WO2024150941A1 - 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 아라키돈산을 함유한 오일 생산 방법 - Google Patents

신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 아라키돈산을 함유한 오일 생산 방법 Download PDF

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WO2024150941A1
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schizochytrium
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강혜원
신원섭
유애진
장성훈
김지영
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • This application relates to a novel Schizochytrium sp. strain and a method for producing oil containing arachidonic acid using the same.
  • Thraustochytrid survives and is distributed in various environments in the natural world. They attach to organisms and live in symbiosis, or they float in marine environments, freshwater, or brackish water environments, and survive by being distributed in various sedimentary terrain layers. These thraustochytrids belong to the lowest level of the marine ecological food chain, and are also classified as phytoplankton and organic heterotrophic protist microalgae.
  • Omega-3 including docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentaenoic acid (EPA), and arachidonic acid (ARA) contained in thraustochytrid, is essential to the marine ecosystem. It functions as a supply source.
  • docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid are known to be essential fatty acids for the brain, eye tissue, and nervous system, and also play an important role in preventing cardiovascular diseases.
  • Arachidonic acid which exists in the brain in amounts similar to docosahexaenoic acid, is known to be involved in the growth of neurons and the development of the nervous system. Due to this role, it is known that supplementing arachidonic acid in the early stages of Alzheimer's disease can reduce symptoms and slow the progression of the disease.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the main external source of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid is fish oil extracted from the oil of blue fish such as mackerel, saury, tuna, horse mackerel, sardine, herring, etc., which is also very useful as fish feed, such as initial feed for saltwater fish. It is being used usefully.
  • Arachidonic acid is obtained from animal foods when linoleic acid cannot be converted to arachidonic acid.
  • Polyunsaturated fatty acids extracted from fish oil are used in a high proportion industrially, but depending on the fish species, season, and location of fishing, they affect the quality of fish oil, supply according to the amount of catch may be continuously difficult, and may contain heavy metals. There are also disadvantages.
  • fatty acid synthesis using microalgae is extracted through culture, it can be produced in a shorter period of time than extraction of unsaturated fatty acids through fishing, and because it does not affect quality depending on season or location, it can be manufactured with a relatively constant composition.
  • unsaturated fatty acids extracted using microalgae have the advantage of being easier to manufacture the target product because they have a simpler fatty acid composition than fish oil.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • ARA arachidonic acid
  • DPA docosapentaenoic acid
  • ⁇ -linolenic acid mainly a type of marine microalgae.
  • Polyunsaturated fatty acids are produced using microorganisms of the genus Thraustochytrium and Schizochytrium .
  • Schizochytrium sp a microorganism of the genus Schizochytrium. ATCC20888 ( Schizochytrium sp. ATCC20888) and Schizochytrium sp.
  • a method for producing omega-3 polyunsaturated fatty acids using PTA10208 has been disclosed (US Patent No. 5,130,242), and in addition, Trauzochytrium sp., a microorganism of the Trauzochytrium genus of the Trauzochytrid family.
  • a method for producing docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid using ATCC10212 Thraustochytrium sp. PTA10212 is disclosed.
  • Patent Document 1 US Published Patent US 5130242 A
  • the novel microalgae of the Schizochytrium genus may be the CD02-8025 strain of the Schizochytrium genus, a microalgae deposited with the deposit number KCTC 15246BP, which has the ability to produce omega-3 and omega-6 unsaturated fatty acids. .
  • Another example of the present application provides biomass derived from a Schizochytrium genus strain, including the Schizochytrium genus strain, a culture of the strain, a dried product of the culture, or a shredded product of the dried product.
  • Another example of the present application provides a feed composition or food composition containing the Schizochytrium genus strain, a culture of the strain, a dried product of the culture, or a shredded product of the dried product.
  • Another example of the present application provides a method for producing biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium genus strain.
  • Another example of the present application provides a microbial preparation for producing docosahexaenoic acid, eicosapentaenoic acid, palmitic acid, or arachidonic acid containing the Schizochytrium genus strain or its culture medium as an active ingredient.
  • An example of the present application provides a novel Schizochytrium sp. microalgae.
  • Schizochytrium sp is one of the genus names belonging to the family Thraustochytriaceae of the order Thraustochytriales, and the term “genus Schizochytrium " Can be used interchangeably with .
  • microalgae refers to organisms that cannot be seen with the naked eye and can only be seen through a microscope among plants that photosynthesize with chlorophyll and that live freely floating in water, and are also called phytoplankton.
  • the novel Schizochytrium genus strain may be a mutant strain obtained by mutating the wild-type Schizochytrium genus strain, which is the parent strain.
  • parent strain refers to the strain before mutagenesis and can be used interchangeably with “wild-type strain.”
  • the parent strain may be a wild-type Schizochytrium genus strain, and specifically, may be a wild-type Schizochytrium genus CD01-5000 strain, but is not limited thereto.
  • productivity refers to the ability to produce bio-oil or unsaturated fatty acids, and can be used interchangeably with “productivity”, and is the culture medium after culturing a strain that produces bio-oil or unsaturated fatty acids. Alternatively, it can be confirmed by measuring the content of bio-oil or unsaturated fatty acid contained in the strain-derived biomass.
  • the mutagenesis method may be performed by various means known in the art, and either physical or chemical mutagenesis methods may be used.
  • a method of irradiating gamma rays or ultraviolet rays may be used as a physical mutation method suitable for the present invention, but is not limited thereto.
  • N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), diepoxybutane, ethylmethane sulfonate, mustard compounds, and hydrazine can be obtained through chemical mutagenesis methods. and nitrous acid may be used, but are not limited thereto.
  • Mutation for producing the mutant strain may be performed by irradiating radiation.
  • the radiation for causing the mutation may be gamma rays or ultraviolet rays, and preferably gamma rays.
  • the radiation is administered at 4.0 to 7.0 kGy, 4.5 to 7.0 kGy, 5.0 to 7.0 kGy, 4.0 to 6.5 kGy, 4.5 to 6.5 kGy, 5.0 to 6.5 kGy, 4.0 to 6.0 kGy, 4.5 to 6.0 kGy, or 5.0 to 6.0 kGy per hour. , specifically, it may be a dose of 5.0 kGy, 5.5 kGy, or 6.0 kGy.
  • a mutation is generated by irradiating gamma rays to the wild-type Schizochytrium genus CD01-5000 strain, and among the mutant strains, docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) content are high, and at the same time, A strain with low palmitic acid (PA) content was selected, and it was named Schizochytrium sp. CD02-8025, and as of December 15, 2022, it was registered with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, an international depository organization under the Budapest Treaty. It was deposited at the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) and given accession number KCTC15246BP.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • PA palmitic acid
  • the novel Schizochytrium sp. microalgae may be the Schizochytrium sp. CD02-8025 strain, a microalgae deposited with the deposit number KCTC15246BP.
  • the Schizochytrium genus CD02-8025 strain may produce and/or contain high amounts of omega-3 and omega-6 unsaturated fatty acids.
  • the omega-3 unsaturated fatty acid may be docosahexaenoic acid (DHA) and/or eicosapentaenoic acid (EPA), but is not limited thereto.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the omega-6 unsaturated fatty acid may be arachidonic acid (ARA), but is not limited thereto.
  • ARA arachidonic acid
  • the Schizochytrium genus CD02-8025 strain may produce less saturated fatty acids compared to known Schizochytrium genus strains.
  • the saturated fatty acid may be palmitic acid (PA), but is not limited thereto.
  • the known Schizochytrium genus strain may be a wild-type Schizochytrium genus strain, and in one embodiment, it may be a Schizochytrium genus CD01-5000 strain.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • ALA alpha-linolenic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • cervonic acid cervonic acid, and it can also be abbreviated as C22:6 n-3.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • EPA is one of the polyunsaturated fatty acids with the chemical formula of C 20 H 30 O 2 and is an omega-3 fatty acid along with ALA and DHA. It can also be abbreviated as C20:5 n-3.
  • PA palmitic acid
  • ARA arachidonic acid
  • the novel Schizochytrium genus strain can produce bio-oil containing arachidonic acid and high concentrations of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid.
  • the strains of the Schizochytrium genus contain more than 35% by weight, more than 40% by weight, more than 45% by weight, more than 50% by weight, more than 55% by weight, or more than 57% by weight of docosahexaenoic acid (DHA) based on the total weight of fatty acids. ) may be produced and/or included.
  • the strains of the Schizochytrium genus include 35 to 70% by weight, 35 to 65% by weight, 35 to 60% by weight, 35 to 59% by weight, 35 to 58% by weight, and 40 to 70% by weight, based on the total weight of fatty acids.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the strains of the Schizochytrium genus contain more than 0.8% by weight, more than 1% by weight, more than 1.5% by weight, more than 2% by weight, more than 2.5% by weight, more than 2.6% by weight, more than 2.7% by weight, or more than 2.8% by weight based on the total weight of fatty acids. It may produce and/or contain more than % by weight of eicosapentaenoic acid (EPA).
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the Schizochytrium genus strain contains 0.5 to 10% by weight, 0.5 to 9% by weight, 0.5 to 8% by weight, 0.5 to 7% by weight, 0.5 to 6% by weight, 0.5 to 5% by weight, based on the total weight of fatty acids.
  • EPA pentaenoic acid
  • the strains of the Schizochytrium genus contain 30 wt% or less, 29 wt% or less, 25 wt% or less, 20 wt% or less, 19 wt% or less, 18 wt% or less, 17 wt% or less, or 16 wt% or less, based on the total weight of fatty acids. It may produce and/or contain less than % by weight of palmitic acid (PA).
  • PA palmitic acid
  • the Schizochytrium genus strain contains 0.1 to 30% by weight, 0.1 to 29% by weight, 0.1 to 25% by weight, 0.1 to 20% by weight, 0.1 to 19% by weight, 0.1 to 18% by weight, based on the total weight of fatty acids.
  • PA palmitic acid
  • the Schizochytrium strain contains 0.001% by weight or more, 0.01% by weight, 0.05% by weight, 0.1% by weight, 0.5% by weight, 0.6% by weight, 0.7% by weight or more, 0.8% by weight, based on the total weight of fatty acids. % or more, 0.9% by weight or more, 1% by weight or more, or 1.1% by weight or more of arachidonic acid (ARA).
  • ARA arachidonic acid
  • the Schizochytrium genus strain contains 0.001 to 10% by weight, 0.001 to 5% by weight, 0.001 to 4% by weight, 0.001 to 3% by weight, 0.001 to 2% by weight, 0.001 to 1.5% by weight, based on the total weight of fatty acids.
  • Another aspect of the present application provides a biomass or bio-oil derived from a Schizochytrium strain, including the Schizochytrium strain, a culture of the strain, a dried product of the culture, or a shredded product of the dried product. do.
  • the Schizochytrium genus strains are the same as described above.
  • biomass refers to living organisms such as plants, animals, and microorganisms that can be used as chemical energy, that is, an energy source of bioenergy, and refers to a specific energy source that exists ecologically within unit time and space. It also refers to the weight or amount of energy of a living organism.
  • the biomass includes, but is not limited to, compounds secreted by cells, and may contain cells and/or intracellular contents as well as extracellular materials.
  • the biomass may be the Schizochytrium genus strain (microalgae) itself, its culture, its dried material, its lysate, or a product produced by culturing or fermenting the strain, or concentration of the biomass. It may be water or dry matter, but is not limited thereto.
  • the “culture” of the Schizochytrium genus strain refers to a product produced by culturing the strain, and may specifically be a culture medium containing the strain or a culture filtrate from which the strain has been removed from the culture medium, but is limited thereto. no.
  • the “dried material” of the culture of the Schizochytrium genus strain is one in which moisture has been removed from the culture of the strain, and may be, for example, the form of dried cells of the strain, but is not limited thereto.
  • the “shredded material” of the dried product refers to a general term for the result of crushing the dried material from which moisture has been removed from the strain culture, and may be, for example, dried bacterial cell powder, but is not limited thereto.
  • the culture of the Schizochytrium genus strain can be prepared according to a culture method known in the art by inoculating the strain in the culture medium of the strain, and the dried product of the culture and its lysate are also known in the art ( Microalgae) or culture medium can be prepared according to the treatment or drying method.
  • biomass refers to oil obtained from biomass through biological, thermochemical, and physicochemical extraction processes.
  • the bio-oil may include an extract of biomass.
  • a method of producing the bio-oil extract involves using enzymes such as protease, cellulase, pectinase, or chitinase, depending on the method of breaking or dissolving cell membrane or cell wall components, homogenizer, ultrasonic shredder, and bead treatment.
  • enzymes such as protease, cellulase, pectinase, or chitinase, depending on the method of breaking or dissolving cell membrane or cell wall components, homogenizer, ultrasonic shredder, and bead treatment.
  • Methods such as physically breaking the cell membrane or cell wall components, adding a solvent directly to extract it by permeating it into the cells, and a solvent-free extraction process of separating it through a centrifugation process after various disruption processes can be used. It is not limited.
  • the biomass or bio-oil produced in the present invention may contain omega-3 and omega-6 unsaturated fatty acids.
  • the omega-3 unsaturated fatty acids include docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaene.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA docosahexaenoic acid
  • PA palmitic acid
  • bryophyte may be any one or more
  • the omega-6 unsaturated fatty acid may be arachidonic acid (ARA), but is not limited thereto.
  • the biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium genus strain is 35% by weight or more, 40% by weight, 45% by weight, 50% by weight, 55% by weight, or 57% by weight or more of doco based on the total weight of fatty acids. It may contain sahexaenoic acid (DHA).
  • DHA sahexaenoic acid
  • the biomass derived from the Schizochytrium genus strain is 35 to 70% by weight, 35 to 65% by weight, 35 to 60% by weight, 35 to 59% by weight, 35 to 58% by weight, based on the total weight of fatty acids, 40 to 70% by weight, 40 to 65% by weight, 40 to 60% by weight, 40 to 59% by weight, 40 to 58% by weight, 45 to 70% by weight, 45 to 65% by weight, 45 to 60% by weight, 45 to 59% by weight, 45 to 58% by weight, 50 to 70% by weight, 50 to 65% by weight, 50 to 60% by weight, 50 to 59% by weight, 50 to 58% by weight, 53 to 70% by weight, 53 to 65% by weight %, 53 to 60% by weight, 53 to 59% by weight, 53 to 58% by weight, 55 to 70% by weight, 55 to 65% by weight, 55 to 60% by weight, 55 to 59% by weight, 55 to 58% by weight, Alternatively, it may contain 56 to 58% by weight of docosahexaenoic acid (
  • the biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium genus strain is 0.8% by weight or more, 1% by weight or more, 1.5% by weight or more, 2% by weight or more, 2.5% by weight or more, 2.6% by weight or more, 2.7% by weight or more based on the total weight of fatty acids. It may contain more than % by weight, or more than 2.8% by weight of eicosapentaenoic acid (EPA).
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium genus strain is 0.5 to 10% by weight, 0.5 to 9% by weight, 0.5 to 8% by weight, 0.5 to 7% by weight, 0.5 to 6% by weight, based on the total weight of fatty acids.
  • Weight% 0.5 to 5% by weight, 1 to 10% by weight, 1 to 9% by weight, 1 to 8% by weight, 1 to 7% by weight, 1 to 6% by weight, 1 to 5% by weight, 1.5 to 10% by weight , 1.5 to 9% by weight, 1.5 to 8% by weight, 1.5 to 7% by weight, 1.5 to 6% by weight, 1.5 to 5% by weight, 2 to 10% by weight, 2 to 9% by weight, 2 to 8% by weight, 2 to 7 wt%, 2 to 6 wt%, 2 to 5 wt%, 2.5 to 10 wt%, 2.5 to 9 wt%, 2.5 to 8 wt%, 2.5 to 7 wt%, 2.5 to 6 wt%, or 2.5 to It may contain 5% by weight of eicosapentaenoic acid (EPA).
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium strain is 30% by weight or less, 29% by weight or less, 25% by weight or less, 20% by weight or less, 19% by weight or less, 18% by weight or less, 17 based on the total weight of fatty acids. It may contain less than % by weight, or less than 16% by weight of palmitic acid (PA).
  • PA palmitic acid
  • the biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium genus strain is 0.1 to 30% by weight, 0.1 to 29% by weight, 0.1 to 25% by weight, 0.1 to 20% by weight, 0.1 to 19% by weight, based on the total weight of fatty acids.
  • PA palmitic acid
  • the biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium genus strain is 0.001% by weight or more, 0.01% by weight or more, 0.05% by weight or more, 0.1% by weight or more, 0.5% by weight or more, 0.6% by weight or more, 0.7% by weight or more based on the total weight of fatty acids. It may contain at least 0.8% by weight, at least 0.9% by weight, at least 1% by weight, or at least 1.1% by weight of arachidonic acid (ARA).
  • ARA arachidonic acid
  • the biomass or bio-oil derived from the Schizochytrium strain is 0.001 to 10% by weight, 0.001 to 5% by weight, 0.001 to 4% by weight, 0.001 to 3% by weight, 0.001 to 2% by weight, based on the total weight of fatty acids.
  • Weight % 0.001 to 1.5 weight %, 0.01 to 10 weight %, 0.01 to 5 weight %, 0.01 to 4 weight %, 0.01 to 3 weight %, 0.01 to 2 weight %, 0.01 to 1.5 weight %, 0.1 to 10 weight % , 0.1 to 5% by weight, 0.1 to 4% by weight, 0.1 to 3% by weight, 0.1 to 2% by weight, 0.1 to 1.5% by weight, 0.5 to 10% by weight, 0.5 to 5% by weight, 0.5 to 4% by weight, 0.5 to 3% by weight, 0.5 to 2% by weight, 0.5 to 1.5% by weight, 0.7 to 10% by weight, 0.7 to 5% by weight, 0.7 to 4% by weight, 0.7 to 3% by weight, 0.7 to 2% by weight, 0.7 to 1.5% by weight %, 0.7 to 1.3 wt.
  • % 1 to 10 wt. %, 1 to 5 wt. %, 1 to 4 wt. %, 1 to 3 wt. %, 1 to 2 wt. %, or 1 to 1.5 wt. % arachidonic acid (ARA) ) may include.
  • ARA arachidonic acid
  • compositions comprising Schizochytrium sp. CD02-8025 strain, a culture of the strain, a dried product of the culture, and a shredded material of the dried product.
  • the composition may include biomass, bio-oil, or a combination thereof derived from the Schizochytrium strain.
  • the Schizochytrium genus strain, biomass, bio-oil, culture of the strain, dried product of the culture, and shredded material of the dried product are as described above.
  • the composition may be in the form of a solution, powder, or suspension, but is not limited thereto.
  • the composition may be, for example, a food composition, feed composition, or feed additive composition.
  • feed composition refers to the feed fed to animals.
  • the feed composition refers to a substance that supplies organic or inorganic nutrients necessary to maintain animal life or produce meat, milk, etc.
  • the feed composition may additionally contain nutrients necessary for maintaining animal life or producing meat, milk, etc.
  • the feed composition can be manufactured from various types of feed known in the art, and may specifically include concentrate feed, roughage feed, and/or special feed.
  • feed additive is added to feed for various effects, such as supplementing nutrients and preventing weight loss, improving the digestibility of fiber in feed, improving milk quality, preventing reproductive disorders and improving conception rates, and preventing high temperature stress in the summer.
  • the feed additive of this application corresponds to supplementary feed under the Feed Management Act, and includes mineral preparations such as sodium bicarbonate, bentonite, magnesium oxide, and complex minerals, mineral preparations such as trace minerals such as zinc, copper, cobalt, and selenium, and kerotene.
  • vitamins such as vitamin E, vitamins A, D, E, nicotinic acid, and vitamin B complex
  • protective amino acids such as methionine and lysic acid
  • protective fatty acids such as fatty acid calcium salts
  • probiotics lactic acid bacteria
  • yeast cultures and molds.
  • Live bacteria such as fermented products, yeast agents, etc. may be additionally included.
  • food composition includes all forms of functional food, nutritional supplements, health food, and food additives, and includes all forms of the above types. Food compositions can be manufactured in various forms according to conventional methods known in the art.
  • compositions of the present application may include grains such as ground or ground wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feeds, such as those based on soybean and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; It may further include dry ingredients such as sugar and dairy products, such as various powdered milk and whey powder, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, etc.
  • composition of the present application may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier. Additionally, the composition can be easily administered to animals as a top dressing, by mixing them directly into feed, or in an oral formulation separate from feed. When the composition is administered separately from feed, it can be prepared as an immediate-release or sustained-release formulation by combining it with a pharmaceutically acceptable edible carrier, as is well known in the art.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier can be solid or liquid, such as corn starch, lactose, sucrose, soybean flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • a solid carrier the composition may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet, or a top dressing in microdisperse form.
  • a liquid carrier the composition may be in the form of a gelatin soft capsule, or a syrup, suspension, emulsion, or solution.
  • composition of the present application may contain, for example, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, cryoprotectants, or excipients.
  • cryoprotectant may be one or more selected from the group consisting of glycerol, trehalose, maltodextrin, skim milk powder, and starch.
  • the preservative, stabilizer, or excipient may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce deterioration of microalgae of the genus Schizochytrium included in the composition.
  • the cryoprotectant may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce the degradation of microalgae of the genus Schizochytrium included in the composition when the composition is in a dried state.
  • the composition can be used by injecting, spraying, or mixing it and adding it to animal feed.
  • compositions of the present application can be applied to the diet of a number of animals, including, but not limited to, mammals, birds, fish, crustaceans, cephalopods, reptiles and amphibians.
  • the mammals may include pigs, cows, sheep, goats, laboratory rodents, or pets, and the birds may include poultry, and the poultry may include chickens, turkeys, ducks, geese, It may include, but is not limited to, pheasant or quail.
  • the fish may include commercial farmed fish, their fry, ornamental fish, etc.
  • the crustaceans may include shrimp, barnacles, etc., but are not limited thereto.
  • the composition can also be applied to the diet of rotifers, which are zooplankton.
  • Another aspect of the present application includes culturing Schizochytrium sp. CD02-8025 strain; and recovering biomass from the strain, the culture of the strain, the dried product of the culture, or the shredded material of the dried product. It provides a method for producing biomass derived from a Schizochytrium strain.
  • the Schizochytrium genus strain, biomass, culture of the strain, dried product of the culture, and shredded material of the dried product are as described above.
  • culture means growing the strain under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application can be carried out according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art depending on the strain selected.
  • the cultivation of Schizochytrium genus strains of the present application may be performed under heterotrophic conditions, but is not limited thereto.
  • heterotrophic material used in this specification is a nutritional method that relies on organic matter obtained from outside the body as an energy or nutrient source, and is a term corresponding to autotrophy, and can be used interchangeably with the term 'cancer culture'.
  • the step of cultivating the Schizochytrium genus strain is not particularly limited thereto, but may be performed by known batch culture methods, continuous culture methods, fed-batch culture methods, etc.
  • the medium and other culture conditions used for cultivating the strains of this application can be any medium used for cultivating ordinary microalgae without any particular restrictions.
  • the strain of the present application can be cultured under aerobic conditions in a typical medium containing appropriate carbon sources, nitrogen sources, phosphorus, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins, etc., while controlling temperature, pH, etc.
  • a basic compound e.g. sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound e.g. phosphoric acid or sulfuric acid
  • pH e.g. pH 5 to 9, specifically pH 6 to 8, most specifically can adjust pH 6.8
  • oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the culture, or in order to maintain the anaerobic and microaerobic state, nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected without gas injection. It is not limited.
  • the culture temperature can be maintained at 20 to 45°C or 25 to 40°C, and culture can be performed for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto. Additionally, during culturing, foam generation may be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester, but is not limited thereto.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester, but is not limited thereto.
  • the carbon source contained in the medium used in the step of cultivating the Schizochytrium strain may be one or more selected from the group consisting of glucose, fructose, maltose, galactose, mannose, sucrose, arabinose, xylose, and glycerol.
  • the carbon source used to cultivate microalgae is not limited thereto.
  • the nitrogen source contained in the medium used in the step of cultivating the Schizochytrium strain is i) at least one organic nitrogen source selected from the group consisting of yeast extract, beef extract, peptone, and tryptone. , or ii) it may be any one or more inorganic nitrogen sources selected from the group consisting of ammonium acetate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, and MSG (Monosodium glutamate), but is used for cultivating microalgae. If it is a nitrogen source, it is not limited thereto.
  • the medium used in the step of cultivating the Schizochytrium strain may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and corresponding sodium-containing salts individually or in combination as a phosphorus source, but is limited thereto. It doesn't work.
  • the step of recovering biomass from the strain, the culture of the strain, the dried product of the culture, or the shredded product of the dried product may be collecting the desired biomass using a suitable method known in the art. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC may be used, and may further include a purification process.
  • Another aspect of the present application includes culturing Schizochytrium sp. CD02-8025 strain; and recovering lipids from the strain, the culture of the strain, the dried product of the culture, or the crushed product of the dried product. It provides a method for producing bio-oil derived from a Schizochytrium strain.
  • the steps of cultivating the Schizochytrium genus strain, bio-oil, culture of the strain, dried product of the culture, and shredded material of the dried product, and the strain are as described above.
  • the step of recovering lipids from the strain, the culture of the strain, the dried product of the culture, or the lysate of the dried product may be collecting the lipid of interest using a suitable method known in the art. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC may be used, and may further include a purification process.
  • lipids and lipid derivatives such as fatty aldehydes, fatty alcohols and hydrocarbons (e.g. alkanes) can be extracted with hydrophobic solvents such as hexane.
  • Lipids and lipid derivatives can also be extracted using methods such as liquefaction, oil liquefaction and supercritical CO 2 extraction.
  • known microalgae lipid recovery methods include, for example, i) collecting cells by centrifugation, washing with distilled water, drying by freeze-drying, ii) pulverizing the obtained cell powder, and n- There is a method for extracting lipids with hexane (Miao, X and Wu, Q, Biosource Technology (2006) 97:841-846).
  • Another aspect of the present application provides a microbial preparation for producing docosahexaenoic acid, eicosapentaenoic acid, palmitic acid, or arachidonic acid containing the Schizochytrium genus CD02-8025 strain or its culture medium as an active ingredient. .
  • the bio-oil produced by a novel strain of the Schizochytrium genus having the ability to produce omega-3 and omega-6 unsaturated fatty acids of the present invention has a high content of unsaturated fatty acids of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid, It has the advantage of high fluidity due to its low content of palmitic acid, a saturated fatty acid, making it easy to store and use.
  • the strain itself, biomass produced by culturing and fermenting the strain, and its concentrates and extracts can be used as feed compositions or foods. It can be usefully used as a composition for use, etc.
  • the bio-oil produced by the strain contains arachidonic acid, an essential nutrient that plays an important role in the development of the nervous system, and has the advantage of being used as a feed or food composition.
  • the gamma ray irradiation experiment was conducted at the Advanced Radiation Research Institute of the Korea Atomic Energy Research Institute, and a dose of 5.5 kGY of gamma ray was irradiated.
  • Gamma-irradiated microalgae culture samples undergo a recovery process during O/N in a dark room, then are plated and cultured on GYEP medium containing 20 g/L of agar and octyl gallate, which inhibits fatty acid synthesis. did.
  • Microalgae colonies that grew in culture for about 2 weeks were selected and passaged under the same medium and culture environment conditions. Strains that were capable of continuous growth between passages and had excellent colony growth were given priority.
  • colonies that were morphologically red and growing quickly were selected.
  • the selected colonies were pure isolated and cultured as a single cell line, and the strain was named CD02-8025, and as of December 15, 2022, the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Korean Collection for Type Cultures: KCTC), an international depositary organization under the Budapest Treaty. ) and was given accession number KCTC15246BP.
  • Example 2-1 Analysis of crude fat and fatty acid content of pre-culture medium of strain CD02-8025
  • Fermentation culture was evaluated to confirm the culture characteristics of the mutant Schizochytrium genus CD02-8025 strain selected in Example 1.
  • a 250 ml flask containing a working volume of 50 ml and 30 g/L of glucose was prepared.
  • GYEP medium was inoculated and cultured in a shaking incubator at 30°C and 180 rpm for about 48 hours. After the pre-cultivation was completed, the culture medium was dried to a moisture content of 5 to 8%, and the crude fat and fatty acid contents were analyzed and are shown in Table 1 below.
  • the flask level culture medium of the Schizochytrium genus CD02-8025 strain had a high omega-3 content, especially docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA). It was confirmed that the content was high.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • Example 2-2 Analysis of crude fat and fatty acid content in culture samples of CD02-8025 mutant strain and wild-type CD01-5000 strain.
  • the Schizochytrium genus CD02-8025 strain which was confirmed to have high omega-3 content in Example 2-1, was inoculated into a 30 L fermenter containing a medium under the same conditions and fermented and cultured in a total working volume of 20 L. Glucose equivalent to 20% of the working volume is continuously injected under the conditions of 30°C, 500 rpm, 0.5-1 vvm, pH 5-7 and used for cell culture. At this time, the glucose concentration is maintained at 20 g/L. did. The culture was terminated when all of the supplied carbon source, glucose, was consumed. After the culture was completed, the fermented broth was dried to a moisture content of about 5 to 8% using a freeze dryer, and the obtained dried bacteria were used for analysis of crude fat and fatty acid content.
  • the wild type CD01-5000 strain and the mutant CD02-8025 strain produced biomass of about 100 - 120 g/L.
  • the biomass produced by the CD02-8025 strain contained 16% of palmitic acid (C16:0) in crude fat, a content reduced by about 47.2% compared to the wild type strain.
  • the EPA (C20:5 n-3) content was more than 430% and the DHA (C22:6 n-3) content was more than 13.5% higher than that of omega-3 components. did.
  • Example 3 Analysis of crude fat and fatty acid content of oil extracts of CD02-8025 mutant strain and wild-type CD01-5000 strain
  • mutant strain CD02-8025 strain and the wild type CD01-5000 strain were subjected to 5 L scale fermentation culture.
  • the main culture of the 5 L scale was performed at 30°C, 800 rpm, 1 vvm, and glucose was supplied as a carbon source in a fed-batch manner.
  • glucose was supplied as a carbon source in a fed-batch manner.
  • the bacterial cells were harvested and analyzed for 37 types of FAME fatty acids for the two strains through oil extraction, and the results are shown in Table 3 below.
  • the novel Schizochytrium genus CD02-8025 strain of the present invention can produce bio-oil with high fluidity, and the produced bio-oil has the advantage of being easy to store and use due to its low palmitic acid content. You can see that there is.
  • Arachidonic acid is known to be an essential nutrient that plays an important role in the development of the nervous system. Therefore, the novel Schizochytrium CD02-8025 strain of the present invention has the advantage of being a food or feed composition by containing arachidonic acid, an essential nutrient required for the development of the nervous system. You can see that there is.

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Abstract

본 출원은 신규한 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 균주 및 이를 이용한 아라키돈산을 함유한 오일 생산 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 신규한 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 균주가 생산한 바이오오일은 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산의 함량이 높고, 팔미트산 함량이 낮아 유동성이 높다는 장점이 있으며, 신경계 발달에 중요한 역할을 하는 필수 영양소인 아라키돈산을 포함하고 있어, 상기 미세조류, 이로부터 제조되는 바이오매스 또는 바이오오일은 사료 또는 식품 원료 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 아라키돈산을 함유한 오일 생산 방법
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2023년 1월 13일자 한국 특허 출원 제10-2023-0005633호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌들에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 및 이를 이용한 아라키돈산을 함유한 오일 생산 방법에 관한 것이다.
트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 자연계 내의 다양한 환경에서 생존 및 분포하고 있다. 유기체에 부착하여 공생을 하거나, 해양 환경 또는 담수, 기수 환경에 부유하기도 하며, 다양한 퇴적지형 층에 분포하여 생존한다. 이러한 트라우스토키트리드는 해양 생태 먹이사슬의 최하위 계층에 속하며, 식물성 플랑크톤으로서 유기종속영양 원생생물 미세조류로 분류되기도 한다.
트라우스토키트리드가 함유하고 있는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)을 포함하는 오메가-3는 해양 생태계의 공급원으로서의 기능을 한다. 또한, 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산은 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 알려져 있으며, 심혈관 질병 예방에도 중요한 역할을 한다. 도코사헥사엔산과 비슷한 양으로 뇌에 존재하는 아라키돈산은 뉴런의 성장과 신경계의 발달 과정에도 관여한다고 알려져 있다. 이러한 역할로 알츠하이머병의 초기 단계에서 아라키돈산을 보충해 주면 증상이 줄어들고, 병의 진행을 늦출 수 있다고 알려져 있다.
대부분의 고등생물들은 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA)를 자체적으로 합성하지 못하기 때문에 필수 영양소로 외부를 통해서 섭취해야 한다. 주된 도코사헥사엔산과 에이코사펜타엔산의 외부 공급원은 고등어, 꽁치, 참치, 전갱이, 정어리, 청어 등과 같은 등 푸른 생선의 기름에서 추출된 어유이며, 이는 해수 어류 초기 먹이와 같은 양어 사료로서도 매우 유용하게 사용되고 있다. 아라키돈산의 경우 리놀레인산을 아라키돈산으로 전환시킬 수 없는 경우 동물성 식품으로부터 얻는다.
어유로부터 추출되는 다중불포화지방산은 산업적으로 높은 비중으로 사용되고 있지만 어종, 계절, 어획의 위치에 따라 어유의 품질에 영향을 미치고 어획량에 따른 공급이 지속적으로 어려울 수 있으며, 중금속이 포함될 수 있는 등과 같은 많은 단점도 존재한다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 어획을 통한 오메가-3의 제공이 아닌 미생물 배양으로 도코사헥사엔산과 에이코사펜타엔산 등을 포함한 불포화지방산을 제조하는 연구가 이루어 지고 있다.
미세조류를 이용한 지방산 합성은 배양을 통하여 추출하기 때문에 어획을 통한 불포화지방산 추출보다 짧은 기간 내에 생성이 가능하며, 계절과 위치에 따른 품질에 영향을 미치지 않기 때문에 상대적으로 일정한 조성으로 제조할 수 있다. 또한, 미세조류를 이용하여 추출한 불포화지방산은 어유에 비하여 단순한 지방산 조성으로 이루어져 있기 때문에 목적 산물을 제조하기 용이하다는 장점이 있다.
이러한 장점을 바탕으로, 최근 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산 (Eicosapentaenoic acid, EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산 (Docosapentaenoic acid, DPA), 및 α-리놀렌산 등과 같은 오메가-3 불포화 지방산(ω-3 unsaturated fatty acid)을 포함하는 다중불포화 지방산 생산에 관한 연구 및 산업화가 매우 빠르게 진행되고 있으며, 주로 해양 미세조류의 일종인 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 미생물을 이용하여 다중불포화지방산을 생산하고 있다. 실례로, 스키조카이트리움속 미생물인 스키조키트리움 sp. ATCC20888 (Schizochytrium sp. ATCC20888) 및 스키조키트리움 sp. PTA10208 (Schizochytrium sp. PTA10208)를 이용하여 오메가-3 다중불포화지방산을 제조하는 방법을 개시되었으며 (미국 특허 제5,130,242호), 추가적으로 트라우조카이트리드 계 트라우조키트리움 속 미생물인 트라우조키트리움 sp. ATCC10212 (Thraustochytrium sp. PTA10212)를 이용하여 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 제조하는 방법을 개시하고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 미국 공개특허 US 5130242 A
본 출원의 일 예는 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류를 제공한다. 일 구체에서, 상기 신규한 스키조키트리움 속 미세조류는 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산 생산능을 가지는, 기탁번호가 KCTC 15246BP로 기탁된 미세조류인 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주일 수 있다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는, 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스를 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는 사료 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일 제조방법을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 팔미트산 또는 아라키돈산 제조용 미생물 제제를 제공한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 일 예는 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.)"은 트라우스토키트리알레스 목의 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae) 과에 속하는 속명 중 하나로, 용어 "스키조키트리움 속(genus Schizochytrium)"과 혼용될 수 있다. 또한, 상기 용어 "미세조류(microalgae)"는 엽록소로 광합성을 하는 식물 중 육안으로 볼 수 없어 현미경을 통해서만 볼 수 있으며 물속에서 자유로이 부유하여 살아가는 생물을 의미하며, 식물플랑크톤(Phytoplankton)이라고도 불린다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “스키조키트리움 속 균주”는 “스키조키트리움 속 미세조류”와 혼용될 수 있다.
상기 신규한 스키조키트리움 속 균주는 모균주인 야생형 스키조키트리움 속 균주를 돌연변이시켜 얻은 변이 균주일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “모균주”는 돌연변이 유발 전의 균주를 의미하는 것으로, “야생형 균주”와 혼용될 수 있다.
상기 모균주는 야생형 스키조키트리움 속 균주일 수 있고, 구체적으로, 야생형 스키조키트리움 속 CD01-5000 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “생산성”은 바이오오일 또는 불포화 지방산을 생산할 수 있는 능력을 의미하는 것으로, “생산능”과 혼용될 수 있으며, 바이오오일 또는 불포화 지방산을 생산하는 균주를 배양한 후의 배양액 또는 균주 유래 바이오매스에 포함된 바이오오일 또는 불포화 지방산의 함량을 측정하여 확인할 수 있다.
상기 돌연변이 방법은 해당 분야에 공지된 다양한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발 방법 중 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적합한 물리적 돌연변이 방법으로 감마선 또는 자외선을 조사하는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 화학적 돌연변이 방법으로 N-메틸-N’-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG), 디에폭시부탄, 에틸메탄 설폰에이트, 머스타드 화합물, 히드라진 및 아질산을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 변이 균주를 제조하기 위한 돌연변이는 방사선을 조사하는 방법에 의한 것일 수 있다.
상기 돌연변이를 유발하기 위한 방사선은 감마선 또는 자외선일 수 있고, 바람직하게는 감마선일 수 있다.
상기 방사선은 시간 당 4.0 내지 7.0 kGy, 4.5 내지 7.0 kGy, 5.0 내지 7.0 kGy, 4.0 내지 6.5 kGy, 4.5 내지 6.5 kGy, 5.0 내지 6.5 kGy, 4.0 내지 6.0 kGy, 4.5 내지 6.0 kGy, 또는 5.0 내지 6.0 kGy, 구체적으로 5.0 kGy, 5.5 kGy, 또는 6.0 kGy 선량일 수 있다.
본 출원에서는 일 예로, 야생형 스키조키트리움 속 CD01-5000 균주에 감마선을 조사하여 돌연변이를 발생시키고, 상기 돌연변이 균주 중 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA) 함량이 높은 동시에 팔미트산(PA) 함량이 낮은 균주를 선별하여, 이를 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD02-8025로 명명하였고, 2022년 12월 15일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁 기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC15246BP를 부여받았다.
따라서, 본 명세서에 있어서, 상기 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류는 기탁번호가 KCTC15246BP로 기탁된 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD02-8025 균주일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주는 고함량의 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산을 생산 및/또는 포함할 수 있다.
상기 오메가-3 불포화 지방산은 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및/또는 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 오메가-6 불포화 지방산은 아라키돈산(arachidonic acid: ARA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주는 공지의 스키조키트리움 속 균주 대비 포화 지방산을 적게 생산하는 것일 수 있다.
상기 포화 지방산은 팔미트산(palmitic acid: PA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 공지의 스키조키트리움 속 균주는 야생형 스키조키트리움 속 균주일 수 있고, 일 구현 예에서 스키조키트리움 속 CD01-5000 균주일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA)"은 C22H32O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, 알파-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)과 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 관용명은 세르본산(cervonic acid)이고, 약칭으로 C22:6 n-3으로도 표기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)"은 C20H30O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, ALA 및 DHA와 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 약칭으로 C20:5 n-3으로도 표기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “팔미트산(palmitic acid: PA)”은 C16H32O2의 화학식을 갖는 포화지방산 중 하나를 의미하며, 약칭으로 C16:0으로도 표기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “아라키돈산(arachidonic acid: ARA)”은 C20H32O2의 화학식을 갖는 불포화지방산 중 하나를 의미하며, 약칭으로 C20:4n6 또는 C20:4로 표기될 수 있다.
상기 신규한 스키조키트리움 속 균주는 아라키돈산을 포함하고, 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)을 고농도로 포함하는 바이오오일을 생산할 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 50 중량% 이상, 55 중량% 이상, 또는 57 중량% 이상의 도코사헥사엔산(DHA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 35 내지 70 중량%, 35 내지 65 중량%, 35 내지 60 중량%, 35 내지 59 중량%, 35 내지 58 중량%, 40 내지 70 중량%, 40 내지 65 중량%, 40 내지 60 중량%, 40 내지 59 중량%, 40 내지 58 중량%, 45 내지 70 중량%, 45 내지 65 중량%, 45 내지 60 중량%, 45 내지 59 중량%, 45 내지 58 중량%, 50 내지 70 중량%, 50 내지 65 중량%, 50 내지 60 중량%, 50 내지 59 중량%, 50 내지 58 중량%, 53 내지 70 중량%, 53 내지 65 중량%, 53 내지 60 중량%, 53 내지 59 중량%, 53 내지 58 중량%, 55 내지 70 중량%, 55 내지 65 중량%, 55 내지 60 중량%, 55 내지 59 중량%, 55 내지 58 중량%, 또는 56 내지 58 중량%의 도코사헥사엔산(DHA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 0.8 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 2 중량% 이상, 2.5 중량% 이상, 2.6 중량% 이상, 2.7 중량% 이상, 또는 2.8 중량% 이상의 에이코사펜타엔산(EPA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 0.5 내지 10 중량%, 0.5 내지 9 중량%, 0.5 내지 8 중량%, 0.5 내지 7 중량%, 0.5 내지 6 중량%, 0.5 내지 5 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 9 중량%, 1 내지 8 중량%, 1 내지 7 중량%, 1 내지 6 중량%, 1 내지 5 중량%, 1.5 내지 10 중량%, 1.5 내지 9 중량%, 1.5 내지 8 중량%, 1.5 내지 7 중량%, 1.5 내지 6 중량%, 1.5 내지 5 중량%, 2 내지 10 중량%, 2 내지 9 중량%, 2 내지 8 중량%, 2 내지 7 중량%, 2 내지 6 중량%, 2 내지 5 중량%, 2.5 내지 10 중량%, 2.5 내지 9 중량%, 2.5 내지 8 중량%, 2.5 내지 7 중량%, 2.5 내지 6 중량%, 또는 2.5 내지 5 중량%의 에이코사펜타엔산(EPA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 19 중량% 이하, 18 중량% 이하, 17 중량% 이하, 또는 16 중량% 이하의 팔미트산(PA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%, 0.1 내지 29 중량%, 0.1 내지 25 중량%, 0.1 내지 20 중량%, 0.1 내지 19 중량%, 0.1 내지 18 중량%, 0.1 내지 17 중량%, 0.1 내지 16 중량%, 1 내지 30 중량%, 1 내지 29 중량%, 1 내지 25 중량%, 1 내지 20 중량%, 1 내지 19 중량%, 1 내지 18 중량%, 1 내지 17 중량%, 1 내지 16 중량%, 5 내지 30 중량%, 5 내지 29 중량%, 5 내지 25 중량%, 5 내지 20 중량%, 5 내지 19 중량%, 5 내지 18 중량%, 5 내지 17 중량%, 5 내지 16 중량%, 10 내지 30 중량%, 10 내지 29 중량%, 10 내지 25 중량%, 10 내지 20 중량%, 10 내지 19 중량%, 10 내지 18 중량%, 10 내지 17 중량%, 또는 10 내지 16 중량%의 팔미트산(PA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1 중량% 이상, 또는 1.1 중량% 이상의 아라키돈산(ARA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%, 0.001 내지 5 중량%, 0.001 내지 4 중량%, 0.001 내지 3 중량%, 0.001 내지 2 중량%, 0.001 내지 1.5 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 4 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.01 내지 2 중량%, 0.01 내지 1.5 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 0.1 내지 4 중량%, 0.1 내지 3 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.1 내지 1.5 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%, 0.5 내지 4 중량%, 0.5 내지 3 중량%, 0.5 내지 2 중량%, 0.5 내지 1.5 중량%, 0.7 내지 10 중량%, 0.7 내지 5 중량%, 0.7 내지 4 중량%, 0.7 내지 3 중량%, 0.7 내지 2 중량%, 0.7 내지 1.5 중량%, 0.7 내지 1.3 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 5 중량%, 1 내지 4 중량%, 1 내지 3 중량%, 1 내지 2 중량%, 또는 1 내지 1.5 중량%의 아라키돈산(ARA)을 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 스키조키트리움 속 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는, 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일을 제공을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 균주에 대한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오매스(biomass)"는 화학적 에너지로 사용 가능한 식물, 동물, 미생물 등의 생물체, 즉 바이오에너지의 에너지원을 의미하며, 생태학적으로 단위 시간 및 공간 내에 존재하는 특정 생물체의 중량 또는 에너지량을 의미하기도 한다. 또한, 상기 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 세포 외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유하는 것일 수 있다. 본 출원에서 상기 바이오매스는 스키조키트리움 속 균주(미세조류) 그 자체, 이의 배양물, 이의 건조물, 이의 파쇄물, 또는 상기 균주를 배양하거나 발효하여 생산된 산물일 수 있으며, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 균주의 "배양물"은 상기 균주를 배양하여 생성된 산물을 지칭하는 것으로, 구체적으로 균주를 포함하는 배양액 또는 상기 배양액에서 균주가 제거된 배양여액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 균주 배양물의 "건조물"은 상기 균주 배양물에서 수분이 제거된 것으로, 예를 들어 상기 균주의 건조 균체 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 건조물의 "파쇄물"은 상기 균주 배양물에서 수분이 제거된 건조물을 파쇄한 결과물을 총칭하는 것으로, 예를 들어 건조 균체 분말일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스키조키트리움 속 균주의 배양물은 균주의 배양 배지에 상기 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 배양 방법에 따라 제조될 수 있고, 상기 배양물의 건조물 및 이의 파쇄물 역시 당업계에 공지된 균주(미세조류) 또는 배양액의 처리 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오오일(bio-oil)"은 생물학적, 열화학 그리고 물리화학 추출공정에 의해 바이오매스로부터 얻어지는 오일을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 바이오오일은 바이오매스의 추출물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오오일 추출물을 제조하는 방법으로, 세포막 또는 세포벽 성분을 파쇄 또는 용해시키는 방법에 따라 프로테아제, 셀룰라아제, 펙티나아제 또는 키티나아제 등의 효소를 활용하는 방법, 호모게나이저, 초음파 분쇄기, 비드 처리 등을 이용하여 물리적으로 세포막 또는 세포벽 성분을 파쇄하는 방법, 용매를 직접 첨가하여 세포 내 투과하여 추출하는 방법, 다양한 파쇄 공정 후에 원심분리 과정을 통해 분리하는 무용매 추출 공정 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제조된 바이오매스 또는 바이오오일은 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산을 함유하는 것일 수 있고, 구체적으로, 상기 오메가-3 불포화 지방산은 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 및 팔미트산(PA)으로 이루어진 군에서 선태고디는 어느 하나 이상인 것일 수 있고, 상기 오메가-6 불포화 지방산은 아라키돈산(ARA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일은 지방산 총 중량을 기준으로 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 50 중량% 이상, 55 중량% 이상, 또는 57 중량% 이상의 도코사헥사엔산(DHA)을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스는 지방산 총 중량을 기준으로 35 내지 70 중량%, 35 내지 65 중량%, 35 내지 60 중량%, 35 내지 59 중량%, 35 내지 58 중량%, 40 내지 70 중량%, 40 내지 65 중량%, 40 내지 60 중량%, 40 내지 59 중량%, 40 내지 58 중량%, 45 내지 70 중량%, 45 내지 65 중량%, 45 내지 60 중량%, 45 내지 59 중량%, 45 내지 58 중량%, 50 내지 70 중량%, 50 내지 65 중량%, 50 내지 60 중량%, 50 내지 59 중량%, 50 내지 58 중량%, 53 내지 70 중량%, 53 내지 65 중량%, 53 내지 60 중량%, 53 내지 59 중량%, 53 내지 58 중량%, 55 내지 70 중량%, 55 내지 65 중량%, 55 내지 60 중량%, 55 내지 59 중량%, 55 내지 58 중량%, 또는 56 내지 58 중량%의 도코사헥사엔산(DHA)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일은 지방산 총 중량을 기준으로 0.8 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 2 중량% 이상, 2.5 중량% 이상, 2.6 중량% 이상, 2.7 중량% 이상, 또는 2.8 중량% 이상의 에이코사펜타엔산(EPA)을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일은 지방산 총 중량을 기준으로 0.5 내지 10 중량%, 0.5 내지 9 중량%, 0.5 내지 8 중량%, 0.5 내지 7 중량%, 0.5 내지 6 중량%, 0.5 내지 5 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 9 중량%, 1 내지 8 중량%, 1 내지 7 중량%, 1 내지 6 중량%, 1 내지 5 중량%, 1.5 내지 10 중량%, 1.5 내지 9 중량%, 1.5 내지 8 중량%, 1.5 내지 7 중량%, 1.5 내지 6 중량%, 1.5 내지 5 중량%, 2 내지 10 중량%, 2 내지 9 중량%, 2 내지 8 중량%, 2 내지 7 중량%, 2 내지 6 중량%, 2 내지 5 중량%, 2.5 내지 10 중량%, 2.5 내지 9 중량%, 2.5 내지 8 중량%, 2.5 내지 7 중량%, 2.5 내지 6 중량%, 또는 2.5 내지 5 중량%의 에이코사펜타엔산(EPA)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일은 지방산 총 중량을 기준으로 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 19 중량% 이하, 18 중량% 이하, 17 중량% 이하, 또는 16 중량% 이하의 팔미트산(PA)을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일은 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%, 0.1 내지 29 중량%, 0.1 내지 25 중량%, 0.1 내지 20 중량%, 0.1 내지 19 중량%, 0.1 내지 18 중량%, 0.1 내지 17 중량%, 0.1 내지 16 중량%, 1 내지 30 중량%, 1 내지 29 중량%, 1 내지 25 중량%, 1 내지 20 중량%, 1 내지 19 중량%, 1 내지 18 중량%, 1 내지 17 중량%, 1 내지 16 중량%, 5 내지 30 중량%, 5 내지 29 중량%, 5 내지 25 중량%, 5 내지 20 중량%, 5 내지 19 중량%, 5 내지 18 중량%, 5 내지 17 중량%, 5 내지 16 중량%, 10 내지 30 중량%, 10 내지 29 중량%, 10 내지 25 중량%, 10 내지 20 중량%, 10 내지 19 중량%, 10 내지 18 중량%, 10 내지 17 중량%, 또는 10 내지 16 중량%의 팔미트산(PA)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일은 지방산 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1 중량% 이상, 또는 1.1 중량% 이상의 아라키돈산(ARA)을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 또는 바이오오일은 지방산 총 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%, 0.001 내지 5 중량%, 0.001 내지 4 중량%, 0.001 내지 3 중량%, 0.001 내지 2 중량%, 0.001 내지 1.5 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 4 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.01 내지 2 중량%, 0.01 내지 1.5 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 0.1 내지 4 중량%, 0.1 내지 3 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.1 내지 1.5 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 0.5 내지 5 중량%, 0.5 내지 4 중량%, 0.5 내지 3 중량%, 0.5 내지 2 중량%, 0.5 내지 1.5 중량%, 0.7 내지 10 중량%, 0.7 내지 5 중량%, 0.7 내지 4 중량%, 0.7 내지 3 중량%, 0.7 내지 2 중량%, 0.7 내지 1.5 중량%, 0.7 내지 1.3 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 5 중량%, 1 내지 4 중량%, 1 내지 3 중량%, 1 내지 2 중량%, 또는 1 내지 1.5 중량%의 아라키돈산(ARA)을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD02-8025 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스, 바이오오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주, 바이오매스, 바이오오일, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물에 대한 것은 상술한 바와 같다.
상기 조성물은 용액, 분말, 또는 현탁액 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 예를 들어, 식품 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 조성물"은 동물에게 급여되는 먹이를 지칭한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는 필요한 영양성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하며, 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 출원의 조성물은 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 조성물을 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
본 출원의 조성물은, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 동결보호제, 또는 부형제 등을 함유할 수 있다. 상기 동결보호제는, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 또한, 상기 동결보호제는 상기 조성물이 건조된 상태일 때 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 포유류, 조류, 어류, 갑각류, 두족류, 파충류 및 양서류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 포유류는 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 또는 애완 동물 등을 포함할 수 있고, 상기 조류는 가금류를 포함할 수 있고, 상기 가금류는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 또는 메추라기 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 어류는 상업적 축양 어류 및 이의 치어류, 관상어 등을 포함할 수 있고, 상기 갑각류는 새우, 따개비 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 동물성 플랑크톤인 로티퍼(rotifer)의 식이에도 적용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD02-8025 균주를 배양하는 단계; 및 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 제조방법을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 균주, 바이오매스, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "배양"은 상기 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 스키조키트리움 속 균주의 배양은 종속영양 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "종속영양"은 에너지원 또는 영양원을 체외에서 얻어낸 유기물에 의존하는 영양 방식으로, 독립영양에 대응되는 용어이며, 용어 '암배양'과 혼용될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 균주를 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본 출원 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미세조류의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양온도는 20 내지 45℃ 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 균주를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 만노스, 수크로스, 아라비노스, 자일로스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 미세조류를 배양하는데 사용되는 탄소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 균주를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아 및 MSG(Monosodium glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원일 수 있으나, 미세조류를 배양하는데 사용되는 질소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 균주를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에, 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 포함하거나 또는 혼합하여 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 바이오매스를 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD02-8025 균주를 배양하는 단계; 및 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 지질을 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오오일 제조방법을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 균주, 바이오오일, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물, 상기 균주를 배양하는 단계는 상술한 바와 같다.
상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 지질을 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 지질을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있다.
예를 들면, 지방 알데하이드, 지방 알콜 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출할 수 있다. 지질 및 지질 유도체는 또한 액화, 오일 액화 및 초임계 CO2 추출 등 방법을 사용하여 추출할 수 있다. 또한, 공지된 미세조류 지질 회수 방법은 예를 들어, i) 원심분리에 의해 세포를 수거하고 증류수로 세척한 후, 동결 건조에 의해 건조시키고, ii) 수득한 세포 분말을 분쇄한 후, n-헥산으로 지질을 추출하는 방법이 있다(Miao, X and Wu, Q, Biosource Technology (2006) 97:841-846).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 팔미트산 또는 아라키돈산 제조용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산 생산능을 가지는 신규한 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 균주가 생산한 바이오오일은 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산의 불포화 지방산 함량이 높고, 포화 지방산인 팔미트산 함량이 낮아 유동성이 높다는 장점이 있어 보관 및 사용에 용이한 바, 상기 균주 자체, 또는 균주의 배양 및 발효에 의해 생산되는 바이오매스, 이의 농축물 및 추출물은 사료용 조성물 또는 식품용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 상기 균주가 생산한 바이오오일은 신경계 발달에 중요한 역할을 하는 필수 영양소인 아라키돈산을 포함하고 있어 사료용 조성물 또는 식품용 조성물로서의 장점이 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신규한 스키조키트리움 미세조류 인공돌연변이 균주의 개발
순수 분리된 야생형 Schizochytrium sp. CD01-5000 균주 (기탁번호: KCTC 14344BP) (대한민국 공개 특허 제10-2022-0080594호)로부터 하기와 같은 방법으로 감마선 조사에 따른 인공 돌연변이 균주를 개발하였다.
구체적으로, 순수 분리된 Schizochytrium sp. CD01-5000 균주 (기탁번호: KCTC 14344BP)를 글루코오스 30 g/L를 포함하는 modified-GYEP (글루코오스 10 g/L, 효모 추출물(yeast extract) 1 g/L, 펩톤(peptone) 1 g/L, MgSO4·7H2O 2 g/L, H3BO3 5.0 mg/L, MnCl2 3.0 mg/L, CuSO4 0.2 mg/L, NaMo4·2H2O 0.05 mg/L, CoSO4 0.05 mg/L, ZnSO4·7H2O 0.7 mg/L) 배지에 약 24시간 이상 배양하여 초기 대수기(Early exponential phase)단계에 이르도록 한 후, 배양액 샘플을 원심분리하여 균체를 수확하였다. 수확된 균체는 세포수가 약 109 cells/mL이 되도록 NaCl 1.0%를 포함하는 0.1M Phosphate Buffer Solution에 현탁하여 감마선 조사에 활용되었다.
감마선 조사 실험은 한국원자력 연구원 첨단방사선연구소에서 진행하였으며, 5.5 kGY 선량의 감마선을 조사하였다. 감마선이 조사된 미세조류 배양액 샘플은 암실에서 O/N동안 Recovery과정을 거친 후, 한천 (Agar) 20 g/L와 지방산 합성을 저해하는 옥틸갈레이트 (Octyl gallate)을 포함한 GYEP 배지에 도말하여 배양하였다. 약 2주간이 배양육 생육되는 미세조류 콜로니를 선별하여 동일한 배지 및 배양 환경 조건에서 계대를 진행하였다. 계대 간 지속적으로 성장이 가능하고 콜로니 생육이 우수한 균주를 우선적으로 진행하였다. 또한, 형태적으로 붉은색을 띄며 빠르게 성장하는 콜로니를 선별하였다. 선별한 콜로니는 단일 세포주로 순수 분리 배양하였고, 해당 균주는 CD02-8025 로 명명하고, 2022년 12월 15일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁 기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC15246BP를 부여받았다.
실시예 2. 돌연변이 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주의 배양 특성 확인
실시예 2-1. CD02-8025 균주의 예비 배양액의 조지방 및 지방산 함량 분석
상기 실시예 1에서 선별한 돌연변이 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주의 배양 특성을 확인하기 위하여 발효 배양 평가하였다.
구체적으로, 30 L scale의 본 배양에 앞서 야생형 균주 대비 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주의 조지방 및 지방산 함량을 확인하기 위해, 250 ml 플라스크에 Working volume 50 ml 및 30 g/L의 글루코오스를 포함하는 GYEP 배지에 접종하여 진탕 인큐베이터(Shaking incubator)에서 30℃, 180 rpm으로 약 48시간 배양하였다. 예비 배양이 완료된 배양액을 수분 함량이 5 ~ 8%가 되도록 건조한 후 조지방 및 지방산 함량을 분석하여 하기의 표 1에 나타내었다.
신규한 CD02-8025 돌연변이 균주의 플라스크 레벨 배양액의 조지방 및 지방산 분석 결과
균주 명칭 샘플 조지방 함량(%) 조지방 중 지방산 함량(%)
C16:0 C20:3n3 EPA DPA DHA 오메가-3
CD02-8025 1 16.75 12.85 0.45 4.61 14.32 52.13 56.74
2 18.67 12.64 0.50 5.61 12.54 42.91 48.52
3 17.42 13.96 0.52 5.04 13.30 44.53 49.57
4 15.33 15.47 0.24 3.54 12.08 38.92 42.45
5 14.86 15.26 0.22 3.33 11.70 37.81 41.14
6 15.16 18.92 0.19 2.55 11.73 42.87 45.41
7 15.75 18.07 0.23 3.39 11.68 42.31 45.70
8 10.88 16.97 0.23 3.88 13.37 42.06 45.94
9 13.86 16.39 0.21 3.71 12.62 40.99 44.70
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주의 플라스크 레벨 배양액은 오메가-3 함량이 높았으며, 특히, 도코사헥사엔산(DHA)와 에이코사펜타엔산(EPA)의 함량이 높음을 확인하였다.
실시예 2-2. CD02-8025 돌연변이 균주와 야생형 CD01-5000 균주의 배양액 샘플의 조지방 및 지방산 함량 분석
실시예 2-1에서 오메가-3 함량이 높음을 확인한 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주는 동일한 조건의 배지를 포함한 30 L 발효조에 접종하여 총 Working volume 20 L에서 발효 배양하였다. 30℃, 500 rpm, 0.5-1 vvm, pH 5-7 조건에서 Working volume의 20%에 해당하는 글루코오스를 연속 투입하여 세포 배양에 활용하고, 이때의 글루코오스 농도는 20 g/L 수준에서 유지되도록 주입하였다. 공급한 탄소원인 글루코오스가 모두 소모되면 배양을 종료하였다. 배양이 끝난 발효액은 동결 건조기를 활용하여 수분 함량이 약 5 ~ 8%가 되도록 건조하였으며, 획득된 건조 균체는 조지방 및 지방산 함량 분석에 활용하였다.
야생형 스키조키트리움 속 CD01-5000 균주 및 돌연변이 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주의 세포 내의 지질 및 다중불포화지방산 함량을 분석하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 수득한 각각의 건조된 미세조류 균체 2 g에 8.3 M 염산 용액을 가하여 80℃에서 미세조류 균체의 세포벽을 가수분해한 후, 에틸 에테르(ethyl ether) 30 mL 및 석유 에테르(petroleum ether) 20 mL을 첨가하고 30초간 섞어준 후, 원심분리하는 과정을 3회 이상 반복하였다. 분리된 용매 층을 회수하여, 미리 무게를 측정해 둔 round-flask에 옮긴 뒤 질소를 주입하여 용매를 제거하고 데시게이터에서 냉각 항량하였다. 건조된 오일의 무게를 측정하여, 전체 오일 함량을 산출하였다. 오일 중에 포함된 DHA 함량은 메탄올성 0.5 N NaOH 및 14% 트리플루오로보란메탄올(BF3)을 통해 전처리하여 기체크로마토그래피법으로 측정하였다. 측정된 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
전체 오일 함량 (%, * 오일 g/건조균체량 g X 100)
* 오일 g: 산 가수분해 및 용매 제거 후 플라스크 무게 - 공 플라스크 무게
신규한 CD02-8025 균주와 야생형 CD01-5000 균주의 배양 평가 및 조지방 분석 결과
　 Schizochytrium sp. CD01-5000 Schizochytrium sp. CD02-8025
배양시간 (hr) 36 53.6
O.D (680nm) 158.4 163
DCW (g/L) 115.1 104.1
바이오매스 중 조지방량 (%) 46.2 34.6
조지방 중 지방산 (%) 　
- C16:0 30.3 16
- C20:5 n-3 1 4.3
- C22:6 n-3 50.3 57.1
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 야생형 CD01-5000 균주와 돌연변이 CD02-8025 균주는 약 100 - 120 g/L 수준의 바이오매스를 생산하였다. 특히, CD02-8025 균주가 생산한 바이오매스는 조지방 중 팔미트산(C16:0)의 함량이 16%로 나타나, 야생형 균주 대비 약 47.2% 감소된 함량을 포함함을 확인하였다. 또한, 야생형 균주 유래 바이오매스 대비 EPA(C20:5 n-3) 함량은 430% 이상, DHA(C22:6 n-3)의 함량은 13.5% 이상 높은 함량의 오메가-3 성분을 포함함을 확인하였다.
실시예 3. CD02-8025 돌연변이 균주와 야생형 CD01-5000 균주의 오일 추출물의 조지방 및 지방산 함량 분석
야생형 CD01-5000 균주와 본 발명의 돌연변이 CD02-8025 균주의 오일 추출물을 제조한 후, 조지방 및 지방산 함량을 하기와 같은 방법을 분석하였다.
구체적으로, 돌연변이 균주 CD02-8025 균주와 야생형 CD01-5000 균주를 5 L Scale 발효 배양을 진행하였다. 5 L Scale의 본 배양은 30℃, 800 rpm, 1 vvm 조건에서 수행되었으며, 탄소원으로 글루코오스를 유가 배양(Fed-batch) 방식으로 공급하였다. 배양 후의 균체는 수확하여 오일 추출을 통하여 두 균주에 대하여 37종 FAME 지방산 분석을 진행하여 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
돌연변이 CD02-8025 균주와 야생형 CD01-5000 균주 오일 추출물에 대한 지방산 함량 비교
지방산 종류 Schizochytrium sp. CD01-5000 Schizochytrium sp. CD02-8025
지방산 함량(%) 지방산 함량(%)
C14:0 1.61 N.D.
C16:0 29.29 14.64
C18:0 1.04 0.86
C20:0 0.31 0.49
C20:3n6 0.32 N.D.
C20:3n3 1.25 0.60
C20:4 N.D. 1.10
C22:2 0.54 0.76
C20:5 0.79 2.90
C22:6 50.13 57.08
각 균주의 오일 추출물 지방산 조성 비교 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 건조 바이오매스 조지방 분석 결과와 유사한 경향을 보임을 확인하였다. 즉, 오일 추출물의 경우에도, 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주 오일 추출물의 팔미트산(C16:0)의 함량이 야생형 균주 오일 추출물 대비 낮았으며, EPA(C20:5 n-3)와 DHA(C22:6 n-3)의 함량이 야생형 균주 오일 추출물 대비 높게 나타났다. 팔미트산 함량이 높으면 상온에서 고형화되고, 팔미트산 함량이 낮을수록 오일의 형태로 남아있게 되는 것으로 알려져 있어 팔미트산의 함량이 낮을수록 오일 추출 시 오일의 유동성도 함께 상승하여 보관 및 사용에 용이하다.
따라서, 상기 결과를 통해 본 발명의 신규한 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주는 유동성이 높은 바이오오일을 생산할 수 있으며, 생산된 바이오오일은 낮은 팔미트산 함량에 의해 보관 및 사용에 용이하다는 장점이 있음을 알 수 있다.
또한, 돌연변이 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주와 야생형 스키조키트리움 속 CD01-5000 균주의 오일 추출물 중 아라키돈산 함량을 비교한 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 야생형 CD01-5000 균주 오일 추출물에는 함유되지 않은 아라키돈산(C20:4)이 돌연변이 CD02-8025 균주 오일 추출물에는 1.1% 함유되어 있음을 확인하였다.
아라키돈산은 신경계 발달에 중요한 역할을 하는 필수 영양소로 알려져 있으므로, 이를 통해 본 발명의 신규한 스키조키트리움 속 CD02-8025 균주는 신경계 발달에 필요한 필수 영양소인 아라키돈산을 함유하여 식품 또는 사료 조성물로서의 장점이 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁번호]
기탁기관명: 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)
수탁번호: KCTC15246BP
수탁일자: 20221215
Figure PCTKR2023020467-appb-img-000001

Claims (15)

  1. 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산 생산능을 가지는, 기탁번호가 KCTC15246BP로 기탁된 미세조류인 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD02-8025 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 오메가-3 불포화 지방산은 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)인 것인, 스키조키트리움 속 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 오메가-6 불포화 지방산은 아라키돈산(arachidonic acid: ARA)인 것인, 스키조키트리움 속 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 35 내지 70 중량%의 도코사헥사엔산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 0.5 내지 10 중량%의 에이코사펜타엔산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 균주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 10 내지 20 중량%의 팔미트산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 균주.
  7. 제1항에 있어서, 상기 균주는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 5 중량%의 아라키돈산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는, 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스.
  9. 제8항에 있어서, 상기 바이오매스는 아라키돈산을 포함하는 것인, 바이오매스.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이오매스는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 5 중량%의 아라키돈산을 포함하는 것인, 바이오매스.
  11. 제8항에 있어서, 상기 바이오매스는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 20 중량%의 팔미트산을 포함하는 것인, 바이오매스.
  12. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는 사료용 조성물.
  13. 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는 식품용 조성물.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계; 및
    상기 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계; 를 포함하는, 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오매스 제조방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계; 및
    상기 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 지질을 회수하는 단계; 를 포함하는, 스키조키트리움 속 균주 유래 바이오오일 제조방법.
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