JP3502903B2 - 高度不飽和脂肪酸及び高度不飽和リン脂質の製造方法 - Google Patents

高度不飽和脂肪酸及び高度不飽和リン脂質の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】水産廃棄物を培地成分として
利用したドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペン
タエン酸（ＥＰＡ）等の高度不飽和脂肪酸含有微生物及
び該高度不飽和脂肪酸を含むリン脂質含有微生物の製造
法並びにそれらの微生物から高度不飽和脂肪酸或いは該
高度不飽和脂肪酸を含むリン脂質を製造する方法に関す
る。そして、このような微生物或いは高度不飽和脂肪酸
類は、高度不飽和脂肪酸類としてＤＨＡ又はＥＰＡを含
み、食品、化粧品、水産製品、化成品などの分野におい
て有用である。
【０００２】
【従来の技術】水産廃棄物の量は年々増加傾向にあり、
その中でもホタテ、イカ、タコ等の不可食部は焼却や埋
め立てなどの処分が行われてきた。しかし、埋立て処分
では、悪臭や害虫の発生が起きるという問題があり、埋
立てる場所も減少している。一方、焼却処分では、水産
廃棄物の含水率が高いため多量の燃料が必要であり、建
設コスト、処理コストが高くなるという問題を含む。従
って、水産廃棄物に関しては、それらを有効利用する方
法の開発が急務となっている。
【０００３】一方、ω-３系列の高度不飽和脂肪酸であ
るＤＨＡやＥＰＡは海産生物に特有の脂肪酸であり、水
産廃棄物であるイカやホタテ等の不可食部にも大量に存
在している。そのため、水産廃棄物より高度不飽和脂肪
酸含有脂質を得ることも試みられており、ホタテ中腸腺
よりＥＰＡを抽出する試みは既に公知（特開平11-13721
9号公報、特開平11-116983号公報）であるが、これら組
織からの脂質の抽出は容易ではなく、多大な労力を必要
とし、水産廃棄物の未利用資源としての利用は充分とは
言えない。またこの方法によって得られる脂質の殆ど
は、魚油から得られる脂質と同じく、トリアシルグリセ
ロールである。
【０００４】また、これまでの魚油に代わって微生物に
よるＤＨＡやＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸の生産が試み
られている。これまでの微生物での高度不飽和脂肪酸の
生産は、高度不飽和脂肪酸を高度に蓄積する株の探索か
ら始まっていた。一方、高度不飽和脂肪酸を生産しない
乳酸菌を、ＤＨＡを含有する乳酸菌に変える方法（特開
平4-341180、特開平7-23774号公報）は既に公知であ
る。このような微生物培養法においては、菌の活性を維
持し、菌の増殖を促進させるために、無機塩類、ビタミ
ン類、タンパク質等の栄養源の補給が不可欠であるた
め、酵母エキスやペプトンなどが使用されている。しか
し、このように調製した培地は高価であるため、大規模
な培養に適した安価な培地の開発が急務とされている
が、水産廃棄物の培地への利用（特開平11-56345号公
報）が試みられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、水産
廃棄物を培地成分として利用した高度不飽和脂肪酸含有
微生物の製造方法、該高度不飽和脂肪酸を含むリン脂質
を含有する微生物の製造方法及びこれら微生物培養物か
ら高度不飽和脂肪酸或いは該高度不飽和脂肪酸を含むリ
ン脂質を製造する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的のために鋭意研究を行った結果、ＤＨＡやＥＰＡを高
濃度に蓄積しているイカゴロやホタテウロ等の魚介類の
内臓物より調整した栄養培地で培養した微生物の脂質に
ついて、１）高度不飽和脂肪酸含有の微生物菌体を洗浄
しても、その微生物菌体中の高度不飽和脂肪酸が除かれ
ないこと、２）１）の高度不飽和脂肪酸は、微生物菌体
内の脂質に結合していること、３）本発明で用いる水産
廃棄物より調整した培地で培養した微生物の増殖速度は
早く、多量の菌体が短時間に得られること、４）微生物
として細菌を用いることによって、ＤＨＡやＥＰＡを含
む高度不飽和リン脂質を含有する細菌が得られることを
見出し、本発明に至った。
【０００７】すなわち、本発明は微生物を水産廃棄物よ
り調製した培地中で培養することを特徴とするを高度不
飽和脂肪酸含有微生物の製造法である。さらに、本発明
は微生物を水産廃棄物より調製した培地中で培養し高度
不飽和脂肪酸を生産せしめ、培養物から高度不飽和脂肪
酸を採取することを特徴とするを高度不飽和脂肪酸の製
造法である。さらに、本発明はリン脂質生産能を有する
微生物を水産廃棄物より調製した培地中で培養すること
を特徴とするを高度不飽和脂肪酸を含むリン脂質含有微
生物の製造法である。さらに、本発明はリン脂質生産能
を有する微生物を水産廃棄物より調製した培地中で培養
し高度不飽和脂肪酸含有リン脂質を生産せしめ、培養物
から高度不飽和脂肪酸含有リン脂質を採取することを特
徴とするを高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造法であ
る。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
上記水産廃棄物としては、魚介類の内臓物が挙げられ、
具体的にはＤＨＡやＥＰＡを高濃度に含むイカやホタテ
の内臓物等が挙げられる。ここで高度不飽和脂肪酸と
は、不飽和度が２以上で炭素数１８以上の不飽和脂肪酸
をいう。高度不飽和脂肪酸の混合油脂、例えば、イワ
シ、サバ、アジ、マグロ由来の油脂、それも総脂肪酸中
の高度不飽和脂肪酸の占める割合が１０％以上の油脂
で、かつ、高度不飽和脂肪酸としてリノール酸、γ-リ
ノレイン酸、アラキドン酸、α-リノレイン酸、エイコ
サペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびこれらの塩
類、エステル類、トリアシルグリセロール、ジアシルグ
リセロール、モノアシルグリセロール、グリセロリン脂
質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ
糖脂質等多くの各種油脂を使って各種の高度不飽和脂肪
酸を乳酸菌に同時に蓄積させる方法、あるいは海洋性微
細藻類の藻体から得た自己消化物あるいは抽出物を含有
する培地で乳酸菌を培養する方法はすでに公知（特開平
4-341180号公報、特開平7-23774号公報）であるが、こ
れらの方法では、ペプトン、子牛脳抽出物、牛心臓抽出
物等の栄養培地に、高度不飽和脂肪酸供給源として各種
油脂を培地とは別途添加する方法を採っており、それら
油脂の調製に多大の労力を必要とし、更にペプトン、子
牛脳抽出物、牛心臓抽出物等を培地成分として用いるた
めの大量調製には、多大の経費を必要とするという問題
点がある。
【０００９】また、ＤＨＡやＥＰＡを高濃度に含む水産
廃棄物より直接脂質を抽出する試みもなされている。ホ
タテ中腸腺よりＥＰＡを抽出する試みは既に行われてい
る（特開平11-137219号公報、特開平11-116983号公報）
が、これら水産動物組織からの脂質の抽出は容易ではな
く、多大な労力を必要とする。これに対し本発明の特徴
は、高度不飽和脂肪酸供給源と培地成分として水産廃棄
物を利用し、微生物に水産廃棄物由来の高度不飽和脂肪
酸を取り込ませることによって、微生物脂質として高度
不飽和脂肪酸を提供することにある。水産廃棄物より調
製した安価な培地で微生物を培養し、実質的にＤＨＡや
ＥＰＡを選択的に微生物に蓄積させることができ、この
ことによって経済的かつ効率的な脂質の抽出、生産が可
能となる。
【００１０】更に微生物としてビブリオ・ルモイエンシ
ス等の細菌を用いることによって、通常、魚介類の内臓
物等に、トリアシルグリセロール結合型として存在して
いるＤＨＡやＥＰＡを、昨今、新しい生理機能が明らか
にされつつあるリン脂質結合型ＤＨＡあるいはＥＰＡに
変換することが可能であり、ＤＨＡやＥＰＡ等の高度不
飽和脂肪酸含有リン脂質を得ることが出来る。
【００１１】 本発明に用いる微生物としては、水産廃
棄物中の高度不飽和脂肪酸を取り込むことのできる微生
物、又はリン脂質生産能を有する微生物であればいずれ
でもよく、特に属、種あるいは株などを限定されるもの
ではない。それらの具体例としては、大腸菌(Escherich
ia coli)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、モリテラ・マ
リナ MP-1株 (Moritella marina strain MP-1) 等が挙
げられる。これらの微生物については、公的微生物保存
機関などから容易に入手可能である。例えば、それらの
微生物としてエッシェリヒア・コリ (Escherichia col
i) (IFO 15044)、バチルス・ズブチリス (Bacillus sub
tilis) (IAM1026)、モリテラ・マリナ MP-1株 (Moritel
la marina strain MP-1)〔ATCC 15381〕、ビブリオ・ル
モイエンシス (Vibrio rumoiensis) (FERM P-14531) が
挙げられる。
【００１２】本発明の高度不飽和脂肪酸含有微生物の製
造方法は、微生物を水産廃棄物から調製した培地で培養
することにより行われる。培養条件は、温度4 〜25℃、
ｐＨ6.5 〜7.5 、培養期間 1〜5 日間である。また、高
度不飽和脂肪酸或いは高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の
製造は、上記培養により得られる微生物或いは該微生物
を含む培養物から溶剤抽出等の常法により脂肪酸類を採
取することにより行われる。
【００１３】本発明で用いる培地は、例えばイカの内蔵
物（イカゴロ）を用いて次のように調製することが出来
る。イカゴロをジューサーにかけ、イカゴロ破砕液を４
℃に一晩置いた後、９０分間煮沸する。放冷後、手ぬぐ
いで絞ることによって、残滓を取り除き、得られたイカ
ゴロ抽出液を、６０℃で７２時間、真空乾燥する。この
とき得られたイカゴロパウダーを２％、塩化ナトリウム
を海洋細菌の場合は３％、非海洋性細菌の場合は０．５
％となるように、それぞれ水道水に溶かし、滅菌後、イ
カゴロ培地として用いることが出来る。
【００１４】このような培地で培養された微生物の菌体
を洗浄後、常法により脂質を溶剤で抽出することにより
高度不飽和脂肪酸或いは高度不飽和脂肪酸含有リン脂質
を得ることができる。上記抽出脂質を１０％メタノール
性塩化アセチルにてメチルエステル化すると、菌体中で
エステル結合しているあらゆる脂肪酸誘導体の脂肪酸組
成をガスクロマトグラフィーで分析出来る。また、湿潤
菌体あるいは乾燥菌体を有機溶剤などを用いて抽出し、
シリカゲル薄層クロマトグラフィーにて脂質を分画した
後、各々脂質の構成脂肪酸を同様にして分析出来る。上
述の方法により分析した本発明の微生物菌体中の高度不
飽和脂肪酸は、主にＤＨＡとＥＰＡであった。それ以外
の脂肪酸の含量の増加は見られなかった。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限
定されるものでない。
【００１６】〔実施例１〕 イカゴロ培地の調製 イカゴロ湿重量１５０ｇに水道水４５０ｍＬを加え、ジ
ューサーにかけた。イカゴロ破砕液を４℃に一晩置いた
後、９０分間煮沸した。放冷後、手ぬぐいで絞ることに
よって、残滓を取り除き、得られたイカゴロ液を、６０
℃で７２時間、真空乾燥した。このとき、イカゴロパウ
ダーが１２ｇ得られた。このイカゴロパウダーを２％、
海洋細菌の場合は３％、非海洋性細菌の場合は０．５％
となるように塩化ナトリウムを、それぞれ水道水に溶か
し、滅菌後、イカゴロ培地として用いた。
【００１７】〔実施例２〕ＤＨＡ生産細菌モリテラ・マ
リナ（Moritella marina）MP-1株（ATCC 15381)を上記
のイカゴロ培地と比較例としてのＬＢ+NaCl培地（１．
０％ トリプトン、０．５％酵母エキス、３．０％ 塩
化ナトリウム）とを用いて、培養温度１０℃で培養し
た。培養液から細胞を遠心分離して集め、０．５M塩化
ナトリウム水溶液で３回洗浄した菌体を得た。常法(Bli
gh, EG, Dyer, WJ. Can. J. Microbial. 37; 911-917(1
959)) に従ってクロロホルム- メタノール有機溶剤抽出
で脂質抽出を行い、各試料を１０％メタノール性塩化ア
セチルに懸濁し、９０℃、３時間反応後、生成した脂肪
酸メチルエステルをＧＬＣで分析した。表1にイカゴロ
培地及びＬＢ+NaCl培地でそれぞれ培養した際のモリテ
ラ・マリナ ＭＰ−１株の全脂質の脂肪酸組成を示す。
通常１％程度しか存在しないＥＰＡの割合が、イカゴロ
培地で培養することによって、１１％まで増加してい
た。
【００１８】イカゴロ培地でモリテラ・マリナ ＭＰ−
１株を培養した場合に得られたＥＰＡの収量は、９２０
μｇ/Ｌであった。これは、培地中に含まれていると見
積もられる全ＥＰＡ量の約１０％に相当した。また、同
条件でＤＨＡの収量は１０００μｇ/Ｌであった。これ
らの値は、ＬＢ+NaCl培地を用いたときのＥＰＡおよび
ＤＨＡの収量、９μｇ/Ｌ、１８３μｇ/Ｌより高いもの
であった。
【００１９】表1
【００２０】全脂質試料を２次元薄層クロマトグラフィ
ーに掛け流出溶剤として1次元目にクロロホルム：メタ
ノール：水＝65 : 25 ：4(V/V/V)、2次元目にクロロホ
ルム：メタノール：28％アンモニア水＝65 : 35 ：5(V/
V/V)を用い、各脂質クラスに分画し、薄層プレート上の
各脂質のスポットをかきとり、各試料を１０％メタノー
ル性塩化アセチルに懸濁し、９０℃、３時間反応後、生
成した脂肪酸メチルエステルをＧＬＣで分析した。
【００２１】表２は、イカゴロ培地、ＬＢ+NaCl培地で
培養した際のモリテラ・マリナＭＰ−１株の各脂質クラ
スの脂肪酸組成を示す。イカゴロ培地で培養した場合、
ＥＰＡは薄層クロマトグラフィーで分画されたホスファ
チジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリ
セロール（ＰＧ）に存在していることが解り、培地中の
脂肪酸は、細菌菌体に取り込まれ、膜脂質の成分として
存在していることが解った。このとき、得られた全ＰＥ
と全ＰＧの収量は、それぞれ７６８３μｇ/Ｌ、２３５
９μｇ/Ｌであった。従って、イカゴロ中にトリアシル
グリセロール結合型として存在しているＤＨＡやＥＰＡ
を、細菌の自然増殖を利用して、リン脂質結合型ＤＨＡ
及び同ＥＰＡ（高度不飽和リン脂質）に変換できること
が解った。
【００２２】表２
【００２３】〔実施例３〕高度不飽和脂肪酸を生産しな
い細菌ビブリオ・ルモイエンシス（Vibrio rumoiensi
s）Ｓ-１株(FERM P-14531)を上記のイカゴロ培地と比較
例としてのＰＹＳ培地（１．０％ ポリペプトン、０．
５％ 酵母エキス、１．０％ 塩化ナトリウム）とを用
いて、培養温度２７℃でそれぞれ培養した。培養液から
菌体を遠心分離して集め、０．１M塩化ナトリウム水溶
液で３回洗浄し、菌体を得た。常法(Bligh-Dyer法) に
従ってクロロホルム- メタノール- 水で脂質抽出を行
い、得られる各脂質を１０％メタノール性塩化アセチル
に懸濁し、９０℃、３時間エステル化反応を行った。そ
して、生成した脂肪酸メチルエステルをＧＬＣで分析し
た。
【００２４】表３にイカゴロ培地、培地で培養した際の
ビブリオ・ルモイエンシス Ｓ-１株の全脂質の脂肪酸
組成を示す。通常存在しないＥＰＡ、ＤＨＡが、イカゴ
ロ培地で培養することによって、それぞれ９％、１０％
まで増加していた。このときのＥＰＡ及びＤＨＡの収量
は、４１２２μｇ/Ｌ、４５８０μｇ/Ｌであった。この
ようにイカゴロ培地を用いることによって、高度不飽和
脂肪酸を生産しない細菌での高度不飽和脂肪酸の生産が
可能になることが解った。ビブリオ・ルモイエンシス
Ｓ-１株の殆どの脂質はリン脂質であることから、イカ
ゴロ中にトリアシルグリセロール結合型として存在して
いるＤＨＡやＥＰＡを、細菌の自然増殖を利用して、リ
ン脂質結合型ＤＨＡ及び同ＥＰＡ（高度不飽和リン脂
質）に変換できることが解った。
【００２５】表３
【００２６】
【発明の効果】水産廃棄物、特に魚介類の内臓物より調
製した培地中で微生物を培養することによって、魚介類
の内臓物由来の高度不飽和脂肪酸を微生物に取り込むこ
とによって特異的に回収することができ、結果として主
にＤＨＡとＥＰＡといった高度不飽和脂肪酸を含有した
微生物が得られ、高度不飽和脂肪酸含有微生物を効率良
く短時間で製造するこが可能となった。更に微生物とし
て細菌を用いることによって、通常、魚介類の内臓物等
にトリアシルグリセロール結合型として存在しているＤ
ＨＡやＥＰＡを、昨今、新しい生理機能が明らかにされ
つつあるリン脂質結合型ＤＨＡあるいはＥＰＡに変換す
ることが可能であり、ＤＨＡやＥＰＡを含む高度不飽和
リン脂質を得ることができる。水産廃棄物、特に魚介類
の内臓物より調製した培地を用いることによって、経済
性の向上に寄与するとともに、廃棄物の処理、有効利用
に貢献することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:185） Ｃ１２Ｒ 1:07 (Ｃ１２Ｐ 7/64 1:01 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:63 (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:63） (72)発明者 湯本 勳 北海道札幌市豊平区月寒東２条17丁目２ 番１号 工業技術院北海道工業技術研究 所内 (56)参考文献 特開 平４−341180（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−56345（ＪＰ，Ａ) Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋ ｋａｉｓｈｉ， Ｖｏｌ．65，Ｎｏ．４ （1999），ｐ．732−738 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12P 7/64 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エッシェリヒア属、バチルス属、モリテ
    ラ属またはビブリオ属に属し、水産廃棄物中の高度不飽
    和脂肪酸を取り込むことができる微生物を水産廃棄物よ
    り調製した培地中で培養することを特徴とする高度不飽
    和脂肪酸含有微生物の製造法。
  2. 【請求項２】 水産廃棄物が魚介類の内蔵物である、請
    求項１記載の高度不飽和脂肪酸含有微生物の製造法。
  3. 【請求項３】 エッシェリヒア属、バチルス属、モリテ
    ラ属またはビブリオ属に属し、水産廃棄物中の高度不飽
    和脂肪酸を取り込むことができる微生物を水産廃棄物よ
    り調製した培地中で培養し高度不飽和脂肪酸を生産せし
    め、培養物から高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴
    とする高度不飽和脂肪酸の製造法。
  4. 【請求項４】 水産廃棄物が魚介類の内蔵物である、請
    求項３記載の高度不飽和脂肪酸の製造法。
  5. 【請求項５】 エッシェリヒア属、バチルス属、モリテ
    ラ属またはビブリオ属に属し、水産廃棄物中の高度不飽
    和脂肪酸を取り込むことができ、かつリン脂質生産能を
    有する微生物を水産廃棄物より調製した培地中で培養す
    ることを特徴とする高度不飽和脂肪酸含有リン脂質含有
    微生物の製造法。
  6. 【請求項６】 水産廃棄物が魚介類の内蔵物である、請
    求項５記載の高度不飽和脂肪酸含有リン脂質含有微生物
    の製造法。
  7. 【請求項７】 エッシェリヒア属、バチルス属、モリテ
    ラ属またはビブリオ属に属し、水産廃棄物中の高度不飽
    和脂肪酸を取り込むことができ、かつリン脂質生産能を
    有する微生物を水産廃棄物より調製した培地中で培養し
    高度不飽和脂肪酸含有リン脂質を生産せしめ、培養物か
    ら高度不飽和脂肪酸含有リン脂質を採取することを特徴
    とする高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造法。
  8. 【請求項８】 水産廃棄物が魚介類の内蔵物である、請
    求項７記載の高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造法。
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