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述的发酵培养的条件为：恒温摇床发酵，温度为30℃～35℃，摇床转速130～150rpm，发酵2～7天。