JP4081794B2 - 新規なラビリンチュラ科微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法 - Google Patents
新規なラビリンチュラ科微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4081794B2 JP4081794B2 JP2002253546A JP2002253546A JP4081794B2 JP 4081794 B2 JP4081794 B2 JP 4081794B2 JP 2002253546 A JP2002253546 A JP 2002253546A JP 2002253546 A JP2002253546 A JP 2002253546A JP 4081794 B2 JP4081794 B2 JP 4081794B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- docosapentaenoic acid
- acid
- producing
- labyrinthula
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- AVKOENOBFIYBSA-GUTOPQIJSA-N 4,7,10,13,16-Docosapentaenoic acid Chemical compound CCCCC\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\CCC(O)=O AVKOENOBFIYBSA-GUTOPQIJSA-N 0.000 title claims description 39
- AVKOENOBFIYBSA-UHFFFAOYSA-N 4,7,10,13,16-Docosapentaenoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCC(O)=O AVKOENOBFIYBSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 39
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 21
- 241001491670 Labyrinthula Species 0.000 title claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 11
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 11
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 11
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 11
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 claims description 8
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 claims description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 10
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 4
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N (7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCC(O)=O YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N 0.000 description 2
- 235000021294 Docosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 2
- YIYBQIKDCADOSF-UHFFFAOYSA-N pent-2-enoic acid Chemical compound CCC=CC(O)=O YIYBQIKDCADOSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FPRKGXIOSIUDSE-SYACGTDESA-N (2z,4z,6z,8z)-docosa-2,4,6,8-tetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C/C=C\C=C/C=C\C(O)=O FPRKGXIOSIUDSE-SYACGTDESA-N 0.000 description 1
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 235000021292 Docosatetraenoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001125046 Sardina pilchardus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する新規な微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸（通称ｎ‐６ＤＰＡ）は、高度不飽和脂肪酸の１種であって、近年、血液脳関門通過能が高いことから、血液脳関門通過性医薬組成物の成分として注目されている（特開昭６１−２０４１３６号公報）。また、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸は、ｎ‐３系必須脂肪酸欠乏時に、代替物質として増加することも報告されており、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を大量に生産することは、工業的に非常に大きな意義を有する。
【０００３】
その４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸は、イワシ油などの魚油にはほとんど含まれていないので、それを製造するには微生物の利用が考えられる。そして、これまで、ラビリンチュラ属に属する微生物が、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸とともに、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を構成脂肪酸とするトリグリセリドやリン脂質として生産することが知られている。
【０００４】
したがって、この微生物を培養し、その菌体から常法に従い、非水溶性有機溶媒で抽出処理し、抽出液から有機溶剤を蒸発除去することにより、高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を回収し、次いでこの高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を加水分解したのち、その分解生成物から４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を分離すれば、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を製造することができる。
【０００５】
しかしながら、上記の多数の高度不飽和脂肪酸を含む脂質の加水分解生成物中の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の含有割合が低く、さらにそれを分離するには、クロマトグラフィー処理を含む分離操作を必要とするため、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を大量に製造する方法としては不適当であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する微生物を用いて、その培養物に含まれる他の高度不飽和脂肪酸からの分離、精製を必要としない程度に純粋な４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸及びそれを含むトリグリセリドやリン脂質を大量に製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高度不飽和脂肪酸を生産する微生物について鋭意研究を重ねた結果、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する微生物中に、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する菌株が存在すること、そして、この菌株を用いれば、脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸となるトリグリセリドやリン脂質を製造しうること、及び４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を９０質量％以上の割合で含む高度不飽和脂肪酸混合物を選択的に製造しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８７）、及びこの微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することを特徴とする４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法を提供するものである。
本発明でいう高度不飽和脂肪酸とは、炭素数２０以上で３個以上の不飽和結合を有する脂肪酸を意味する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物、すなわちラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株は、北海道オホーツク海沿岸で採取された落葉から分離され、それらを培養した場合、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸が全高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上を占めることで特徴づけられるものである。この菌株は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８７として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１０】
本発明の微生物を得るには、例えば北海道オホーツク海沿岸で採取した落葉樹の落葉を海水中に数日間放置したのち、落葉の表面に付着した微生物を集めることによって先ず原体を採取する。
【００１１】
次に採取した原体を、炭素源としてグルコースを含む合成培地中で培養する。このようにして得た菌株Ｌ５９株についての光学顕微鏡写真を図１に示す。次いで、培養後、培養培地から菌体を分離し、乳鉢で破砕し、この破砕物をクロロホルムで抽出し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成の分析をした。このようにして得た脂肪酸組成パターンを図２に示す。
【００１２】
このようにして得られる本発明の微生物は、高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸やドコサヘキサエン酸を含まず、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を高い割合で菌体内に保有するが、これまで知られているラビリンチュラ属に属する微生物では、このような能力を示すものは存在しない。
【００１３】
本発明の微生物は、図１から分るように、ラビリンチュラ属の特徴である紡錘形状を有し、海中に広く存在する海生菌の１種である。そして、以下に示す菌学的性質から、容易に公知の微生物と区別される。
Ｉ．形態学的性質
（１）細胞の大きさは、約１０μｍで紡錘形である。
（２）ネットワークを形成し、その中で滑走運動している。
ＩＩ．培養的性質
（１）糖質寒天培地では培地表面のみに拡がる。
（２）糖質液体培養では、ほとんど生育しない。
（３）有機又は無機の窒素源を利用して増殖する。
（４）至適ｐＨは５〜９、至適温度は１８〜２５℃である。
（５）大豆レシチンの存在下で４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を多量に生産する。
【００１４】
次に、本発明の微生物を培養して４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を得るには、炭素源として糖類、窒素源として有機含窒素物質及び無機塩をそれぞれ０．１〜１０ｇ／リットルの濃度で含有する海水が基本培地として用いられる。
【００１５】
上記の糖類としては、例えばグルコース、ショ糖、フルクトース、水あめなどが、有機含窒素物質としては、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。また、無機塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＮＯ3、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などが用いられるが、もともと海水中に存在する成分については特に添加する必要はない。
培養温度としては、１５〜３０℃、好ましくは１８〜２５℃、培地ｐＨとしては５〜９、好ましくは６〜８が用いられる。
【００１６】
このようにして２時間ないし２０日間培養した培養物中の菌体には、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸がトリグリセリドとして多量に蓄積される。この際、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の一部はリン脂質としても蓄積される。
【００１７】
したがって、培養物から菌体を分離し、分離した菌体を有機溶剤、例えばクロロホルムで抽出すると、高度不飽和脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を高い割合で含む脂質を得ることができる。そして、この脂質は、シリカカラムクロマトグラフィーにより、トリグリセリド及びリン脂質に分離することができる。次に、このようにして得られた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のグリセリド及びリン脂質を常法により加水分解すると、所望の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸が得られる。
【００１８】
本発明の微生物を培養するに際して、培地中に大豆レシチンを添加すれば、その培養効率を著しく向上させることができるので有利である。この添加濃度としては、２．０〜４．５ｇ／リットル、好ましくは２．５〜４．０ｇ／リットルの範囲内で選ぶのがよい。
【００１９】
また、培養物を加水分解したのち、尿素付加法を用いて濃縮すれば、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸以外の脂肪酸を効率よく除去しうるので、容易に高純度の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を得ることができる。
【００２０】
この尿素付加法は以下のようにして行われる。
すなわち、菌体を有機溶剤で抽出し、加水分解後、得られた脂肪酸混合物５０ｇをメチルアルコール１リットルに溶解し、メチルアルコール１リットル当り、尿素２００ｇを加えて溶解したのち、低温で静置し、析出してくる尿素を濾去する。このようにして得た濾液には飽和脂肪酸は含まれておらず、９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸である。
【００２１】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
人工海水にポリペプトン１ｇ／リットル、酵母エキス０．５ｇ／リットル、寒天１０ｇ／リットル、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）１．２５ｇ／リットルを加えたのち、１００℃に加熱し滅菌することにより基本培地を調製した。この基本培地に、炭素源として大豆油、大豆レシチン、リノール酸又はリノレン酸を３０ｇ／リットル添加したのち、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、２５℃において１４日間培養した。
次いで、培養物の一部を採取し、ガスクロマトグラフィーにより、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の定量分析を行い、寒天１ｇ当りの生成量（ｍｇ）すなわちｍｇ／ｇ−ａｇａｒを求めた。その結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
この表から分るように、大豆油又は大豆レシチンを添加した場合、特に大豆レシチンを添加した場合にドコサペンタエン酸の収量が向上する。
【００２５】
実施例２
実施例１の基本培地に、２０、２５、３０、４０又は４５ｇ／リットルの割合で大豆レシチンを添加した培地を調製し、これに、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、実施例１と同様にして２５℃において１４日間培養し、得られた培養物について実施例１と同様にして４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のガスクロマトグラフィー分析を行った。その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
この表から分るように、大豆レシチン添加量２．５〜４．０質量％において、ドコサペンタエン酸が高い収率で得られる。
【００２８】
実施例３
実施例１の基本培地に大豆レシチン４０ｇ／リットルを添加し、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、１０〜３０℃の範囲内で温度を変えて１４日間培養した。得られた培養物について、実施例１と同様にしてガスクロマトグラフィー分析を行った結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
【００３０】
この表から分るように、培養温度としては１８〜２５℃の範囲、特に２０℃付近が最適である。
【００３１】
実施例４
実施例３の培養温度２０℃で得た培養物を加水分解したのち、１０％塩酸−メチルアルコール溶液を加えて反応させ、脂肪酸をすべてメチルエステルに変換し、それを尿素付加法を用いて精製した。このものについてガスクロマトグラフィー分析を行った結果をチャートとして図３に示す。
また、同じものについて、ガスクロマトグラフィー質量分析計で分離、分析した場合のピーク成分のチャートを図４に示す。
これらの結果は、ラビリンチュラＬ５９株が高度不飽和脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のみを含み、それは尿素付加法により容易にその他の脂肪酸から分離できることを示す。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によると、生理活性物質として期待される４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を選択的にかつ９０質量％以上の高収率で得ることができ、さらに脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸であるトリグリセリド及びリン脂質が得られ、その結果、これまで実現できなかった食品、家畜飼料、医薬品の添加剤を工業的規模で製造しうるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明微生物Ｌ５９株の光学顕微鏡写真。
【図２】 本発明微生物の菌株中に蓄積された脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる組成パターン。
【図３】 実施例４で得た生成物のガスクロマトグラフィー分析のチャート。
【図４】 実施例４で得た生成物のガスクロマトグラフィー質量分析計で測定したピーク成分の分析チャート。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する新規な微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸（通称ｎ‐６ＤＰＡ）は、高度不飽和脂肪酸の１種であって、近年、血液脳関門通過能が高いことから、血液脳関門通過性医薬組成物の成分として注目されている（特開昭６１−２０４１３６号公報）。また、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸は、ｎ‐３系必須脂肪酸欠乏時に、代替物質として増加することも報告されており、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を大量に生産することは、工業的に非常に大きな意義を有する。
【０００３】
その４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸は、イワシ油などの魚油にはほとんど含まれていないので、それを製造するには微生物の利用が考えられる。そして、これまで、ラビリンチュラ属に属する微生物が、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸とともに、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を構成脂肪酸とするトリグリセリドやリン脂質として生産することが知られている。
【０００４】
したがって、この微生物を培養し、その菌体から常法に従い、非水溶性有機溶媒で抽出処理し、抽出液から有機溶剤を蒸発除去することにより、高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を回収し、次いでこの高度不飽和脂肪酸を含む脂質成分を加水分解したのち、その分解生成物から４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を分離すれば、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を製造することができる。
【０００５】
しかしながら、上記の多数の高度不飽和脂肪酸を含む脂質の加水分解生成物中の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の含有割合が低く、さらにそれを分離するには、クロマトグラフィー処理を含む分離操作を必要とするため、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を大量に製造する方法としては不適当であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する微生物を用いて、その培養物に含まれる他の高度不飽和脂肪酸からの分離、精製を必要としない程度に純粋な４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸及びそれを含むトリグリセリドやリン脂質を大量に製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高度不飽和脂肪酸を生産する微生物について鋭意研究を重ねた結果、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する微生物中に、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を優勢的に生産する菌株が存在すること、そして、この菌株を用いれば、脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸となるトリグリセリドやリン脂質を製造しうること、及び４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を９０質量％以上の割合で含む高度不飽和脂肪酸混合物を選択的に製造しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８７）、及びこの微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することを特徴とする４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法を提供するものである。
本発明でいう高度不飽和脂肪酸とは、炭素数２０以上で３個以上の不飽和結合を有する脂肪酸を意味する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物、すなわちラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株は、北海道オホーツク海沿岸で採取された落葉から分離され、それらを培養した場合、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸が全高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上を占めることで特徴づけられるものである。この菌株は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８７として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１０】
本発明の微生物を得るには、例えば北海道オホーツク海沿岸で採取した落葉樹の落葉を海水中に数日間放置したのち、落葉の表面に付着した微生物を集めることによって先ず原体を採取する。
【００１１】
次に採取した原体を、炭素源としてグルコースを含む合成培地中で培養する。このようにして得た菌株Ｌ５９株についての光学顕微鏡写真を図１に示す。次いで、培養後、培養培地から菌体を分離し、乳鉢で破砕し、この破砕物をクロロホルムで抽出し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成の分析をした。このようにして得た脂肪酸組成パターンを図２に示す。
【００１２】
このようにして得られる本発明の微生物は、高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸やドコサヘキサエン酸を含まず、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を高い割合で菌体内に保有するが、これまで知られているラビリンチュラ属に属する微生物では、このような能力を示すものは存在しない。
【００１３】
本発明の微生物は、図１から分るように、ラビリンチュラ属の特徴である紡錘形状を有し、海中に広く存在する海生菌の１種である。そして、以下に示す菌学的性質から、容易に公知の微生物と区別される。
Ｉ．形態学的性質
（１）細胞の大きさは、約１０μｍで紡錘形である。
（２）ネットワークを形成し、その中で滑走運動している。
ＩＩ．培養的性質
（１）糖質寒天培地では培地表面のみに拡がる。
（２）糖質液体培養では、ほとんど生育しない。
（３）有機又は無機の窒素源を利用して増殖する。
（４）至適ｐＨは５〜９、至適温度は１８〜２５℃である。
（５）大豆レシチンの存在下で４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を多量に生産する。
【００１４】
次に、本発明の微生物を培養して４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を得るには、炭素源として糖類、窒素源として有機含窒素物質及び無機塩をそれぞれ０．１〜１０ｇ／リットルの濃度で含有する海水が基本培地として用いられる。
【００１５】
上記の糖類としては、例えばグルコース、ショ糖、フルクトース、水あめなどが、有機含窒素物質としては、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。また、無機塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＮＯ3、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、（ＮＨ4）2ＳＯ4などが用いられるが、もともと海水中に存在する成分については特に添加する必要はない。
培養温度としては、１５〜３０℃、好ましくは１８〜２５℃、培地ｐＨとしては５〜９、好ましくは６〜８が用いられる。
【００１６】
このようにして２時間ないし２０日間培養した培養物中の菌体には、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸がトリグリセリドとして多量に蓄積される。この際、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の一部はリン脂質としても蓄積される。
【００１７】
したがって、培養物から菌体を分離し、分離した菌体を有機溶剤、例えばクロロホルムで抽出すると、高度不飽和脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を高い割合で含む脂質を得ることができる。そして、この脂質は、シリカカラムクロマトグラフィーにより、トリグリセリド及びリン脂質に分離することができる。次に、このようにして得られた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のグリセリド及びリン脂質を常法により加水分解すると、所望の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸が得られる。
【００１８】
本発明の微生物を培養するに際して、培地中に大豆レシチンを添加すれば、その培養効率を著しく向上させることができるので有利である。この添加濃度としては、２．０〜４．５ｇ／リットル、好ましくは２．５〜４．０ｇ／リットルの範囲内で選ぶのがよい。
【００１９】
また、培養物を加水分解したのち、尿素付加法を用いて濃縮すれば、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸以外の脂肪酸を効率よく除去しうるので、容易に高純度の４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を得ることができる。
【００２０】
この尿素付加法は以下のようにして行われる。
すなわち、菌体を有機溶剤で抽出し、加水分解後、得られた脂肪酸混合物５０ｇをメチルアルコール１リットルに溶解し、メチルアルコール１リットル当り、尿素２００ｇを加えて溶解したのち、低温で静置し、析出してくる尿素を濾去する。このようにして得た濾液には飽和脂肪酸は含まれておらず、９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸である。
【００２１】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
人工海水にポリペプトン１ｇ／リットル、酵母エキス０．５ｇ／リットル、寒天１０ｇ／リットル、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）１．２５ｇ／リットルを加えたのち、１００℃に加熱し滅菌することにより基本培地を調製した。この基本培地に、炭素源として大豆油、大豆レシチン、リノール酸又はリノレン酸を３０ｇ／リットル添加したのち、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、２５℃において１４日間培養した。
次いで、培養物の一部を採取し、ガスクロマトグラフィーにより、４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の定量分析を行い、寒天１ｇ当りの生成量（ｍｇ）すなわちｍｇ／ｇ−ａｇａｒを求めた。その結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
この表から分るように、大豆油又は大豆レシチンを添加した場合、特に大豆レシチンを添加した場合にドコサペンタエン酸の収量が向上する。
【００２５】
実施例２
実施例１の基本培地に、２０、２５、３０、４０又は４５ｇ／リットルの割合で大豆レシチンを添加した培地を調製し、これに、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、実施例１と同様にして２５℃において１４日間培養し、得られた培養物について実施例１と同様にして４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のガスクロマトグラフィー分析を行った。その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
この表から分るように、大豆レシチン添加量２．５〜４．０質量％において、ドコサペンタエン酸が高い収率で得られる。
【００２８】
実施例３
実施例１の基本培地に大豆レシチン４０ｇ／リットルを添加し、ラビリンチュラＬ５９株を植菌し、１０〜３０℃の範囲内で温度を変えて１４日間培養した。得られた培養物について、実施例１と同様にしてガスクロマトグラフィー分析を行った結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
この表から分るように、培養温度としては１８〜２５℃の範囲、特に２０℃付近が最適である。
【００３１】
実施例４
実施例３の培養温度２０℃で得た培養物を加水分解したのち、１０％塩酸−メチルアルコール溶液を加えて反応させ、脂肪酸をすべてメチルエステルに変換し、それを尿素付加法を用いて精製した。このものについてガスクロマトグラフィー分析を行った結果をチャートとして図３に示す。
また、同じものについて、ガスクロマトグラフィー質量分析計で分離、分析した場合のピーク成分のチャートを図４に示す。
これらの結果は、ラビリンチュラＬ５９株が高度不飽和脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸のみを含み、それは尿素付加法により容易にその他の脂肪酸から分離できることを示す。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によると、生理活性物質として期待される４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を選択的にかつ９０質量％以上の高収率で得ることができ、さらに脂質の構成成分である高度不飽和脂肪酸の９０質量％以上が４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸であるトリグリセリド及びリン脂質が得られ、その結果、これまで実現できなかった食品、家畜飼料、医薬品の添加剤を工業的規模で製造しうるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明微生物Ｌ５９株の光学顕微鏡写真。
【図２】 本発明微生物の菌株中に蓄積された脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる組成パターン。
【図３】 実施例４で得た生成物のガスクロマトグラフィー分析のチャート。
【図４】 実施例４で得た生成物のガスクロマトグラフィー質量分析計で測定したピーク成分の分析チャート。
Claims (3)
- ラビリンチュラ科ラビリンチュラ属に属する４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸生産菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８７）。
- 請求項１記載の微生物を培養し、菌体中に構成脂肪酸として４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸を含む脂質を蓄積させたのち、菌体を分離し、分離した菌体から溶媒により前記脂質を抽出したのち、その抽出物を加水分解することを特徴とする４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法。
- 炭素源として大豆レシチンを含む培地中で培養する請求項２記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002253546A JP4081794B2 (ja) | 2002-08-30 | 2002-08-30 | 新規なラビリンチュラ科微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002253546A JP4081794B2 (ja) | 2002-08-30 | 2002-08-30 | 新規なラビリンチュラ科微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004089048A JP2004089048A (ja) | 2004-03-25 |
| JP4081794B2 true JP4081794B2 (ja) | 2008-04-30 |
Family
ID=32059515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002253546A Expired - Fee Related JP4081794B2 (ja) | 2002-08-30 | 2002-08-30 | 新規なラビリンチュラ科微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4081794B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9390655B2 (en) | 2014-07-10 | 2016-07-12 | Samsung Display Co., Ltd. | Organic light emitting diode display, driving method thereof, and manufacturing method thereof |
| US10214756B2 (en) | 2013-08-23 | 2019-02-26 | National University Corporation Kobe University | Method for generating oil/fat component from chlamydomonas algae |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG10201912645TA (en) * | 2015-08-31 | 2020-02-27 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | Free-polyunsaturated-fatty-acid-containing composition and method for manufacturing same |
-
2002
- 2002-08-30 JP JP2002253546A patent/JP4081794B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10214756B2 (en) | 2013-08-23 | 2019-02-26 | National University Corporation Kobe University | Method for generating oil/fat component from chlamydomonas algae |
| US10351882B2 (en) | 2013-08-23 | 2019-07-16 | National University Corporation Kobe University | Method for producing an oil or fat component and method for producing higher unsaturated fatty acid using algae |
| US9390655B2 (en) | 2014-07-10 | 2016-07-12 | Samsung Display Co., Ltd. | Organic light emitting diode display, driving method thereof, and manufacturing method thereof |
| US9978313B2 (en) | 2014-07-10 | 2018-05-22 | Samsung Display Co., Ltd. | Organic light emitting diode display, driving method thereof, and manufacturing method thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004089048A (ja) | 2004-03-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1321767C (en) | Process for production of eicosapentaenoic acid | |
| JP3425622B2 (ja) | ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法 | |
| JP3354582B2 (ja) | オメガ９系高度不飽和脂肪酸およびこれを含有する脂質の製造方法 | |
| AU2008338017B2 (en) | Method for the cultivation of microorganisms of the order thraustochytriales | |
| US20130096332A1 (en) | Method for increasing the content of docosahexaenoic acid in fat-containing materials or in fats and oils | |
| KR20200074047A (ko) | Epa, dha 및 아라키돈산 고함량 기능성 유지 생산 방법 | |
| EP1035211B1 (en) | PROCESS FOR PRODUCING ARACHIDONIC ACID-CONTAINING LIPID AND DIHOMO-gamma-LINOLENIC ACID-CONTAINING LIPID | |
| AU743992B2 (en) | Process for producing omega-9 highly unsaturated fatty acid and lipid containing the same | |
| JP4081794B2 (ja) | 新規なラビリンチュラ科微生物及びそれを用いた４，７，１０，１３，１６‐ドコサペンタエン酸の製造方法 | |
| JP3931219B2 (ja) | 高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法 | |
| JPH01228486A (ja) | 奇数鎖高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法 | |
| JP2566377B2 (ja) | ドコサヘキサエン酸高含有油脂の製造方法 | |
| JPS6337B2 (ja) | ||
| JP3723822B2 (ja) | 高度不飽和脂肪酸の製造方法 | |
| KR20080087820A (ko) | 도코사헥사엔산〔ｄｈａ〕을 생산하는 트라우스토키트리드균주－ｓｃ１ | |
| JP4045403B2 (ja) | ヒドロキシ脂肪酸およびγ−ラクトンの製造方法 | |
| JPH0965871A (ja) | 海洋性微細藻類の培養方法 | |
| JP4129831B2 (ja) | 液体培養による高度不飽和脂肪酸の製造方法及びそれに用いる新規な微生物 | |
| JPH06245759A (ja) | 油脂生産能力を有する微生物及び油脂の製造法 | |
| JP2000014392A (ja) | 高度不飽和脂肪酸含有グリセリドの製造方法 | |
| JPH0838188A (ja) | イノシトールの製造方法およびグルコース代謝拮抗物質耐性株の取得法 | |
| JPH07184668A (ja) | アスタキサンチンの製造法 | |
| JPH08163990A (ja) | 油脂含有藻体およびそれから得られる油脂の製造方法 | |
| JPH0591889A (ja) | 油脂の製造法及びそのための微生物 | |
| JPH0787959A (ja) | 海洋性微細藻類の培養方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050624 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071016 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071213 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080111 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080129 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080201 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110222 Year of fee payment: 3 |
|
| R154 | Certificate of patent or utility model (reissue) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R154 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130222 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130222 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees | ||
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |