KR20200017665A

KR20200017665A - 유산균 발효여과액을 이용한 유산균의 배양방법 및 재순환 연속 배양 방법

Info

Publication number: KR20200017665A
Application number: KR1020180092828A
Authority: KR
Inventors: 권오훈; 강향숙; 윤선민
Original assignee: 주식회사 바이오젠
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2020-02-19

Abstract

본 발명은 유산균 발효여과액을 이용한 유산균 배양방법 및 재순환 연속 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 사용 시 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)의 유산균을 연속적으로 재배양할 수 있으며, 상기 유산균을 적은 비용으로 대량 생산할 수 있도록 최적의 배양배지 및 최적 발효 조건을 규명하였다.
또한, 상기 방법으로 제조된 유산균 발효 여과액은 인간을 비롯한 동물에게 유익한 유익균이 많이 들어 있어 이를 건강기능식품 또는 사료 첨가제 등의 소재로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

유산균 발효여과액을 이용한 유산균의 배양방법 및 재순환 연속 배양 방법{Method for fermentation and continuous recycle culture using lactic-acid fermented filtrate}

본 발명은 유산균 발효여과액을 이용한 유산균 배양 및 재순환 연속 배양 방법에 관한 것이다.

유산균(lactic acid bacteria)은 기원전부터 인간이 이용하여 온 식품의 일종으로 영양적 가치뿐만 아니라 여러가지 생리적인 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 장(腸)내의 상피세포에 부착하여 병원균 증식을 억제하고, 면역세포로 하여금 면역 능력을 조절하는 물질을 생성시키며, 병원균과 경합하여 병원균의 증식을 억제하고, 이차적으로는 항생제 치료나 외부환경 변화에 대해 장내 세균총의 항상성을 유지하게 하는 것으로 보고되어 있다.

그러나 이러한 유산균은 당질을 발효해 젖산(lactic acid)을 생성하는 세균으로서, 영양 요구성이 매우 까다롭고 각종 영양소를 배합하여 만든 인공 배지로 배양하여도 극미량의 한 가지 영양소만 결핍되어도 잘 자라지 않는다. 또한, 시판중인 젖산균 전용 배양 배지는 고가이어서 좀 더 저렴한 비용으로 제조가 가능하고, 균체의 회수가 용이할 뿐만 아니라 유산균 활성이 높은 균체를 얻을 수 있는 경제적으로 유리한 배양 배지가 필요하다.

한편, 유산균 생산 방법에는 화학적 합성과 미생물 발효법이 있으며 화학적 합성에 비해 에너지 소비가 적고 값싼 기질의 사용이 가능한 미생물 발효방법이 선호되고 있으며, 전 세계 생산량의 90%가 미생물 발효에 의해 생산되고 있다.

미생물 발효법은 크게 회분식 발효법(Batch 발효법), 유가 발효법(Fed-Batch 발효법) 및 연속 발효법으로 분류할 수 있다. 회분식 발효법 및 유가 발효법은 설비가 간단하고, 단시간에 배양이 종료되기 때문에 잡균 오염에 의한 피해가 적은 이점이 있다. 그렇지만, 시간의 경과와 함께 배양액 중의 생산물 농도가 높아지면 생산성 및 수율이 저하되는 문제점이 있다. 따라서 회분식 생산은 장시간에 걸쳐 고수율 생산이 어려움은 물론 유산생산속도가 낮기 때문에 결과적으로 높은 에너지 소비가 필요한 단점이 있다.

연속 발효법은 발효조 안에서 목적 물질이 고농도로 축적되는 것을 방지하여 장기간에 걸쳐 고수율, 고생산성을 유지할 수 있는 이점이 있지만, 연속 발효법에 의한 배양을 장기간 안정하게 지속시키는 것은 매우 곤란하여 연구가 거듭되고 있으나 아직까지 그 연구가 미미한 실정이다.

따라서 본 발명 기술을 이용하여 유산균 배양 및 재순환 연속 배양법을 통해 유산균을 장기간 안정하게 지속적으로 배양하고자 한다.

한국등록특허 제0818360호 한국공개특허 제1995-0003441호

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 배양하여 이를 여과하고, 여과 후 상기 유산균이 함유된 상등액(유산균 발효 여과액)은 회수하고, 남은 고형분은 배양액에 유지 또는 환류(recycle)하여 유산균을 연속 발효하는 방법을 규명하였다는 점에 기술적 특징이 있다.

따라서, 본 발명은 (a) 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 배지에서 배양하는 단계;(b) 상기에서 수득한 배양액을 여과하는 단계; 및 (c) 여과 후 상기 유산균이 함유된 상등액은 회수하고, 남은 고형분은 배양액에 유지 또는 환류(recycle)하여 연속 발효하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균의 발효 여과액을 제공하는데 그 목적이 있다.

나아가 본 발명의 목적은 상기 발효여과액을 유효성분으로 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 배지에서 배양하는 단계;(b) 상기에서 수득한 배양액을 여과하는 단계; 및 (c) 여과 후 상기 유산균이 함유된 상등액은 회수하고, 남은 고형분은 배양액에 유지 또는 환류(recycle)하여 연속 발효하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a)단계의 배지는 미강 3 ~ 7g/L, 글루코스 7 ~ 13g/L, 아스코르브산 0.5 ~ 1.5g/L의 농도로 구성될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균의 발효는 5L 발효기에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)의 접종농도는 2.5%일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효는 교반속도 150 ~ 250rpm, 온도 27 ~ 33℃에서 16 ~ 30시간 동안 배양할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효는 발효를 종료하기 전 18 ~ 24시간에 pH를 6.0으로 조정할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조된 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균의 발효 여과액을 제공한다.

나아가 본 발명은 상기 발효여과액을 유효성분으로 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법을 사용 시 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)의 유산균을 연속적으로 배양할 수 있으며, 상기 유산균을 적은 비용으로 대량 생산할 수 있도록 최적의 배양배지 및 최적 발효 조건을 규명하였다.

또한, 상기 방법으로 제조된 유산균 발효 여과액은 인간을 비롯한 동물에게 유익한 유익균이 많이 들어 있어 이를 건강기능식품 또는 사료 첨가제 등의 소재로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 산업용 배지를 이용한 (A) L. plantarum과 (B) L. thermophilus의 성장을 비교한 결과이다.
도 2는 (A) L. plantarum과 (B) L. thermophilus를 대상으로 산업배지 글루코스 조건을 확립한 결과이다.
도 3은 (A) L. plantarum과 (B) L. thermophilus를 대상으로 산업배지 미강 첨가 조건을 확립한 결과이다.
도 4는 (A) L. plantarum과 (B) L. thermophilus를 대상으로 산업배지 아스코르브산 첨가 조건을 확립한 결과이다.
도 5는 본 발명의 산업배지와 기존 유산균 기본 배지로 많이 사용되던 MRS 배지를 이용하여 배양된 유산균의 균체 성장을 비교한 결과이다.
도 6은 유산균 접종 농도에 따른 성장을 비교한 결과이다.
도 7은 HPLC를 이용하여 유산균을 분석한 결과이다.
도 8은 5L 발효기를 이용하여 L. plantarum 유산균을 발효한 결과이다.
도 9는 5L 발효기를 이용하여 L. plantarum 유산균을 pH를 조절하지 않고 발효한 결과이다.
도 10은 5L 발효기를 이용하여 L. plantarum 유산균을 pH 5.0에 고정하고 발효한 결과이다.
도 11은 5L 발효기를 이용하여 L. plantarum 유산균을 pH 5.5에 고정하고 발효한 결과이다.
도 12는 5L 발효기를 이용하여 L. plantarum 유산균을 pH 6.0에 고정하고 발효한 결과이다.
도 13은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)의 유산균의 재순환 연속 배양 공정을 나타낸 모식도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 다양한 유산균 중 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)의 유산균을 최적으로 배양할 수 있는 방법을 제공하는 것으로서, 각각의 미생물마다 최적으로 배양, 발효할 수 있는 특징적인 조건들이 다르다.

본 발명은 (a) 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 배지에서 배양하는 단계;(b) 상기에서 수득한 배양액을 여과하는 단계; 및 (c) 여과 후 상기 유산균이 함유된 상등액은 회수하고, 남은 고형분은 배양액에 유지 또는 환류(recycle)하여 연속 발효하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 연속 발효하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 (a)단계의 배지는 미강 3 ~ 7g/L, 글루코스 7 ~ 13g/L, 아스코르브산 0.5 ~ 1.5g/L의 농도로 구성할 수 있다.

본 발명에서 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균의 발효는 5L 발효기에서 수행하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 실험에서는 5L 발효기에 적합한조건을 규명하였으며, 발효기의 크기가 커지거나 작아지면 배지의 농도가 조금씩 차이가 있을 수 있다.

또한, 상기 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)의 접종농도는 2.5%일 수 있다. 접종농도가 이보다 적을 경우 유산균의 발효가 잘 안될 수 있으며, 이보다 많을 경우에는 경제적이지 못한 단점이 있다.

본 발명의 발효는 교반속도 150 ~ 250rpm, 온도 27 ~ 33℃에서 16 ~ 30시간 동안 배양할 수 있으며, pH는 발효를 종료하기 전 18 ~ 24시간에 pH를 6.0으로 조정할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균의 발효 여과액을 제공한다.

상기의 사료 또는 사료 첨가제는 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.

상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 배양추출물의 투여 형태는 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제가 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물 (랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물 (예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물 (예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 애완 동물 (예, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

본 발명에서 사용한 유산균 발효여과액 균수 측정

본 발명에서는 유산균 발효여과액에 사용될 유산균으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)과 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)를 사용하였으며, 상기의 유산균 발효발효여과액을 실온 (25℃)에서 보관하며 세포생사판별시험(cell viability)을 두 달에 한 번씩 측정하였다.

1차 분석을 2017년 1월 20일에 진행한 결과, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)과 락토바실러스 썰모필러스(L. thermophilus) 유산균 발효여과액 유산균 수는 10⁸ CFU/ml 정도로 나타남을 알 수 있었고, pH는 6.5-6.6을 나타내었다.

또한, 2차 분석은 2개월 후인 3월 20일에 진행하였으며, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)과 락토바실러스 썰모필러스(L. thermophilus)의 유산균 발효발효여과액 유산균 수는 10⁵ CFU/ml로 나타나 1차 분석 때보다 감소하였음을 알 수 있었고, pH는 5.9임을 알 수 있었다.

상기 결과를 바탕으로 본 발명에서 사용될 유산균 발효여과액은 여과한 뒤 시간 차를 두지 않고 바로 재사용하는 것이 적절하다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2>

본 발명에서 사용한 유산균 발효여과액의 최적산업배지 조성 확립

먼저 본 발명자들은 기존 유산균 복합배지로 많이 사용되고 있는 Difco^TM Lactobacillus MRS Broth를 대조군으로 하였으며, 본 발명의 유산균 발효여과액의 산업용 배지 연구를 위하여 선행논문과 학술자료를 검토하여 경제성이 있는 산업용 배지 조성을 선택하였으며, 구체적인 내용은 표 2에 나타내었다.

대조군인 MRS 배지와 본 발명의 산업용 배지를 이용하여 유산균 성장에 대한 발효를 확인한 결과, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 경우 대조군인 MRS 배지에서 배양한 것보다 본 발명의 산업용 배지에서 더 높은 균체 성장이 나타나는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 산업용 배지를 이용한 균체 성장에서 가장 높은 균체수는 16시간에 10×10¹⁰ CFU/mL으로 확인되었다(도 1 참조).

락토바실러스 썰모필러스(L. thermophilus)를 이용한 발효 결과, 본 발명의 산업용 배지가 대조군인 MRS 배지보다 효과적으로 유산균 균체 성장이 나타남을 알 수 있었다(도 1 참조).

본 발명의 산업용 배지에서 가장 높은 균체수는 16시간에 1.5×10¹¹ CFU/mL으로 확인되었다. 즉, 유산균 기본 배지인 MRS 배지보다 산업용배지 조성이 유산균 발효여과액을 이용한 재배양에 적절하다는 것을 알 수 있었다. 하지만 유산균 발효 20시간부터 균체의 감소 경향이 나타나는 것으로 보아 산업배지 농도의 최적화 실험이 요구되어, 경제성을 고려한 산업용 배지개발을 수행하였다.

유산균 대량배양을 위한 산업용 배지조성 확립과정으로 glucose(0.5~3.0%), rice bran(0.25~2.0%), ascorbic acid(0.05~0.3%) 등을 이용하여 최적 배지농도 실험을 진행하였다. 도 2에서 나타난 바와 같이 glucose 농도에 따라 배양한 후 CFU 측정을 통해 유산균 성장을 비교하였다.

그 결과, 1% glucose 농도에서 유산균이 약 10¹² CFU/ml으로 가장 높은 균체량을 얻을 수 있어서 glucose농도를 1%로 선택하였다. 한편, 16시간 이후부터 균체량이 감소를 하는 경향은 16시간 때의 발효배지를 pH meter로 측정해 본 결과 유산균발효 pH가 약 3.9 정도로 낮은 pH를 나타남을 알 수 있었다.

락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 경우 최대 성장을 보인 후 생성된 lactic acid에 의한 낮은 pH에서는 cell viability가 떨어지는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 대량생산을 위한 발효시 pH 조절이 필요할 것으로 판단된다.

반면, 락토바실러스 썰모필러스(L. thermophilus)의 경우 유산균 농도가 약 10¹¹ CFU/ml 정도로 나타남을 알 수 있었고 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)에 비해 낮은 pH 환경에서도 cell viability가 높게 유지되는 것을 알 수 있었다. 이후 rice bran과 ascorbic acid 농도는 16시간의 샘플을 기준으로 배지 농도를 확립하였다.

도 3에서 나타난 바와 같이 두 종의 유산균 모두 미강 농도를 0.5%이상 배지에 첨가를 하였을 때 유산균 균체 생성량이 크게 차이가 없는 것으로 보아 0.5%를 미강 농도로 결정하였다.

도 4에서 나타난 바와 같이 두 종의 유산균 모두 ascorbic acid 농도를 0.1% 이상 배지에 첨가를 하였을 때 유산균 균체 생성량이 크게 차이가 없는 것으로 보 아 0.1%를 ascorbic acid 농도로 결정하였다.

따라서 표 3과 같이 실험에 사용된 대조군인 유산균 배지 MRS와 비교하였을 때 대량생산 배지 조성을 간소화된 표 3의 산업용배지의 조성을 확립하였다.

도 5에서 나타난 바와 같이 유산균 배양시 기본 배지인 MRS보다 본 발명의 산업배지를 이용한 유산균 균체량이 더 높은 것을 확인하였다.

락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 균체량이 가장 높은 것을 알 수 있었으나 이후 대량 생산시 pH 조절을 통한 cell viability의 유지가 필요할 것으로 판단된다.

<실시예 3>

유산균 발효여과액과 산업용 배지를 이용한 유산균 발효조건 최적화(5L 발효기)

산업 배지조성을 확립한 후 5L 발효기(한국발효기, 5L-KFC)를 이용하여 발효조건의 최적화 실험을 진행하였다. 접종 농도, 초기 pH, 배양온도, 교반속도 등을 바탕으로 최적 조건을 확립하였다.

<3-1> 유산균 발효여과액 접종 농도 결정

5L 발효기에 유산균 발효여과액 접종 농도를 확인하기 위해 접종 농도 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%의 농도로 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 유산균을 산업배지에 첨가하여 발효를 진행하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이 발효 접종 농도가 높을수록 균체 최대 성장 속도가 빨라졌으며, 접종농도 5-15%에서는 8시간 만에 유산균 농도가 약 10¹² CFU/ml이 되는 것을 확인하였다. 2.5%는 12시간 만에 최대 유산균 생산량이 일어나는 것을 알 수 있었다. 1%는 16시 간에 최대 유산균 생산량이 나타나는 것을 확인하였다. 발효 결과 pH가 3.7 정도로 떨어지면 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 유산균의 cell viability가 점점 감소하는 것이 나타났다.

결과적으로 유산균 성장시간을 고려하였을 때 유산균 발효여과액의 접종 농도로 2.5% 선택하여 이후 5L 발효를 진행 하였다.

<3-2> HPLC를 이용한 유산균 발효과정에서 생성되는 Lactic acid 분석

HPLC를 이용한 유산균 발효과정에서 생성되는 Lactic acid를 분석하기 위하여 먼저 발효 샘플을 1ml 따서 E-tube에 담아 12000rpm의 속도로 10분동안 원심분리하였다. 그 후 상등액을 따서 HPLC vial에 필터링해서 담았으며, PLC (Agilent 1100 Series, Agilent. Inc., Santa Clara, USA)와 RID(refractive index detector)를 이용하며, 컬럼은 Biorad Aminex HPX-87H column (300.0 × 7.8 mm)을 사용하여 온도 65℃, 이동상 5 mM 황산, 유속 0.6 mL/min로 하여 각 시료를 30분간 분석하였다.

또한, 10 g/L 농도로 젖산 stock solution을 만들었으며, 실제 볼륨을 줄여 0.1 g/10ml로 만들었다. 0.625 g/L, 1.25 g/L, 2.5 g/L, 5 g/L, 10 g/L 농도로 lactic acid를 제조하여 HPLC에 injection 후 면적값에 대한 스탠다드 커브를 만들어 분석하였다. 스탠다드로 사용된 시약은 시그마 L(+)-Lactic acid (90%)를 사용하였다.

도 7의 스탠다드를 이용하여 도 6의 1% 유산균 접종 후 16시간에 샘플링한 발효 샘플을 분석한 결과, 약 8.2 g/L의 lactic acid가 나오는 것을 알 수 있었다.

<3-3> 5L 발효기를 이용한 유산균 발효 결과

도 8에서 나타난 바와 같이 5L 발효기를 이용하여 유산균 발효여과액 2.5% 접종, 200 rpm, 30℃, pH control (5.5-5.8)의 발효 조건으로 산업배지를 이용하여 실험을 수행하였다. pH control을 한 이유는 낮은 pH (약 3.7-4.0)에서 유산균의 cell viability가 급격히 감소하기 때문에 높은 cell viability를 지속적으로 유지하기 위해 pH를 조절하였다.

그 결과 아래와 같이 15시간에 glucose를 모두 사용하였고 12 시간 이후에 최대 유산균 생산량을 10^10.5 CFU/ml이 나타내었다. 플라스크에 비해 유산균 최대 생산량이 작은데 이는 production scale이 다르기 때문이라 판단되며, 또한 lactic acid 농도가 1.2 g/L 정도로 낮게 나타나는 것으로 보아 pH 조절에 대한 조건을 검토해야 될 것으로 생각된다.

<실시예 4>

산업용 배지를 이용한 유산균 발효조건 최적화(5L 발효기)

유산균 발효과정 가운데 pH가 낮아질수록 cell viability가 낮아지는 것을 완화시키기 위해 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 유산균 발효를 5L 발효기를 이용하여 pH 5.0, 5.5, 6.0으로 5N NaOH를 사용하여 각각의 pH를 고정하여 발효를 진행하였다. 대조군으로 pH를 조절하지 않고 발효를 진행 하였다.

유산균 발효여과액 2.5% 접종, 교반속도는 200 rpm, working volume은 3L, 배양온도는 30℃ 로 설정하여 발효를 진행하였다.

도 9에서 나타난 바와 같이 pH를 조절하지 않고 발효를 한 결과, 16 시간에 pH가 6.0에서 3.3으로 감소하는 것을 확인하였다. 유산균은 20시간부터 cell viability가 조금씩 감소하는 것으로 보아 24시간 안에 배양을 종료시켜 harvest가 필요할 것으로 판단된다. 글루코스 함량은 12시간에 다 소비되었으며, 24시간 동안 배양하여 lactic acid 함량은 2.1 g/L이 생성되었다.

도 10에서는 pH를 5.0으로 고정하여 발효를 진행하였다. 그 결과, 유산균 생산량이 10^8.7 CFU/ml로 확인되었다. 또한 24시간 동안 배양하여 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 함량은 0.8 g/L이 생성되었다. pH를 5.0으로 고정해서 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 유산균 발효를 하는 것은 대조군 실험과 비교하였을 때 유산균과 lactic acid 생산에 적합하지 않다고 판단된다.

도 11에서는 pH를 5.5으로 고정하여 발효를 진행하였다. 그 결과, 유산균 생산량이 10^8.9 CFU/ml로 확인되었다. 또한 24시간 동안 배양하여 lactic acid 함량은 1.45 g/L이 생성되었다. pH를 5.5로 고정해서 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 유산균 발효를 하는 것은 pH 5.0 보다는 조금 증가를 하였지만 대조군 실험과 비교하였을 때 유산균과 lactic acid 생산에 적합하지 않다고 판단된다.

도 12에서는 pH를 6.0으로 고정하여 발효를 진행하였다. 그 결과, 유산균 생산량이 10¹⁰ CFU/ml로 확인되었다. 또한 24시간 동안 배양하여 lactic acid 함량은 1.9 g/L이 생성되었다. pH를 6.0으로 고정해서 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 유산균 발효를 하는 것은 대조군 실험과 비교하였을 때 유산균과 lactic acid 생산이 조금 낮게 나타나는 것을 확인하였다.

따라서 대조군에서 pH를 조절하지 않은 유산균 발효가 가장 높게 유산균과 lactic acid 생산을 하는 것으로 생각된다.

결과적으로 유산균의 cell viability를 높게 유지하기 위해서는 발효과정에서 pH를 조절하는 것보다는 발효를 종료하기 전 16-24 시간에 최대 유산균 생산 단계에서 pH를 6.0으로 조절하면 cell viability를 지속적으로 유지할 수 있을 것으로 판단된다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(a) 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 배지에서 배양하는 단계;
(b) 상기에서 수득한 배양액을 여과하는 단계; 및
(c) 여과 후 상기 유산균이 함유된 상등액은 회수하고, 남은 고형분은 배양액에 유지 또는 환류(recycle)하여 연속 발효하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a)단계의 배지는 미강 3 ~ 7g/L, 글루코스 7 ~ 13g/L, 아스코르브산 0.5 ~ 1.5g/L의 농도로 구성되는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균의 발효는 5L 발효기에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus)의 접종농도는 2.5%인 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 발효는 교반속도 150 ~ 250rpm, 온도 27 ~ 33℃에서 16 ~ 30시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 발효는 발효를 종료하기 전 18 ~ 24시간에 pH를 6.0으로 조정하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균을 재순환 연속 발효하는 방법.
제1항의 방법으로 제조된 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 썰모필러스(Lactobacillus thermophilus) 유산균의 발효 여과액.
제7항의 발효여과액을 유효성분으로 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물.