KR101485315B1

KR101485315B1 - 발효 식물성 오일 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101485315B1
Application number: KR20120093218A
Authority: KR
Inventors: 김광년; 심지영; 손주현; 김민석; 김희식
Original assignee: (주)다미화학; 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2015-01-23
Also published as: EP2749651A4; EP2749651A2; WO2013032189A9; US20160354301A1; EP2749651B1; US20140194513A1; US10188594B2; WO2013032189A3; KR20130023162A; JP2014525245A; JP5974095B2; WO2013032189A2

Abstract

본 발명은 발효 식물성 오일, 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물에 의하여 발효됨으로써, 포수력에 따른 유화안정성 향상, 사용감 및 향미 개선, 보습력 향상의 효과가 있는 발효 식물성 오일을 제공하는 기술에 관한 것이다.

Description

발효 식물성 오일 및 이를 포함하는 조성물{FERMENTED OIL AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 발효 식물성 오일 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물에 의하여 발효됨으로써, 포수력에 따른 유화안정성 향상, 사용감 및 향미 개선, 보습력 향상의 효과가 있는 발효 식물성 오일을 제공하는 기술에 관한 것이다.

오일의 조성에 변화를 줌으로써 기능의 변화를 유도할 수 있는 다양한 기술을 개발하는 것은, 다양한 상품을 개발하고자 하는 산업적 요구에 부응하는데 매우 중요하다.

일반적으로 발효 오일이라고 하면, 인삼 등 한약재를 발효하고 지용성 성분을 추출하여 오일에 첨가하거나, 오일에 인삼 등 한약재를 첨가하여 숙성한 것을 의미한다.

또한, 어류 또는 코코넛 등을 발효하여 지용성 성분을 추출한 오일, 유지종자(대두, 해바라기씨, 포도씨, 참깨 등)를 침지·발아 또는 증숙 과정을 거친 후 추출한 오일을 일컬어 발효 오일이라고도 한다.

그러나, 대량의 오일에 미생물을 배양하고 발효하여 구조 및 기능, 향미를 개선시킨 기술은 전무하다고 할 수 있다.

본 발명은 미생물에 의하여 발효됨으로써 포수력에 따른 유화안정성 향상, 사용감 및 향미 개선, 보습력 향상의 효과가 있는 발효 식물성 오일을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 간편한 방법으로 미생물에 의하여 발효된 발효 식물성 오일의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 미생물에 의하여 발효된 발효 식물성 오일을 유효성분으로 포함함으로써, 유화안정성 향상, 사용감 및 향미 개선, 보습력 향상의 효과가 있는 피부외용제 또는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 발효 식물성 오일은 미생물에 의하여 발효된 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 발효 식물성 오일의 제조방법은 (a) 미생물을 호기 조건에서 배양액에 1차 배양하는 단계; (b) 상기 배양액에 식물성 오일을 첨가하고, 2차 배양하는 단계; 및 (c) 2차 배양을 마친 식물성 오일을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 미생물에 의하여 발효된 발효 식물성 오일을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 발효 식물성 오일은 포수력에 따른 유화안정성이 우수하여 토너 혹은 에센스 타입의 제품에 적용하여 제품화하기에 용이하다.

또한 본 발명에 따른 발효 식물성 오일은 발효 전 보다 사용감이 가볍고 보습감이 우수하다.

또한 본 발명에 따른 발효 식물성 오일은 유사한 효과를 갖는 천연 오일 및 숙성 오일과 비교할 때, 보다 높은 안정성 및 사용성을 갖는다.

도 1은 유화안정도를 분석한 결과로써, 도 1a는 올리브 오일의 유화 활성을 측정한 결과를, 도 1b는 올리브 오일의 시간에 따른 유화 안정도 평가 사진을, 도 1c는 발효 올리브 오일의 유화 활성을 측정한 결과를, 도 1d는 발효 올리브 오일의 시간에 따른 유화 안정도 평가 사진을, 도 1e는 발효 오일 종류에 따른 유화활성을 비교한 결과를, 도 1f 내지 도 1m은 발효 오일 종류에 따른 유화활성 평가 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 기체 크로마토그래프로 지방산을 분석한 결과로, 도 2a는 지방산 분포도, 도 2b는 올리브 오일의 지방산 분석, 도 2c는 발효 올리브 오일의 지방산 분석 결과이다.
도 3은 산가측정결과로써, 도 3a는 올리브 오일의 산가, 도 3b는 발효 올리브 오일의 산가를 측정한 결과이다.
도 4는 인간섬유아세포에서 세포 증식 및 독성에 미치는 영향을 측정한 결과로써, 각각 도 4a는 콩 오일과 발효 콩 오일, 도 4b는 올리브 오일과 발효 올리브 오일, 도 4c는 녹차 오일과 발효 녹차 오일, 도 4d는 아르간 오일과 발효 아르간 오일의 세포생존율 결과이다.
도 5는 TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여 성분들을 분석한 결과로써, 도 5a는 올리브오일과 발효 올리브 오일, linoleic acid와 linolenic acid의 2D-TLC 결과이고, 도 5b는 콩 오일과 발효 콩 오일, 녹차 오일과 발효 녹차 오일, 아르간 오일과 발효 아르간 오일의 2D-TLC 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 발효 식물성 오일, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

발효 식물성 오일

본 발명의 발효 식물성 오일은 미생물에 의해 발효된 것을 특징으로 한다.

여기에서, 상기 미생물은 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P)인 것이 바람직한바, 상기 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P)은 원통 모양으로, 극성 발아 형식으로 증식하며, 균사 및 자낭포자와는 구별되는 내생포자를 형성한다.

또한 본 발명의 발효 식물성 오일은 산가가 0.100~2.000인 식물성 오일을 포함하는 배지를 이용하여, 상기 미생물에 의하여 발효된 것을 특징으로 한다.

여기에서 배지에 사용되어 발효되는 식물성 오일은 올리브 오일, 콩 오일, 녹차 오일, 아르간 오일 등 통상적인 식물성 오일이라면 제한이 없으나, 특히 산가가 0.100~2.000의 범위인 것이 바람직하고, 특히 산가가 낮을수록 발효효율이 높은 바, 0.1~0.5의 범위인 것이 바람직하다. 산가가 0.100 미만인 식물성 오일은 거의 존재하지 않으며, 2.000를 초과하는 경우에는 발효효율 저하의 문제가 있다.

본 발명의 발효 식물성 오일은 상기 미생물에 의해 발효됨으로써, 발효되기 전 보다 필수지방산 함량이 높은 것을 특징으로 한다. 이 때 발효 후의 필수지방산의 함량은 발효 전 대비 5.0~140.0배에 이른다.

여기에서, 상기 필수지방산은 특히 리놀레산이 바람직하다. 리놀레산은 표피 지질 이중막의 중요한 구성성분으로, 표피 각화층 세라마이드에 함유되어 있다. 이러한 리놀레산은 피부 보습, 피부 항상성 유지, 피부 투과층의 형성 및 보호에 효과적이기 때문에, 본 발명의 발효 식물성 오일에 포함되는 필수지방산은 리놀레산인 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 발효 식물성 오일은 상기 미생물에 의해 발효됨으로써, 발효되기 전 보다 유리지방산 함량이 높은 것을 특징으로 한다. 이 때 발효 후의 유리지방산의 함량은 발효 전 대비 5.0~140.0배에 이른다.

여기에서, 상기 유리지방산은 지방산이 글리세라이드로서 결합형태를 취하지 않는 것을 의미한다. 유리지방산의 함량이 높아지면 끈적임이 감소하여 사용감이 향상되고, 사용 후 번들거림 개선에 효과적이므로, 본 발명의 발효 식물성 오일은 유리지방산 함량이 높은 것이 바람직하다.

발효 식물성 오일의 제조방법

본 발명의 발효 식물성 오일의 제조방법은 (a) 미생물을 호기 조건에서 배양액에 1차 배양하는 단계; (b) 상기 배양액에 식물성 오일을 첨가하고, 2차 배양하는 단계; 및 (c) 2차 배양을 마친 식물성 오일을 회수하는 단계를 포함한다.

먼저, (a) 미생물을 호기 조건에서 배양액에 1차 배양한다.

여기에서 배양액은 식물성 오일이 아직 함유되지 않은 것으로서, 식물성 오일의 발효가 잘 일어나도록 다양한 종류의 배양물질들을 배합하는 것이 중요하다. 특히 글루코스, 이스트 추출물, 말트 추출물, 펩톤, 으깬 대두(soya bean meal), (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, NaCl 중에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하다.

1차 배양 시간은 24 ~ 72시간, 특히 바람직하게는 30~60시간인 것이 바람직하다. 상기 범위 내에서 리파아제 활성이 가장 높게 나타나기 때문이다.

다음으로, (b) 1차 배양을 마친 배양액에 식물성 오일을 첨가하여 2차 배양한다.

배양액에서 식물성 오일의 발효를 최적화하기 위해서는 산가가 낮은 식물성 오일을 사용하는 것이 중요하다. 즉 최적의 배지조건을 결정하는 것은 식물성 오일의 산가로서, 상기한 바와 같이 식물성 오일의 산가는 0.100~2.000의 범위인 것이 바람직하고, 특히 산가가 낮을수록 발효효율이 높은 바, 0.1~0.5의 범위인 것이 바람직하다. 산가가 0.100 미만인 식물성 오일은 거의 존재하지 않으며, 2.000를 초과하는 경우에는 발효효율 저하의 문제가 있기 때문이다.

여기에서 식물성 오일은, 식물성 오일이 아직 들어가지 않은 상기 배양액 100중량부 대비 100중량부 이하로 투입한다. 상기 식물성 오일의 투입량은 목적하는 발효 식물성 오일의 양에 따라서 적절히 조절할 수 있으나, 식물성 오일을 식물성 오일을 포함하는 배양액 100중량부 대비 100중량부를 초과하여 투입하면 오일이 충분히 발효되지 않을 우려가 있다.

여기에서, 2차 배양 시간은 72 ~120시간인 것이 바람직하다. 2차 배양에 따른 발효가 진행됨에 따라 유리지방산이 최대로 나올 수 있을 정도의 시간이 확보되어야 하기 때문이다. 또한 상기 시간은 식물성 오일의 종류에 따라 다르므로 시간에 따른 유리지방산의 증가량을 측정하여, 유리지방산이 더 증가하지 않는 시간에 도달하면 2차 배양을 마무리할 수 있게 된다.

마지막으로, (c) 2차 배양을 마친 식물성 오일을 회수한다.

회수방법에는 특별히 제한이 없으며, 회수된 식물성 오일은 발효가 된 것으로서 피부 외용제 또는 화장료 조성물의 유효성분으로 활용할 수 있다.

발효 식물성 오일을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물

본 발명은 미생물에 의해 발효된 발효 식물성 오일을 유효성분으로 함유하며, 피부 외용제 또는 화장료의 용도로 사용되는 조성물을 포함한다.

본 발명에 의한, 미생물에 의해 발효된 발효 식물성 오일은 유화활성과 유화안정도가 높고, 필수지방산 및 유리지방산의 함량이 일반 오일에 비하여 현저히 높은바, 사용감, 보습력이 매우 우수하여 피부 외용제 또는 화장료 조성물의 용도에 적합하다.

이 때, 본 발명의 피부 외용제 또는 화장료 조성물에 포함되는 발효 식물성 오일의 함량은 2~40중량%인 것이 바람직하다.

발효 식물성 오일의 함량이 2중량% 미만일 경우에는 발효 식물성 오일이 충분히 함유되지 않아 제품의 효과가 미미하다는 문제가 있고, 40중량%를 초과하는 경우에는 제형을 만드는데 어려움이 있다.

본 발명의 피부 외용제 또는 화장료 조성물에 포함되는 성분은 상기한 발효 식물성 오일 이외에, 피부 외용제 또는 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 피부 외용제 또는 화장료 조성물에 함유된 담체는 제형에 따라 당업계에서 통상적으로 이용되는 담체가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일이 있으며, 특히 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

더욱이, 본 발명의 화장품 조성물은 담체 이외에 다른 보조제를 포함할 수 있는데, 예를 들면 보존제, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료 등을 포함할 수 있다.

실시예

<미생물에 의한 발효 오일 생산 최적 배지 조성>

미생물에 의한 발효 오일 생산에 적합한 배지 조성을 결정하기 위해 아래와 같은 8가지 배지 조성 1L에 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16[KCTC 8950P]를 접종하여 25℃, 300rpm, 호기조건하에서 배양하였다.

미생물에 의한 발효 오일 생산 배지 조성

조성 1	조성 2	조성 3	조성 4
글루코스 15 g/L 올리브오일 100 g/L (NH₄)₂SO₄ 1 g/L K₂HPO₄ 2.5 g/L MgSO₄ 0.5 g/L CaCl₂ 0.1 g/L MnSO₄ 0.02 g/L NaH₂PO₄ 0.1 g/L peptone 1 g/L 증류수 879.78 g/L	수크로스 10 g/L 올리브오일 100 g/L yeast extract 3 g/L skim milk 3 g/L casein 3 g/L soya bean meal 3 g/L NH₄NO₃ 2 g/L KH₂PO₄ 1 g/L MgSO₄ 0.5 g/L CaCl₂ 0.1 g/L NaCl 0.1 g/L 증류수 874.3 g/L	글루코스 10 g/L 올리브오일 100 g/L yeast extract 3 g/L malt extract 3 g/L peptone 5 g/L 증류수 879 g/L	글루코스 10 g/L 올리브오일 100 g/L yeast extract 3 g/L malt extract 3 g/L peptone 3 g/L soya bean meal 3 g/L (NH₄)₂SO₄ 2 g/L KH₂PO₄ 1 g/L MgSO₄ 0.5 g/L CaCl₂ 0.1 g/L NaCl 0.1 g/L 증류수 874.3 g/L
조성 5	조성 6	조성 7	조성 8
글루코스 10 g/L 알간오일 100 g/L yeast extract 3 g/L malt extract 3 g/L peptone 3 g/L soya bean meal 3 g/L (NH₄)₂SO₄ 2 g/L KH₂PO₄ 1 g/L MgSO₄ 0.5 g/L CaCl₂ 0.1 g/L NaCl 0.1 g/L 증류수 874.3 g/L	글루코스 10 g/L 녹차씨유 100 g/L yeast extract 3 g/L malt extract 3 g/L peptone 3 g/L soya bean meal 3 g/L (NH₄)₂SO₄ 2 g/L KH₂PO₄ 1 g/L MgSO₄ 0.5 g/L CaCl₂ 0.1 g/L NaCl 0.1 g/L 증류수 874.3 g/L	글루코스 10 g/L 포도씨유 100 g/L yeast extract 3 g/L malt extract 3 g/L peptone 3 g/L soya bean meal 3 g/L (NH₄)₂SO₄ 2 g/L KH₂PO₄ 1 g/L MgSO₄ 0.5 g/L CaCl₂ 0.1 g/L NaCl 0.1 g/L 증류수 874.3 g/L	글루코스 10 g/L 메도우폼씨유 100 g/L yeast extract 3 g/L malt extract 3 g/L peptone 3 g/L soya bean meal 3 g/L (NH₄)₂SO₄ 2 g/L KH₂PO₄ 1 g/L MgSO₄ 0.5 g/L CaCl₂ 0.1 g/L NaCl 0.1 g/L 증류수 874.3 g/L

24시간 배양 후, 배양액을 1ml씩 취하여 분광광도계를 이용하여 미생물의 성장도 및 리파아제 활성을 측정하였다.

미생물의 성장도는 각 조건에서 배양한 후 원심분리하여 오일층을 제거하고, 20초간 강하게 혼합하여 증류수로 10배 희석된 각 시료의 흡광도(660nm)를 측정하였다.

미생물의 리파아제 활성을 측정하기 위해 배양액을 12,000rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 사용하였으며, 기질과 결합된 p-니트로페놀(pNP)이 효소에 의해 유리되는 양을 흡광도(405nm)의 변화로 측정하는 마이크로플레이트 분석 방법으로 측정하였다. 미생물의 성장도와 리파아제 활성과 미 측정한 결과, 조성 4에서 가장 높은 성장도와 리파아제 활성을 나타내어 다음 발효 오일 제조에 적용하였다. 리파아제 활성은 조효소의 100μL가 1분 동안 1μg의 타이로신을 생산하는 양을 1 단위(unit)로 하였다.

측정결과 배지조성 4에서 가장 높은 미생물 성장도와 리파아제 활성을 나타내었으므로 이후 미생물에 의한 발효 오일 생산 최적 배지 조성으로 조성 4를 결정하였다.

배지조성에 따른 미생물의 성장도 및 리파아제 활성

	조성 1	조성 2	조성 3	조성 4	조성 5	조성 6	조성 7	조성 8
흡광도 (O.D at 660nm)	1.006	0.841	1.237	1.803	1.103	1.552	1.391	1.669
리파아제 활성 (U/mL)	1.9	1.1	2.9	3.4	2.1	2.9	2.6	3.2

<미생물에 의한 발효 오일의 제조>

1. 1차 배양

배양액(글루코스 10 g/L, 올리브오일 100 g/L, yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L, peptone 3 g/L, soya bean meal 3 g/L, (NH₄)₂SO₄ 2 g/L, KH₂PO₄ 1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L, CaCl₂ 0.1 g/L, NaCl 0.1 g/L: 상기 조성 4의 배지) 1 L에 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16[KCTC 8950P]를 접종하여 25℃, 300rpm, 호기조건하에서 배양하였다.

배양 후, 각각 시간대별(3, 7, 12, 24, 48, 72, 96h)로 배양액을 1ml씩 취하여 분광광도계를 이용하여 660nm 에서 미생물의 성장도 및 리파아제 활성을 측정하였다. 리파아제 활성을 측정한 결과, 가장 높은 리파아제 활성을 나타낸 1차 배양시간이 48시간임을 확인하였다.

2. 2차 배양 및 발효 오일의 생산

상기와 같은 배양액 100 L에 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16[KCTC 8950P]를 접종하여 48시간 동안 1차 배양을 수행한 다음, 올리브 오일 100 L를 배양액에 첨가하고 25℃, 500rpm, 호기조건하에서 2차 배양하였다. 2차 배양 후, 각각 시간대별(3, 7, 12, 24, 48, 72, 96, 120h)로 배양액을 0.3 ~ 0.5 L씩 취하여 오일부분만 회수하였다. 회수된 오일의 유리지방산을 측정하여 오일의 발효 정도를 확인하였다. 유리지방산의 증가량 측정 결과, 오일 첨가 이후 배양 96시간에서 유리지방산양이 최대임을 확인하였고, 그 이후에는 증가하지 않았다.

<평가>

1. 유화활성과 유화안정도

유화안정도는 유화물 형성 후 또는 혼합, 고온, 원심분리 등의 조건에서 유화물을 안정화시키는 유화제의 능력(ability)을 의미한다.

유화활성을 측정하기 위하여 올리브 오일과 발효 올리브오일 1ml를 pH에 따른 각각의 buffer 용액 10ml에 용해시킨 후 2분간 완전교반하여 유화시켰다. 그 후 10분간 정치시킨 뒤 620nm에서 흡광도를 측정함으로써 유화활성을 측정하였고, 유화안정도는 초기 흡광도에 대한 24시간 경과 후의 흡광도 백분율로 구하였다. pH 9.0 같은 경우 발효된 오일의 흡광도 측정에서 최대값을 넘어섰으나 기기의 예측 프로그램에 의해 값을 설정한 것을 기록하였다.

올리브 오일과 발효 올리브 오일의 pH에 대한 유화활성은 하기 표 2에 나타내었다. 시험 결과, 발효 올리브 오일은 pH 5.0부터 유화활성이 급격히 증가하였으며, 특히 pH 9.0에서는 pH 5.0에 비해 50% 이상 유화활성이 높음을 확인하였다. 반면에 올리브 오일은 pH 9.0에서 유화활성이 증가하였으나, pH 9.0에서 발효 올리브 오일의 pH 5.0에도 미치지 못하는 유화활성을 보였다. 발효 올리브 오일과 올리브 오일의 유화활성을 비교한 결과, 발효 올리브 오일은 pH 2.0부터 유화활성을 나타내었으며, pH 9.0에서는 발효 올리브 오일이 올리브 오일에 비해 유화활성이 2.5배 이상 높음을 확인할 수 있었다.

올리브 오일과 발효 올리브 오일의 pH에 대한 유화활성

Buffer pH	올리브 오일	발효 올리브 오일
2.0	0.400	0.820
3.0	0.428	0.972
5.0	0.520	2.633
7.0	0.514	2.800
9.0	1.602	4.215

유화안정도에 대한 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1a는 올리브 오일의 유화활성, 도 1c는 발효 올리브 오일의 유화활성을 측정한 결과이다. 또한 각각의 시편에 대하여 1시간 후, 24시간 후의 모습을 촬영하여 유화안정도를 평가하였는바, 도 1b는 올리브 오일, 도 1d는 발효 올리브 오일에 대한 촬영 사진이다.

올리브 오일은 24시간 경과 후에는 유화활성이 거의 나타나지 않은 반면, 발효 올리브 오일이 24시간 경과 후에도 올리브 오일에 비해 4배 이상의 유화활성을 나타냄으로써 우수한 유화안정도를 보였다.

발효 전, 후 오일 종류에 따른 유화활성은 하기 표 4에 나타내었다.

Buffer pH 7.0	발효 전(O.D)	발효 후(O.D)
콩 오일	0.514	2.746
올리브 오일	0.517	2.800
녹차 오일	0.680	2.729
아르간 오일	1.026	2.481

도 1e는 발효오일간의 유화활성을 측정한 결과이며, 도 1f 내지 도 1m은 유화활성에 대한 촬영 사진이다.

시험 결과, 발효 후 오일이 발효 전에 비해 최소 2배 이상 높은 유화활성을 나타내어 유화력이 좋아짐을 확인하였다.

2. 사용감

피부 느낌 (보습감, 끈적임, 번들거림 등) 등의 각 평가 항목별로 전문 피검자를 10명씩 준비하여 올리브오일과 발효오일의 사용감을 평가하였다. 평가는 하기 표 5의 기준 점수에 의하여 수행하였으며, 각 항목의 피검자의 점수를 합계하여 하기 표 6에 나타내었다.

구분	기본점수
아주 우수	5
우수	4
보통	3
나쁨	2
아주 나쁨	1

구분	올리브오일	발효올리브오일
보습감	20	36
끈적임	22	41
번들거림	12	32

평가 결과, 발효 올리브 오일이 올리브 오일에 비하여 보습감이 좋고, 번들거림이 적으면서 끈적임이 없었다. 따라서, 본 발명의 발효 오일이 보습감, 끈적임, 번들거림 등의 피부 사용감이 우수함을 알 수 있었다.

3. 가스 크로마토그래피(GC)에 의한 지방산 조성의 분석

발효 과정에 의한 올리브 오일의 지방산 조성의 변화를 확인하기 위해 기체 크로마토그래피(gas chromatograph ; GC)로 지방산을 분석하였다.

지방산 메틸 에스테르는 탈아실화된 후 헥산(hexane)에 용해되는 지방산을 보론트리프루오라이드메탄올 혼합물로 만들어 준비하였고, GC 분석기(JMS-SX 102A, JEOL, Tokyo, Japan)로 분석하였다.

오븐의 온도는 70~120℃ 구간은 분당 10℃로 상승시켰고, 120~250℃ 구간은 분당 5℃로 올려주었다. 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2a는 지방산 분포도, 도 2b는 올리브 오일의 지방산 분석결과, 도 2c는 발효 올리브 오일의 지방산 분석결과, 도 2c는 녹차 오일의 지방산 분석결과, 도 2d는 발효 녹차 오일을 나타낸 것이다.

올리브 오일과 발효 올리브 오일의 지방산 조성을 비교한 결과, 올리브 오일보다 발효 올리브 오일에서 리놀레산 같은 필수 지방산의 함량이 높아졌음을 확인할 수 있었다. 또한 녹차 오일과 발효 녹차 오일의 지방산 조성을 비교한 결과, 녹차 오일보다 발효 녹차 오일에서 리놀레산 같은 필수 지방산의 함량이 높아졌음을 확인할 수 있었다.

이상의 결과에서 발효 오일은 필수 지방산의 함량이 높아짐으로서 피부의 포수력과 흡수력이 향상되어 보습감 개선에 효과적임을 확인할 수 있었다.

4. 유리지방산 측정

산가는 지방산이 글리세라이드로서 결합형태로 있지 않은 유리지방산의 양을 측정하는 것이다. 1차 유리지방산 변화 유무를 확인하기 위한 산가의 측정은 메트롬 티트라토를 이용하였다. 적정액(KOH 0.05mol/L)의 예상 소비량이 1~10ml사이에 오도록 하여 해당 양만큼의 시료를 투입하였다. 시료의 성상을 균질하게 하여 보조용액(메탄올 : 증류수 = 3 : 1)을 50ml 투입하였다. 기기의 MET 모드를 선택하고, 측정 값 중 U(전압)을 선택, MET U 모드를 로딩시키고, 전극과 뷰렛 팁을 비커 안에 자리하게 한 후 실험을 시작하였다. 당량점이 인지되면 실험을 종료하였다. 시료만을 투입하지 않은 상태에서 동일한 방법으로 실험을 실시하여 공시험 값으로 정해주었다. 2차로 각각의 오일의 유리지방산 함량 비교를 위한 산가의 측정은 식품공전의 산가시험법을 이용하였다. 오일 5~10 g을 정밀히 달아 마개달린 삼각플라스크에 넣고 중성의 에탄올-에테르혼액(1：2) 100 mL를 넣어 녹인 후. 이를 페놀프탈레인시액을 지시약으로 하여 엷은 홍색이 30초간 지속할 때까지 0.1 N 에탄올성수산화칼륨용액으로 적정하였다.

산가 = 5.611×a×f /S

S：검체의 채취량(g)

a：0.1 N 에탄올성 수산화칼륨용액의 소비량(mL)

f：0.1 N 에탄올성 수산화칼륨용액의 역가

1차로 올리브 오일의 발효 과정에서 유리지방산 변화 유무를 확인하기 위해 산가를 측정하였고 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3a는 올리브 오일의 산가, 도 3b는 발효 올리브 오일의 산가 결과이다.

올리브 오일과 발효 올리브 오일의 산가를 측정한 결과, 올리브 오일은 0.1294 mgKOH/g, 발효올리브오일은 8.1022 mgKOH/g로 발효 올리브 오일이 올리브오일에 비해 유리지방산이 50배 이상 증가하였음을 확인하였다

2차로 각각의 오일의 유리지방산 함량 비교를 위해 산가를 측정하였고, 결과는 표 7에 나타내었다.

	발효 전(mg KOH/g)	발효 후(mg KOH/g)
콩 오일	0.57	33.51
올리브 오일	0.35	39.54
녹차 오일	0.45	35.59
아르간 오일	0.36	51.40

시험 결과, 모든 오일은 발효 전에 비해 약 50 ~ 140배 이상 유리지방산 함량이 증가하였다.

이상의 결과에서 일반오일이 오일발효에 최적화된 배지에서 발효공정을 통해 유리지방산의 함량이 높아짐으로서 끈적임이 감소하여 사용감이 향상되고, 사용 후 번들거림 개선에 효과적일 것임을 확인하였다.

5. 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast Neonatal)의 증식에 미치는 효과 검증시험

배양된 인간 섬유아세포에 올리브 오일과 발효 올리브 오일을 농도별로 처리한 후 세포 생존율을 비교하여 발효공정이 세포의 증식 및 독성에 미치는 영향을 검증하였다.

MTT물질이 세포내로 흡수되어 미토콘드리아내에서 숙신산탈수소효소에 의해 포르마잔을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하므로 세포의 증식 및 독성평가를 할 수 있다.

96웰 플레이트에 배양된 세포에 0.5% ~ 0.0019% 농도의 올리브 오일과 발효 올리브 오일을 처리하고 48시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. MTT 솔루션에 3-4시간 반응시킨 후 ELISA 측정기로 540nm에서 O.D값을 측정하였다. 세포생존율 산출식은 다음과 같다.

세포 생존율 (%) = (시료첨가군의 O.D at 540nm)/시료 무첨가군의 O.D at 540nm)×100

DMSO 처리군을 대조군으로 하고 발효 전 콩, 올리브, 녹차, 아르간 오일과 발효 후 콩, 올리브, 녹차, 아르간 오일을 첨가하여 실시한 시험 결과를 도 4에 나타내었다.

시험 결과, 발효 후 오일 처리군과 발효 전 오일의 처리군의 세포 생존율을 비교하였을 때 발효 후 오일 처리군이 생존율이 더 높게 나타났다. 이상의 결과에서 오일이 발효과정을 거치더라도 세포의 증식 및 독성에 미치는 영향이 없음을 확인하였다.

6. TLC (Thin layer chromatography) 분석

올리브 오일과 발효 올리브 오일을 TLC (Thin layer chromatography)를 이용하여 오일 안에 존재하는 성분들을 분석하고, 각각의 성분들의 존재 유무 및 변화된 정도를 육안으로 확인한다.

샘플로 사용될 올리브 오일, 발효 올리브 오일을 일정한 농도 (1/10, 1/5)로 희석하여 준비한다. Silica TLC에 샘플을 2-3 방울 떨어뜨린 후, 분리능이 좋은 solvent 조건을 사용하여 샘플을 분석하고 최적의 solvent 조건을 잡는다. 샘플을 떨어뜨린 TLC에 분리능이 좋은 solvent를 전개용매로 사용하여 chamber에서 전개시킨다. 전개가 끝난 TLC는 꺼내어 잘 말린다. TLC를 10%황산에 3-4초간 담그고, 다시 꺼내어 잘 말린다. 잘 마른 TLC를 드라이기 또는 hot plate에서 발색이 될때까지 열을 가해준다.

TLC를 이용하여 올리브 오일과 발효 올리브 오일의 좋은 분리능을 보이는 n-hexane : Ethyl acetate = 5 : 1, Chloroform : Methanol = 15 : 1 조건을 확립 하였다. 1차 용매 조건으로 n-hexane : Ethyl acetate = 5 : 1 을 이용하여 전개 하였고, 2차 용매로는 Chloroform : Methanol = 15 : 1 의 조건을 이용하여 전개하는 2D-TLC를 실시하였고 그 결과를 도 5a에 나타내었다.

분석 결과 올리브 오일과는 다르게 발효 올리브 오일에서 특정 spot이 두드러지게 진해지는 것과 새로운 spot이 생기는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 발효 올리브 오일의 특정 spot을 linoleic acid, linolenic acid의 2D-TLC와 비교한 결과 linoleic acid, linolenic acid와 같은 부분의 spot이 점점 진해진 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과에서 발효 올리브 오일은 올리브 오일과는 다르게 매우 비극성인 오일의 양이 줄어들고, linoleic acid와 linolenic acid의 양이 시간이 지남에 따라 늘어나는 것을 확인하였다.

콩 오일, 녹차 오일과 아르간 오일의 발효 전, 후 2D-TLC를 실시하였고 그 결과를 도 5b에 나타내었다.

분석 결과, 콩오일, 녹차 오일, 아르간 오일 역시 발효 후 오일에서 발효 전과는 다르게 매우 비극성인 오일의 양이 줄어들고, linoleic acid와 linolenic acid의 양이 시간이 지남에 따라 늘어나는 것을 확인하였다

7. 제제예

(1) 제제예 1: 외용 크림제

하기 표 8의 조성으로 외용 크림제를 제제화하였다. 우선 정제수에 보습제를 가하고 70℃로 가열, 조정하여 수상을 제조하였다. 발효올리브오일 및 나머지 유성분들을 가열 용해 후, 유화제, 방부제 등을 가하고 70℃로 조정하였다. 이것을 상기한 수상에 가하고 호모믹서로 유화 입자를 균일화한 다음, 탈기포, 여과, 냉각시켰다.

중분류	소분류	함량(%)
유성분	세로스테아릴알코올	6.0
	스테아린산	2.0
	발효올리브오일	15.0
	스쿠알란	1.0
	옥틸도데카놀	3.0
유화제	POE(25)세틸알코올에테르	3.0
유화제	모노스테아린산글리세린	2.0
보습제	1,3-부틸렌글리콜	3.0
보습제	글리세린	2.0
방부제	1,2-헥실렌글리콜	2.0
정제수	-	61.0

(2) 제제예 2: 외용 로션제

하기 표 9의 조성으로 외용 로션제를 제제화하였다. 우선 정제수에 보습제를 가하고 70℃로 가열, 조정하여 수상을 제조하였다. 발효올리브오일 및 나머지 유성분들을 가열 용해 후, 유화제, 방부제 등을 가하고 70℃로 조정하였다. 이것을 상기한 수상에 가하고 호모믹서로 유화시킨 다음, 히알루론산 1 수용액을 첨가하여 호모믹서로 균질하게 혼합한 후, 탈기포, 여과, 냉각시켰다.

중분류	소분류	함량(%)
유성분	세로스테아릴알코올	1.0
	발효올리브오일	8.0
	스쿠알란	1.0
	디메틸롤리실록산	2.0
유화제	POE(25)세틸알코올에테르	1.0
유화제	글리세롤 모노스테아린산 에스테르	1.0
보습제	1,3-부틸렌글리콜	4.0
보습제	글리세린	4.0
방부제	1,2-헥실렌글리콜	2.0
정제수	-	76.0

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국생명공학연구원

KCTC08950P

20110831

Claims

(a) 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P) 미생물을 호기 조건에서 배양액에 30 내지 60시간동안 1차 배양하는 단계;
(b) 상기 배양액에 산가가 0.1 내지 2.0인 식물성 오일을 첨가하고, 72 내지 120시간동안 2차 배양하는 단계; 및
(c) 2차 배양을 마친 식물성 오일을 회수하는 단계를 포함하는 발효 식물성 오일의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 식물성 오일을 배양액 100중량부 대비 100중량부 이하로 투입하는 것을 특징으로 하는 발효 식물성 오일의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 따라 제조된, 발효 식물성 오일.
제3항에 있어서,
상기 발효 식물성 오일은 발효 전보다 필수 지방산 함량이 높은 것을 특징으로 하는 발효 식물성 오일.
제4항에 있어서,
상기 발효 식물성 오일은 발효 전보다 필수 지방산의 함량이 5 내지 140배 높은 것을 특징으로 하는 발효 식물성 오일.
제3항에 있어서,
상기 발효 식물성 오일은 발효 전보다 유리 지방산 함량이 높은 것을 특징으로 하는 발효 식물성 오일.
제6항에 있어서,
상기 발효 식물성 오일은 발효 전보다 유리 지방산 함량이 5 내지 140배 높은 것을 특징으로 하는 발효 식물성 오일.
제3항의 발효 식물성 오일을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
상기 발효 식물성 오일의 함량은 2 내지 40 중량%인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제