JP2007252279A - マンノシルエリスリトールリピッドの高効率生産方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】バイオサーファクタントの一種である糖脂質、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を、微生物を用いて効率よく生産することができる方法を提供する。
【解決手段】植物油脂等の油脂類を主成分とするＭＥＬ生産用培地において、ＭＥＬの生産能力を有する微生物、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐａｒａｎｔａｒｃｔｉｃａを培養する。その際、培養温度を３３〜３７℃とすることにより、ＭＥＬが効率よく生産される。
【選択図】なし
【解決手段】植物油脂等の油脂類を主成分とするＭＥＬ生産用培地において、ＭＥＬの生産能力を有する微生物、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｐａｒａｎｔａｒｃｔｉｃａを培養する。その際、培養温度を３３〜３７℃とすることにより、ＭＥＬが効率よく生産される。
【選択図】なし
Description
本発明は、バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッドの生産効率（生産量、生産速度、及び収率）を大幅に向上させることができるマンノシルエリスリトールリピッドの生産方法に関する。
糖脂質は、脂質に１〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系及び免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。また、糖脂質は，糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する両親媒性物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤 （バイオサーファクタント）が利用されていた。近年、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となったが、この合成界面活性剤の使用量の拡大に伴って環境汚染が広がり、社会問題が生じている。このため、安全性が高く、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性物質の開発が望まれている。
従来より、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質の５つに分類されている。これらの中でも、糖脂質系の界面活性剤が最もよく研究されており、細菌及び酵母による多くの種類の界面活性物質が報告されている。
前記細菌としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属によるラムノリピッド（非特許文献１及び２参照）とユスチラジン酸（非特許文献３参照）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属によるトレハロースリピッド（非特許文献４参照）などが知られている。しかし、いずれも生産量は１５ｇ／Ｌ以下である。
前記酵母としては、Ｃａｎｄｉｄａ属によるソホロースリピッドとマンノシルエリスリトールリピッド（特許文献１参照）などが知られている。
前記ソホロースリピッドについては、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａを用いてグルコースとオレイン酸の流加培養法により２００時間で１８０ｇ／Ｌの効率的なソホロースリピッドの生産が可能であることが報告されている（非特許文献５参照）。
前記細菌としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属によるラムノリピッド（非特許文献１及び２参照）とユスチラジン酸（非特許文献３参照）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属によるトレハロースリピッド（非特許文献４参照）などが知られている。しかし、いずれも生産量は１５ｇ／Ｌ以下である。
前記酵母としては、Ｃａｎｄｉｄａ属によるソホロースリピッドとマンノシルエリスリトールリピッド（特許文献１参照）などが知られている。
前記ソホロースリピッドについては、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａを用いてグルコースとオレイン酸の流加培養法により２００時間で１８０ｇ／Ｌの効率的なソホロースリピッドの生産が可能であることが報告されている（非特許文献５参照）。
前記マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）については、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．Ｂ−７株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ／Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献６及び７参照）。また、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ−３４株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献８及び９参照）。同じく、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ−３４株を用いて６日間隔で計３回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１０参照）。
Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．ＳＹ−１６株を用いて１０質量％の植物油脂から回分培養法により２００時間で５０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であると共に、流加培養法により２０質量％の植物油から２００時間で１２０ｇ／Ｌ（生産速度：０．６ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１１参照）。
Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ （生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１２参照）。
また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油（あぶら）を原料としてＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ−３４株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７ｇ／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが提案されている（特許文献２参照）。
Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ／Ｌ （生産速度：０．５７ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：９２質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている（非特許文献１２参照）。
また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油（あぶら）を原料としてＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｔ−３４株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から１７ｇ／Ｌ（生産速度：０．１ｇ／Ｌ／ ｈ、原料収率：２１質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが提案されている（特許文献２参照）。
一方、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれるマンノシルエリスリトールリピッドなどのバイオサーファクタントを食品工業、医薬品工業、化学工業などで広く普及させていくためには、マンノシルエリスリトールリピッドの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることが必要である。本発明は、このような要望に応え、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を用い、その培地組成及び培養条件を最適化することによって、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を効率よく生産することができる方法を提供することを目的とする。
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、マンノシルエリスリトールリピッド生産する能力を有する微生物を、植物油脂等の油脂類を主成分として含有する培地で培養してマンノシルエリスリトールリピッドを生産するに際し、培養温度を３３〜３７℃に設定することにより、マンノシルエリスリトールリピッドを高い生産効率で生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）油脂類含有培地でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを生産するに際し、培養温度を３３〜３７℃に設定することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
（２）上記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物であることを特徴とする上記（１）に記載の生産方法。
（３）シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）に属する微生物であることを特徴とする、上記（２）に記載の生産方法。
（４）初発油脂類濃度が２〜３０重量％である培地で培養を行うことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生産方法。
（５）初発油脂類濃度が２〜３０質量％である培地で培養を開始し、該培養開始後５〜７日目より油脂類及び／又はその他の栄養源を培地中に供給することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生産方法。
（６）培地の窒素源として硝酸アンモニウムを使用することを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の生産方法。
（７）培地組成が、以下に示されるものであることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれか に記載の生産方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
硝酸ナトリウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
植物油脂：２０〜３００ｇ／Ｌ
（１）油脂類含有培地でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを生産するに際し、培養温度を３３〜３７℃に設定することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
（２）上記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物であることを特徴とする上記（１）に記載の生産方法。
（３）シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）に属する微生物であることを特徴とする、上記（２）に記載の生産方法。
（４）初発油脂類濃度が２〜３０重量％である培地で培養を行うことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生産方法。
（５）初発油脂類濃度が２〜３０質量％である培地で培養を開始し、該培養開始後５〜７日目より油脂類及び／又はその他の栄養源を培地中に供給することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の生産方法。
（６）培地の窒素源として硝酸アンモニウムを使用することを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の生産方法。
（７）培地組成が、以下に示されるものであることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれか に記載の生産方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
硝酸ナトリウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
植物油脂：２０〜３００ｇ／Ｌ
本発明によれば、マンノシルエリスリトールリピッドを生成する能力を有する微生物を植物油脂等の油脂類含有培地で培養するに際し、培養温度を３３〜３７℃、特に３５℃に設定することで、マンノシルエリスリトールリピッドを極めて効率良く生産できる。特に、シュードザイマ属に属する微生物であるシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752）を使用する場合には生産速度が約２倍に上昇する。
本発明によって、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する際の温度制御エネルギーの削減が可能になる。つまり、マンノシルエリスリトールリピッド生産の際、発酵熱が生じるため培養温度の制御が必要であるが、以前の生産方法における培養温度が30℃以下であるのに対して、本発明では培養温度を35℃以上に設定することができ、5℃以上の冷却コスト（エネルギー）を削減することが可能である。
生産効率の向上に伴い、高い生産性を得るための培養手段の簡素化も期待できる。すなわち、以前の生産方法では、100 g/L 以上のマンノシルエリスリトールリピッドを得るために、数週間、培養状態のモニタリングと栄養源の途中添加が必要であった。一方、本発明によれば、1週間、振とう培養のみで100 g/L 以上のマンノシルエリスリトールリピッドが得られ、特殊な装置や培養状態のモニタリングと栄養源の途中添加は不要である。また、より高い生産量を得るために、数週間、培養状態のモニタリングと栄養源の途中添加を行えば、当然、以前の生産方法を凌駕する生産量が達成できる。
さらに、本発明においては、植物油等の油脂類の消費速度も向上するため、結果としてこれら由来の油分の生成物への混入を低減し、マンノシルエリスリトールリピッドの分離精製においても効果が期待できる。
したがって、本発明は、医薬等種々用途への使用が期待されるバイオサーファクタントの生産技術の発展に大いに貢献するものである。
したがって、本発明は、医薬等種々用途への使用が期待されるバイオサーファクタントの生産技術の発展に大いに貢献するものである。
（目的生産物）
本発明の目的生産物であるマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、下記構造式（１）で表される化合物である。
本発明の目的生産物であるマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、下記構造式（１）で表される化合物である。
前記構造式（１）において、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数１〜１４、好ましくは３〜１２の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
前記マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、高い界面活性作用を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用いられる。ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると顆粒系を分化させる白血病細胞細胞分化誘導作用があり、 また、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞株分化誘導作用等の生理活性作用を有する。更に、微生物産生の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり（Ｘ． Ｚｈａｏ ｅｔ． ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９， ４８２−４８６（１９９９））、癌細胞増殖抑制作用がある。これらの生理作用から見て、マンノシルエリスリトールリピッドには抗ガン剤等の医薬としての用途が期待される。また、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）には生分解性があり、高い安全性を有すると考えられているものである。
前記マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）は、高い界面活性作用を有し、界面活性剤又はファインケミカルの種々の触媒として用いられる。ヒト急性前骨髄性白血病細胞性ＨＬ６０株にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると顆粒系を分化させる白血病細胞細胞分化誘導作用があり、 また、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞にマンノシルエリスリトールリピッドを作用させると神経突起の伸長が生ずる神経系細胞株分化誘導作用等の生理活性作用を有する。更に、微生物産生の糖脂質として初めて、メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導することが可能となり（Ｘ． Ｚｈａｏ ｅｔ． ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９， ４８２−４８６（１９９９））、癌細胞増殖抑制作用がある。これらの生理作用から見て、マンノシルエリスリトールリピッドには抗ガン剤等の医薬としての用途が期待される。また、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）には生分解性があり、高い安全性を有すると考えられているものである。
（使用微生物）
本発明の使用微生物については、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ属に属する微生物が挙げられ、このうち特に好ましい微生物としては、シュードザイマ・パラアンタクティカに属する微生物が挙げることができる。該微生物はマンノシルエリスリトール生産微生物として知られていなかったものであるが、本発明者等により、シュードザイマ・アンタクチカ等の既知のマンノシルエリスリトールリピッド生産菌と同等の生産性を有することが初めて確認されたものである。しかも、このシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）に属する微生物は、例えば３３〜３７℃で培養した場合の生産性向上効果が特に高く、例えば、シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）JCM 11752株の場合、培養温度３５℃の場合約２倍に達する点で特筆すべきものである。
本発明の使用微生物については、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ属に属する微生物が挙げられ、このうち特に好ましい微生物としては、シュードザイマ・パラアンタクティカに属する微生物が挙げることができる。該微生物はマンノシルエリスリトール生産微生物として知られていなかったものであるが、本発明者等により、シュードザイマ・アンタクチカ等の既知のマンノシルエリスリトールリピッド生産菌と同等の生産性を有することが初めて確認されたものである。しかも、このシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）に属する微生物は、例えば３３〜３７℃で培養した場合の生産性向上効果が特に高く、例えば、シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）JCM 11752株の場合、培養温度３５℃の場合約２倍に達する点で特筆すべきものである。
（マンノシルエリスリトールリピッドの生産）
本発明における使用微生物の培養においては、培地に、脂肪酸、脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステル類、あるいは植物油等の油脂類を含有させるが、温度条件以外の条件については、特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。
ＭＥＬの生産量を増加させるためには培養温度を３３〜３７℃に設定することが好ましく、本発明者等は、培養開始時の培養温度を変化させて培養を行った結果、培養温度を３５℃に設定した場合に、特に良好なＭＥＬの生産速度、生産量、及び収率が得られるという知見を得ている。
本発明における使用微生物の培養においては、培地に、脂肪酸、脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステル類、あるいは植物油等の油脂類を含有させるが、温度条件以外の条件については、特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。
ＭＥＬの生産量を増加させるためには培養温度を３３〜３７℃に設定することが好ましく、本発明者等は、培養開始時の培養温度を変化させて培養を行った結果、培養温度を３５℃に設定した場合に、特に良好なＭＥＬの生産速度、生産量、及び収率が得られるという知見を得ている。
本発明の使用微生物、特に前記シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752）株を用いてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合の好適な培地組成は、以下のとおりである。
酵母エキスは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい
硝酸ナトリウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。
リン酸２水素カリウムは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。
硫酸マグネシウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
植物性油脂は、８０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
酵母エキスは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい
硝酸ナトリウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。
リン酸２水素カリウムは、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。
硫酸マグネシウムは、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
植物性油脂は、８０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、種培養、本培養及びマンノシルエリスリトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが望ましい。
これらの培養における、培地、培養条件を例示すると以下のとおりである。
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。
これらの培養における、培地、培養条件を例示すると以下のとおりである。
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。
ｂ）本培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３３〜３７℃で２日間培養を行う。
ｃ）マンノシルエリスリトールリピッド生産培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３３〜３７℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植物性油脂を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を４０〜２００ｇ／Ｌに保持することが望ましい。
ｃ）マンノシルエリスリトールリピッド生産培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３３〜３７℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植物性油脂を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を４０〜２００ｇ／Ｌに保持することが望ましい。
以下に、本発明におけるマンノシルエリスリトールリピドの生産について実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
なお、以下の実施例においては、マンノシルエリスリトールリピド生産試験用培地として、上記ｂ）の本培養の培地を用いた。
なお、以下の実施例においては、マンノシルエリスリトールリピド生産試験用培地として、上記ｂ）の本培養の培地を用いた。
（Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養）
ａ）保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma parantarctica JCM 11752株を、 グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し30℃で振とう培養を行い、次いで、
ｂ）得られた菌体培養液を所定量の植物性油脂と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地２０ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、35℃で振とう培養を行った。
ｃ）これを所定量の大豆油と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、35℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行った。さらに、培養途中から1週間毎に植物性油脂（大豆油）を培養容器中に流下した。
ａ）保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存しておいたPseudozyma parantarctica JCM 11752株を、 グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し30℃で振とう培養を行い、次いで、
ｂ）得られた菌体培養液を所定量の植物性油脂と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液 体培地２０ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、35℃で振とう培養を行った。
ｃ）これを所定量の大豆油と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、35℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行った。さらに、培養途中から1週間毎に植物性油脂（大豆油）を培養容器中に流下した。
上記ａ）-c）の各培養により得られた菌体培養液を使用して、以下の（1）〜（7）に示される試験を行った。
（試験手法、結果）
（１）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産能の確認
a）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を大豆油添加培地で７日間行った後の培養液を採取し、これを用いてPseudozyma parantarctica JCM 11752株のバイオサーファクタントの生産性を薄層クロマトグラフィーで確認した。マンノシルエリスリトールリピッドの標準として、Pseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品を用いた。マンノシルエリスリトールリピッド標準における、ＭＥＬ−Ａ，ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃはそれぞれ順に一般式中（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３、４=アセチル基）、同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=水素原子、Ｒ４=アセチル基）及び同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=アセチル基、Ｒ４=水素原子）で表される化合物を示す。
結果を図１に示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産している。また、マンノシルエリスリトールリピッドの標準と対比して、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産しているバイオサーファクタントはマンノシルエリスリトールリピッドであることがわかる。
（試験手法、結果）
（１）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産能の確認
a）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を大豆油添加培地で７日間行った後の培養液を採取し、これを用いてPseudozyma parantarctica JCM 11752株のバイオサーファクタントの生産性を薄層クロマトグラフィーで確認した。マンノシルエリスリトールリピッドの標準として、Pseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品を用いた。マンノシルエリスリトールリピッド標準における、ＭＥＬ−Ａ，ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃはそれぞれ順に一般式中（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３、４=アセチル基）、同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=水素原子、Ｒ４=アセチル基）及び同（Ｒ１、２＝炭素原子数１〜１４の脂肪酸残基、Ｒ３=アセチル基、Ｒ４=水素原子）で表される化合物を示す。
結果を図１に示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）を生産している。また、マンノシルエリスリトールリピッドの標準と対比して、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産しているバイオサーファクタントはマンノシルエリスリトールリピッドであることがわかる。
（２）マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）生産用培地で同リピッドの生産
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を大豆油添加培地で７日間行った。培養液を採取し、精製後、生産されたＭＥＬを高速液体クロマトグラフィーで検出した。また、比較例としてPseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、同様にして高速液体クロマトグラフィーで検出した。結果を図２に示す。なお、図２は、培養液中の酢酸エチル可溶分を精製後、高速液体クロマトグラフィーで検出した結果であり、既知のマンノシルエリスリトールリピッドのものと一致する。図２によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株はPseudozyma antarctica JCM 10317株と同様にMEL生産能力を有する。
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を大豆油添加培地で７日間行った。培養液を採取し、精製後、生産されたＭＥＬを高速液体クロマトグラフィーで検出した。また、比較例としてPseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、同様にして高速液体クロマトグラフィーで検出した。結果を図２に示す。なお、図２は、培養液中の酢酸エチル可溶分を精製後、高速液体クロマトグラフィーで検出した結果であり、既知のマンノシルエリスリトールリピッドのものと一致する。図２によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株はPseudozyma antarctica JCM 10317株と同様にMEL生産能力を有する。
（3）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産するマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の構造解析
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を大豆油添加培地で７日間行った。培養液を採取し、培養液中のＭＥＬを酢酸エチルで抽出し、精製後、１H NMR で生産物の構造解析を行った（上段）。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma antarctica JCM 10317株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図３によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する物質は典型的なMELの構造を有することが明らかである。
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を大豆油添加培地で７日間行った。培養液を採取し、培養液中のＭＥＬを酢酸エチルで抽出し、精製後、１H NMR で生産物の構造解析を行った（上段）。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma antarctica JCM 10317株が生産するMELの分析結果を下段に示す。図３によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する物質は典型的なMELの構造を有することが明らかである。
（4）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株のMEL生産に対する窒素源の影響
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を大豆油添加培地で７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の窒素源はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図４に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株によるMEL生産において、最適な窒素源は硝酸ナトリウムである。
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を大豆油添加培地で７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の窒素源はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図４に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株によるMEL生産において、最適な窒素源は硝酸ナトリウムである。
（5）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株のMEL生産に対する植物性油脂の影響
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の植物性油脂はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図５に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株は各種植物性油脂からMELを生産し、大豆油が最も良好な結果を示した。
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中の植物性油脂はそれぞれ図中に記載した組成に調製したものを用いた。結果を図５に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株は各種植物性油脂からMELを生産し、大豆油が最も良好な結果を示した。
（6）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株のMEL生産に対する植物性油脂濃度の影響
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に図中に示す量の大豆油を添加した。結果を図６に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株によるMELの生産量は約５０ｇ/Ｌである。
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養液中に図中に示す量の大豆油を添加した。結果を図６に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株によるMELの生産量は約５０ｇ/Ｌである。
（７）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株のMEL生産に対する培養温度の影響
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を大豆油添加培地で７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養温度を図７に示すように設定した。結果を図７に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の最適生産温度は35℃であり、30℃の場合と比べてMELの生産量は２倍以上高くなる。
Pseudozyma parantarctica JCM 11752株を用い、ａ）の培養を１日間行った後、b）の培養を大豆油添加培地で７日間行った後、培養液を採取し、そのＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで検出した。このとき、培養温度を図７に示すように設定した。結果を図７に示す。この結果によれば、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の最適生産温度は35℃であり、30℃の場合と比べてMELの生産量は２倍以上高くなる。
（８）Pseudozyma parantarctica JCM 11752株のMEL生産培養
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、35℃で１０日間行い、続いて、ｃ）の培養を行った。ｃ）の培養は160ｇ/Lの大豆油を含む培地を用いて35℃で行った。培養途中から160ｇ/Lの植物性油脂を１週間毎に培養容器中に流下させた。図８は、１週間毎に培養液を採取し、ＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで定量して作製したグラフである。矢印は炭素源を添加した時点を示している。図８によると、１４日間で生産されたMELの量は１９０ｇ/L以上に達している。
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、35℃で１０日間行い、続いて、ｃ）の培養を行った。ｃ）の培養は160ｇ/Lの大豆油を含む培地を用いて35℃で行った。培養途中から160ｇ/Lの植物性油脂を１週間毎に培養容器中に流下させた。図８は、１週間毎に培養液を採取し、ＭＥＬ生産量を高速液体クロマトグラフィーで定量して作製したグラフである。矢印は炭素源を添加した時点を示している。図８によると、１４日間で生産されたMELの量は１９０ｇ/L以上に達している。
Claims (7)
- 油脂類含有培地でマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養してマンノシルエリスリトールリピッドを生産するに際し、培養温度を３３〜３７℃に設定することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの生産方法。
- 上記マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物が、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物であることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
- シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物がシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）に属する微生物であることを特徴とする、請求項２に記載の生産方法。
- 初発油脂類濃度が２〜３０重量％である培地で培養を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の生産方法。
- 初発油脂類濃度が２〜３０質量％である培地で培養を開始し、該培養開始後５〜７日目より油脂類及び／又はその他の栄養源を培地中に供給することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の生産方法。
- 培地の窒素源として硝酸アンモニウムを使用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の生産方法。
- 培地組成が、以下に示されるものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか に記載の生産方法。
酵母エキス：０．１〜２ｇ／Ｌ
硝酸ナトリウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
リン酸２水素カリウム：０．１〜２ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム：０．１〜１ｇ／Ｌ
植物油脂：２０〜３００ｇ／Ｌ
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