TW202342729A - 包含具有優良胃蛋白酶消化率之高蛋白的微藻生物質、其培養方法及用途 - Google Patents

包含具有優良胃蛋白酶消化率之高蛋白的微藻生物質、其培養方法及用途 Download PDF

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張成勳
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姜惠媛
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Abstract

本發明係關於具有優良胃蛋白酶消化率之高蛋白微藻生物質、其培養方法及其用途，且本發明中提出之組成物不僅具有高蛋白含量，且亦含有作為類似於魚粉之有用脂肪酸的ω-3脂肪酸，因此該組成物可在飼料調配之情況下直接替代魚粉。

Description

包含具有優良胃蛋白酶消化率之高蛋白的微藻生物質、其培養方法及用途
相關申請案之交叉參考
本申請案主張基於2022年4月18日申請之韓國專利申請案第10-2022-0047721號之優先權，且相對應的韓國專利申請案之文件中所揭示之全部內容作為本說明書之一部分併入。
本發明係關於具有優良胃蛋白酶消化率之高蛋白微藻生物質、其培養方法及其用途。
魚粉係廣泛用於魚類飼料以及各種家畜物種之飼料中的蛋白源。然而，由於最近出現了諸如關於漁獲物、重金屬以及微塑膠之法規的環境污染問題，因此需要開發能夠替代魚粉之新蛋白源。
另外，最近有減小魚類飼料領域中升高之魚入/魚出（Fish in/Fish out；FIFO）比率之趨勢，且另外，由於漁獲量視政府政策或氣候而變化，因此就可持續性而言，對經改良蛋白源之需求不斷增長。
迄今為止，已提出各種新蛋白源作為魚粉之替代物，但存在一個問題，即其無法替代魚粉中所含之有效物質ω-3脂肪酸及類似物。此外，呈現為如此高脂肪的基於綠藻之全細胞型蛋白具有一個問題：因為消化率極大地降低，幾乎難以在飼料混合比率中包含大比例。就此而言，韓國專利第1564829號揭示了一種含有微藻類副產物之用於魚類養殖的經調配飼料組成物。
因此，作為對解決此等問題之研究的結果，本發明人已開發出一種包含ω-3脂肪酸之新蛋白源，該等脂肪酸為經由基於破囊壺菌之微藻類之醱酵所產生的有用脂肪酸。此外，其已發現一種具有胃蛋白酶消化率之組成物且已提出新的可持續且對環境友好的蛋白源。
技術問題
本申請案之一個具體實例提供衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質，其具有優良胃蛋白酶消化率，包含按生物質乾重計46%或更高之總胺基酸。
本申請案之另一具體實例提供一種飼料組成物，其包含衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質。
本申請案之另一具體實例提供一種食品組成物，其包含衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質。
本申請案之另一具體實例提供一種培養裂殖壺菌屬物種微藻類之方法，其包含：在培養液中殘餘碳源之濃度維持在按總培養液計6%或更低之條件下培養裂殖壺菌屬物種微藻類。 技術解決方案
本申請案中所揭示之各描述及具體實例亦可應用於各其他描述及具體實例。換言之，本申請案中所揭示之各種要素的所有組合均屬於本申請案之範疇內。另外，本申請案之範疇不應視為受下文所描述之特定描述限制。另外，熟習此項技術者僅使用普通實驗將認識到或確認本申請案中所描述之本申請案之特定態樣的許多等效物。此外，此類等效物意欲包含於本申請案中。
本申請案之一個具體實例提供具有優良胃蛋白酶消化率之裂殖壺菌屬物種微藻類，其包含相比於生物質乾重46重量%或更高之總胺基酸。
本說明書中所用之術語「破囊壺菌（Thraustochytrid）」意謂破囊壺菌目之微藻類。另外，本說明書中所用之術語「裂殖壺菌屬物種（ Schizochytriumsp.）」係屬於破囊壺菌目之破囊壺菌科的屬種名稱之一，且可與「裂殖壺菌屬物種（裂殖壺菌屬（genus Schizochytrium））」互換使用。此外，術語「微藻類（microalgae）」係用裸眼無法看到且僅可經由顯微鏡看到的小藻類，且意謂在水中自由浮動及生活之活機體。微藻類有各種類型，且其包括不能光合作用且僅作為異營生物生長之菌株。
裂殖壺菌屬物種微藻類可為以寄存編號KCTC14345BP寄存之裂殖壺菌屬物種CD01-5004菌株，但不限於此。
在本說明書中所使用之術語「生物質（biomass）」意謂諸如植物、動物、微生物之有機體的能量來源，其可用作化學能，亦即生質能，且亦意謂在單位時間及空間內生態學上存在之特定有機體之重量或能量的量。另外，生物質可包含細胞所分泌之化合物，但不限於此，且不僅含有細胞外物質，而且含有細胞及/或細胞內內含物。在本申請案中，生物質可為裂殖壺菌屬物種微藻類自身、其培養產物、其乾物、其溶解物或藉由培養或醱酵該微藻類產生之產物，或可為生物質之濃縮物或乾物，但不限於此。
在本文中，裂殖壺菌屬物種微藻類之「培養產物（Culture product）」係指藉由培養該微藻類產生之產物，且特定言之，其可為包含微藻類之培養液或在培養液中移除微藻類之培養濾液，但不限於此。裂殖壺菌屬物種微藻類培養物中之「乾物（Dry matter）」係其中微藻類培養物中之水分經移除的物質，且例如，其可為乾燥微生物細胞形式之微藻類，但不限於此。另外，乾物之「溶解物（lysate）」統稱為微藻類培養產物中移除水分之乾物溶解的結果，且例如，其可為乾燥微生物細胞粉末，但不限於此。裂殖壺菌屬物種微藻類之培養產物可根據此項技術中已知的培養方法藉由在微藻類培養基中接種微藻類來製備，且培養產物之乾物及其溶解物亦可根據此項技術中已知的微藻類或培養基之處理或乾燥方法來製備。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質可包含按生物質乾重計如下之總胺基酸：46重量%或更高、48重量%或更高、49重量%或更高、50重量%或更高、或52重量%或更高、46至60重量%、46至55重量%、46至53重量%、48至53重量%、50至55重量%、52至55重量%、52至53重量%、52.5至55重量%或52.5至53重量%，且上限可為80重量%或更低、75重量%或更低、70重量%或更低或65重量%或更低，但不限於此。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質可包含按生物質乾重計如下之粗蛋白：60重量%或更高、64重量%或更高、67重量%或更高或70重量%或更高、60至85重量%、60至80重量%、64至80重量%、64至78重量%、67至80重量%、67至78重量%、67至75重量%、67至70%重量%、69至80重量%、69至78重量%、65至70重量%或69至70重量%，且上限可為85重量%或更低、80重量%或更低、78重量%或更低，但不限於此。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質可包含按生物質乾重計如下之粗脂肪：5重量%或更高、7重量%或更高、9重量%或更高、10重量%或更高、14重量%或更高、20重量%或更高、1至20重量%、4至23重量%、9至25重量%、9至23重量%、5至18重量%、10至18重量%、10至15重量%、12至18重量%、12至15重量%或13至15重量%。
本說明書中所用之術語「粗蛋白（crude protein）」可與「粗-蛋白（crude-protein）」互換使用，且意謂在食品及飼料之一般分析中藉由量測總氮及將其乘以6.25（蛋白之平均氮含量之倒數，1/0.16）獲得的蛋白。
本說明書中所用之術語「粗脂肪（crude fat）」」意謂在食品及飼料之一般分析中使用索氏萃取器（Soxhlet extractor）用乙醚萃取的組分，且「粗脂肪含量」可與「粗脂肪量」或「總脂質」或「總脂肪酸」互換使用。
本說明書中所用之術語「二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid；DHA）」係具有化學式C 22H 32O 2之多不飽和脂肪酸中之一者，且對應於與二十碳五烯酸（EPA）一起之ω-3脂肪酸，且通用名稱係二十二碳六烯酸，且亦可縮寫為22:6 n-3。
在本說明書中所用之術語「二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid；EPA）」係具有C 20H 30O 2之化學式的多不飽和脂肪酸之一者，且對應於與ALA及DHA一起之ω-3脂肪酸，且亦可縮寫為20:5 n-3。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質可包含按總粗脂肪含量計如下之二十二碳六烯酸（DHA）：39重量%或更高、40重量%或更高、41重量%或更高、45重量%或更高、49重量%或更高、50重量%或更高、39至60重量%、39至55重量%、39至50重量%、42至55重量%、42至50重量%、43至55重量%、43至50重量%、45至50重量%、47至50重量%或49至50重量%。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質可包含按總粗脂肪含量計如下之二十碳五烯酸（EPA）：0.5重量%或更高、1.0重量%或更高、1.5重量%或更高、2.0重量%或更高、2.1重量%或更高、3.5重量%或更高、0.5重量%至15.0重量%、0.5重量%至10.0重量%、0.5重量%至5.0重量%、0.5重量%至3.0重量%、1.0重量%至3.0重量%、1.9重量%至3.0重量%、1.9重量%至2.5重量%或1.9重量%至2.2重量%。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質可包含按總粗脂肪含量計如下之ω-3脂肪酸：41重量%或更高、42重量%或更高、50重量%或更高、42至55重量%、42至52重量%、43至55重量%、43至52重量%、49至55重量%或49至52重量%。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質可具有如下之胃蛋白酶消化率：68.7%或更高、69%或更高、70%或更高、73%或更高、75%或更高、77%或更高、80%或更高、83%或更高、89%或更高、69%至95%、69%至90%、70%至95%、70%至90%、73%至95%或73%至90%、75%至95%、75%至90%、85%至95%、85%至90%、87%至95%、87%至90%、89%至95%或89%至90%。
在本說明書中使用之術語「胃蛋白酶消化率（pepsin digestibility）」用於動物蛋白原料之品質分析，且意謂可使用自動物胃中萃取之胃蛋白酶比較在某種環境中已進行多少消化的指標。
生物質可藉由根據一個態樣之裂殖壺菌屬物種微藻類的培養方法培養。
本申請案之另一態樣提供一種組成物，其包含衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質，該裂殖壺菌屬物種微藻類具有優良胃蛋白酶消化率，包含按生物質乾重計46重量%或更高之總胺基酸。
組成物之特徵可為優良胃蛋白酶消化率，且可用於食品及/或飼料製備。
本申請案之另一態樣提供一種飼料組成物，其包含衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質，該裂殖壺菌屬物種微藻類具有優良胃蛋白酶消化率，包含按生物質乾重計46重量%或更高之總胺基酸。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質如上文所描述。
本說明書中所用之術語「飼料組成物（feed composition）」係指餵給動物之飼料。飼料組成物係指供應維持動物生命或生產肉、奶及其類似物所必需之有機或無機營養組分的材料。飼料組成物可進一步包含用於維持動物生命或生產肉、奶及其類似物之營養組分。飼料組成物可製備為此項技術中已知的各種飼料形式，且特定言之，可包括濃縮飼料、補充飼料及/或專用飼料。
本說明書中所使用之術語「飼料添加劑（feed additive）」包括出於各種作用之目的添加至飼料中的材料，諸如營養補充及防止體重減輕、促進飼料中纖維之消化可用性、改善油品質、防止生殖障礙及提高生育力、防止夏季高溫應激及其類似作用。本申請案之飼料添加劑對應於根據《控制家畜及魚類飼料法（Control of Livestock and Fish Feed）》的補充飼料，且可進一步包含礦物物質製劑，諸如碳酸氫鈉、膨潤土、氧化鎂、複合礦物質及其類似物；礦物製劑，其係微量礦物質，諸如鋅、銅、鈷、硒及其類似物；維生素製劑，諸如胡蘿蔔素、維生素E、維生素A、維生素D、維生素E、菸鹼酸、維生素B複合物及其類似物；保護型胺基酸製劑，諸如甲硫胺酸、離胺酸及其類似物；保護型脂肪酸製劑，諸如脂肪酸鈣鹽及其類似物；活細胞，諸如益生菌（乳酸菌製劑）、酵母培養物、黴菌醱酵產物及其類似物；酵母製劑及其類似物。
本申請案之另一態樣提供一種食品組成物，其包含衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質，該裂殖壺菌屬物種微藻類具有優良胃蛋白酶消化率，包含與生物質乾重相比46重量%或更高之總胺基酸。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質如上文所描述。
本說明書中所用之術語「食品組成物（food composition）」包括所有形式，諸如功能性食品、營養補充劑、保健食品及食品添加劑以及其類似物，且此類食品組成物可根據此項技術中已知之常見方法以各種形式製備。
本申請案之組成物可進一步包含由以下組成之乾燥組分：穀粒，例如研磨或碾碎之小麥、燕麥、大麥、玉米及稻米；植物蛋白飼料，例如使用豆類及向日葵作為主要組分之飼料；動物蛋白飼料，例如血粉、肉粉、骨粉及魚粉；糖及乳製品，例如各種乳粉及乳清粉；及其類似物；且另外，其可進一步包含營養補充劑、消化及吸收增強劑、生長促進劑及其類似物。
本申請案之組成物可單獨或與其他飼料添加劑組合在可食用載劑中向動物投予。另外，組成物可以追肥形式或直接與飼料混合或以與飼料分離之口服調配物形式容易地向動物投予。當組成物與飼料分開投予時，其可與此項技術中熟知之醫藥學上可接受之可食用載劑組合製備為立即釋放或持續釋放調配物。此類可食用載劑可為固體或液體，例如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、大豆片、花生油、橄欖油、芝麻油及丙二醇。當使用固體載劑時，組成物可為呈錠劑、膠囊、粉末、糖衣錠或含糖錠劑或微分散劑形式之追肥。當使用液體載劑時，組成物可為明膠軟膠囊或糖漿或懸浮液、乳液或溶液之調配物。
本申請案之組成物可包含例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑或乳化劑、低溫保護劑或賦形劑或其類似物。低溫保護劑可為選自由以下組成之群的一或多者：甘油、海藻糖、麥芽糊精、脫脂乳粉及澱粉。
防腐劑、穩定劑或賦形劑可以足以減少組成物中所包含之裂殖壺菌屬物種微藻類變質的有效量包含於組成物中。此外，當組成物處於乾燥狀態時，低溫保護劑可以足以減少組成物中所包含之裂殖壺菌屬物種微藻類變質的有效量包含於組成物中。
組成物可藉由浸沒、噴灑或混合添加至動物飼料中使用。
本申請案之組成物可應用於各種動物飲食，包括哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼動物、頭足類動物、爬行動物及兩棲動物，但不限於此。例如，哺乳動物可包括豬、牛、綿羊、山羊、實驗室嚙齒動物或寵物或其類似物，且鳥類可包括家禽，且家禽可包含雞、火雞、鴨、鵝、野雞或鵪鶉及其類似物，但不限於此。此外，魚類可包括商業畜魚及其魚苗、觀賞魚及其類似物，且甲殼動物可包括蝦、藤壺及其類似物，但不限於此。此外，組成物可應用於作為浮游動物之輪蟲的飲食。
本申請案之另一態樣提供一種培養裂殖壺菌屬物種微藻類之方法，其包含：在培養液中殘餘碳源之濃度維持在按總培養液計6%或更低之條件下培養裂殖壺菌屬物種微藻類。
裂殖壺菌屬物種微藻類可為以寄存編號KCTC14345BP寄存之裂殖壺菌屬物種微藻類CD01-5004菌株，但不限於此。
衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質如上文所描述。
本說明書中所使用之術語「培養（culturing）」意謂在經適當控制之環境條件下使微藻類生長。本申請案之培養過程可根據此項技術中已知的適當培養基及培養條件來進行。此類培養過程可容易由熟習此項技術者根據待選擇之微藻類來調整及使用。
本說明書中所使用之術語「培養液（culture solution）」可意謂用於培養微藻類之培養基，且可意謂用於培養微藻類之培養基進一步包含微藻類及/或由微藻類產生之產物。
培養裂殖壺菌屬物種微藻類之步驟中的培養條件可尤其在其中培養液中殘餘碳源之濃度維持在按總培養液計6%或更低、5%或更低、4%或更低、3%或更低、或2%或更低之條件下進行。
特定言之，培養本申請案之裂殖壺菌屬物種微藻類可在異營條件下進行，但不限於此。
本說明書中所用之術語「異營（heterotrophic）」係視獲自身體外部之有機物質而定作為能量來源或養分來源的一種營養方法，且係相對於自營的術語，且可與術語『暗培養（dark culture）』互換使用。
培養裂殖壺菌屬物種微藻類不受其特定限制，但可藉由已知分批培養方法、連續培養方法、分批補料培養方法或類似方法進行。培養本申請案之微藻類中所用之培養基及其他培養條件可使用任一者，只要其為通常用於培養微藻類之培養基即可，無特定限制。特定言之，可在好氧條件下，在含有適合碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸及/或維生素及其類似物之常用培養基中，在調節溫度、pH及類似條件的同時培養本申請案之微藻類。
特定言之，可使用鹼性化合物（例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨）或酸性化合物（例如磷酸或硫酸）調節適當pH（例如pH 5至9，特定言之，pH 5至8），但不限於此。
培養本申請案之裂殖壺菌屬物種微藻類中所用之培養基可為MJW01培養基，但不限於此。
培養本申請案之裂殖壺菌屬物種微藻類中所用之培養基中包含的碳源可為選自由以下組成之群的至少一者：葡萄糖、果糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖及甘油，且特定言之，其可為選自由葡萄糖、果糖及蔗糖組成之群的至少一者，但不限於此。
培養本申請案之裂殖壺菌屬物種微藻類中所用之培養基中包含的氮源可為選自由以下組成之群的至少一者：尿素、氨水、硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）、酵母萃取物、蛋白腖、硝酸鈉（NaNO 3），但其不限於此，只要其係用於培養微藻類之氮源即可。
在培養本申請案之裂殖壺菌屬物種微藻類中所用之培養基中，作為磷源，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、對應於其之含鈉鹽及其類似物可單獨地包含或以組合形式包含，但不限於此。
培養裂殖壺菌屬物種微藻類之步驟中所用之培養基可包含酵母萃取物0.01至5 g/L、KH 2PO 41.0至3.0 g/L及K 2HPO 45至20 g/L，但不限於此。
另外，培養溫度可維持在20至45℃或25至40℃，且其可培養約10至70小時，但不限於此。
用於培養裂殖壺菌屬物種微藻類之方法可藉由供應培養基中之殘餘碳源濃度以使其維持在按總培養基計最大6%或更低之範圍內，從而提高按微藻類生物質乾重計之總胺基酸含量來提高胃蛋白酶消化率。 有利作用
本發明已開發出一種替代蛋白源，其可經由基於微藻類之醱酵過程替代魚粉。本發明中提出之組成物不僅具有高蛋白含量，且亦含有作為與魚粉類似之有用脂肪酸的ω-3脂肪酸，使得該組成物可在調配飼料時直接替代魚粉。此外，作為胃蛋白酶消化率分析之結果，本發明中呈現之高蛋白微藻類生物質展示70%或更高之胃蛋白酶消化率，因此存在以下優勢：即使飼料中之混合比率提高，亦不會不利地影響整體消化率，且不存在環境污染問題，因為其係基於微藻類生產之蛋白源，且其可藉由使外部環境影響降至最低而穩定地生產。
在下文中，將藉由實施例更詳細地描述本發明。此等實施例僅意欲更具體地說明本發明，且熟習此項技術者將顯而易見，本發明之範疇不受根據本發明之主旨的此等實施例限制。 ＜ 微藻菌株之種菌培養 ＞
使用了屬於基於破囊壺菌之微藻類的以寄存編號KCTC14345BP寄存之裂殖壺菌屬物種CD01-5004菌株。在26℃、200 rpm之條件下在包含滅菌MJW01培養基（葡萄糖30 g/L、MgSO 4·7H 2O 3.0 g/L、Na 2SO 410 g/L、NaCl 1.0 g/L、酵母萃取物9.0 g/L、MSG·1H 2O 1.0 g/L、NaNO 31.0 g/L、KH 2PO 40.1 g/L、K 2HPO 40.5 g/L、CaCl 20.5 g/L、維生素混合溶液10 ml/L）之250 mL燒瓶中培養該菌株30小時。 比較實施例 1 藉由在與培養液相比 7~9% （ w/v 比率 ） 之碳源濃度之條件下培養菌株製備生物質
將經種菌培養之菌株等分至包括滅菌MJW01培養基（葡萄糖30 g/L、MgSO 4·7H 2O 3.0 g/L、Na 2SO 410 g/L、NaCl 1.0 g/L、酵母萃取物0.5 g/L、MSG·1H 2O 1.0 g/L、NaNO 35.0 g/L、KH 2PO 41.5 g/L、K 2HPO 410 g/L、CaCl 20.5 g/L、維生素混合溶液10 ml/L）之5 L醱酵器中，藉此在28℃、300 rpm、0.6 vvm、pH 6.8之條件下執行培養。在執行培養期間（45小時），供應其以使得培養液中殘餘碳源之濃度維持在與總培養液相比7~99%（w/v比率）之範圍內。繼續培養，同時自開始培養之後即刻供應氮源直至培養結束為止。為了維持適當氮源濃度，藉由重複開/關將氮源供應至培養液。使用葡萄糖作為碳源，且使用硫酸銨作為氮源。在完成培養之後，藉由對微生物細胞培養液進行冷凍乾燥或滾筒乾燥，獲得比較實施例1之乾生物質作為對照組。 實施例 1 藉由在與培養液相比 0~2% （ w/v 比率 ） 之碳源濃度之條件下培養菌株製備生物質
在持續培養期間（45小時），在維持比較實施例1之培養條件（對照條件，對照組）MJW01培養基之組成的同時，供應其以使得培養液中之殘餘碳源濃度維持在與總培養液相比0~2%（w/v比率）之範圍內。其餘培養條件藉由與比較實施例1相同的方法培養以獲得實施例1之乾生物質。 實施例 2 藉由在與培養液相比最大 2~5% （ w/v 比率 ） 之碳源濃度之條件下培養菌株製備生物質
在持續培養期間（45小時），在維持比較實施例1之培養條件（對照條件，對照組）MJW01培養基之組成的同時，供應其以使得培養液中之殘餘碳源濃度維持在與總培養液相比2~5%（w/v比率）之範圍內。其餘培養條件藉由與比較實施例1相同的方法培養以獲得實施例3之乾生物質。 實施例 3 藉由在與培養液相比最大 4~7% （ w/v 比率 ） 之碳源濃度之條件下培養菌株製備生物質
在持續培養期間（45小時），在維持比較實施例1之培養條件（對照條件，對照組）MJW01培養基之組成的同時，供應其以使得培養液中之殘餘碳源濃度維持在與總培養液相比4~7%（w/v比率）之範圍內。 實驗實施例 1 按培養條件對微藻類乾生物質之組分分析 1-1. 分析微藻類乾生物質之粗脂肪含量及脂肪酸含量
為了分析在以上比較實施例1及實施例1至實施例3中所獲得之各乾生物質的粗脂肪含量及脂肪酸含量，進行了以下實驗。
特定言之，藉由將8.3M鹽酸溶液添加至2 g比較實施例1及實施例1至實施例3之各微藻類幹細胞中，在80℃下進行了水解反應。隨後，在添加30 mL乙醚及20 mL石油醚之後，重複混合30秒及離心之過程3次或以上。將分離之溶劑層轉移至預先量測重量之圓底燒瓶，且隨後將其置於容器中，經由氮氣吹掃自該容器中移除溶劑及殘餘水分且乾燥。藉由量測乾燥溶劑之後剩餘之油的重量，計算總油含量，且在用甲醇0.5N NaOH及14%三氟硼烷甲醇（BF 3）進行預處理之後，藉由氣相層析法量測油中所包含之ω-3（DHA及EPA）含量。 1-2. 分析微藻類乾生物質之粗蛋白含量
為了分析在以上比較實施例1及實施例1至實施例3中所獲得之各乾生物質的粗蛋白含量，利用Kjeldahl自動分析儀進行了以下實驗。
特定言之，將在比較實施例1及實施例1至實施例3中獲得之各微藻類樣品的乾生物質放入Kjeldahl裝置（Kjeldahl system，Kjeltec 2100）之分析管中，且在藉由添加硫相及催化劑而在分解器中降解之後，將分解管安裝在自動取樣器上。藉由在Kjeldahl裝置中冷卻及收集用苛性鈉及蒸汽熱蒸餾產生之氣體氨，且隨後用鹽酸滴定以自動計算氮含量的方法，量測了微藻類乾生物質之粗蛋白含量。 1-3. 分析微藻類乾生物質之胺基酸含量
為了分析在以上比較實施例1及實施例1至實施例3中所獲得之各乾生物質之胺基酸含量，進行了以下實驗。
特定言之，在對0.5-1 g比較實施例1及實施例1至實施例3之各微藻類乾燥微生物細胞進行酸水解之後，使用液相層析法進行總胺基酸分析。個別胺基酸之分析結果用所使用之微藻類乾燥微生物細胞的量標準化以計算乾燥微生物細胞中個別胺基酸之含量比，且藉由將偵測之所有胺基酸的含量比相加作為分析結果，計算出微生物細胞中之總胺基酸含量比。 1-4. 按培養條件分析微藻類乾生物質之組分的結果
藉由實驗實施例1-1至實驗實施例1-3之方法分析在比較實施例1以及實施例1至實施例3中獲得之各乾生物質之組分的結果展示於表1中。 [表1]
   粗蛋白 / 生物質 總胺基酸 / 生物質 粗脂肪 / 生物質 DHA/ 粗脂肪 EPA/ 粗脂肪 ω-3 脂肪酸 / 粗脂肪
比較實施例1 70.50% 45.75% 8.50% 46.25% 1.77% 48.02%
實施例1 64.10% 48.10% 22.80% 40.51% 1.86% 42.37%
實施例2 69.90% 52.78% 14.40% 49.40% 2.11% 51.51%
實施例3 77.20% 52.18% 12.20% 42.47% 1.06% 43.53%
結果，如表1中所示，當將比較實施例1與實施例1比較時，證實實施例1可藉由在培養過程期間將培養液中殘餘碳源之濃度維持在0~2%之低範圍內而提高微藻類生物質中之總胺基酸含量，但粗脂肪含量亦提高。
在實施例2中，在進行培養期間，將培養液中殘留之碳源之濃度調整了2~5%。當將比較實施例1及實施例2之組分含量比較時，證實在實施例2中將碳源濃度維持在2~5%範圍內的情況下，粗蛋白含量維持在70%之水平，且顯示粗脂肪含量在比較實施例1及實施例1之中間範圍內。特定言之，表明生物質中之總胺基酸含量在培養條件中顯示52.78%之最高值。
在實施例3中，在進行培養期間，培養液中殘留之碳源之濃度維持在4~7%範圍內。證實在實施例3中當碳源濃度維持在4~7%範圍內時，粗蛋白含量顯示為77.20%，且總胺基酸含量顯示為52.18%，且粗脂肪含量顯示為12.20%，因此顯示培養條件中之粗蛋白含量最高。 實驗實施例 2 按培養條件分析微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率
因為蛋白消化率係將微藻類生物質用作飼料及食品之一個重要指標，所以根據胃蛋白酶消化率分析方法進行了分析。為了按培養條件分析微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率，藉由揭示於公定分析化學家協會，1990年，官方分析方法971.09（Association of Official Analytical Chemists, 1990, Official Method of Analysis 971.09）中之方法，量測在以上比較實施例1及實施例1至實施例3中獲得之各乾生物質的胃蛋白酶消化率，以使用以下等式1推導胃蛋白酶消化率。
特定言之，將先前加熱至42至45℃之150 mL的0.2%胃蛋白酶鹽酸溶液添加至1 g各乾生物質樣本中，且在45℃恆定溫度水浴中搖晃的同時將其消化16小時，且隨後用第2A號濾紙過濾。在用溫水洗滌氟化物之後，藉由Kjeldahl分析獲得氟化物及濾紙之粗蛋白含量，且結果顯示於下表2中。
藉由執行在粗蛋白分析中所揭示之方法利用實驗實施例1-3之Kjeldahl自動分析儀來計算等式1之Kjeldahl氮含量。 [等式1] 胃蛋白酶消化率 (%) = 100 * (A-B)/A *A：原始樣品之Kjeldahl氮含量% （原始樣品中之Kjeldahl氮） *B：不溶於酸性胃蛋白酶溶液中之Kjeldahl氮含量%（不溶於酸性胃蛋白酶溶液中之Kjeldahl氮） [表2]
   胃蛋白酶消化率
比較實施例1 68.59%
實施例1 73.40%
實施例2 89.62%
實施例3 83.2%
結果，如表2中所示，顯示比較實施例1之微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率相對較低，為68.6%。然而，由於藉由改變培養條件來改變生物質組分比，證實顯示出高胃蛋白酶消化率，因為實施例1之微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率係73.40%，且實施例2之微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率係89.62%，且實施例3之微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率係83.20%。 實驗實施例 3 按培養條件確認胃蛋白酶消化率與微藻類乾生物質之總胺基酸含量之間的關聯
由於經由以上實驗實施例2中培養條件之改變來改變生物質組分比，證實胃蛋白酶消化率提高，且因此證實生物質之組分中的哪個指標與胃蛋白酶消化率具有相關性。
特定言之，導出了比較實施例1及實施例1至實施例3中所獲得之粗脂肪含量、粗蛋白含量、ω-3脂肪酸/粗含量及總胺基酸含量與各乾生物質之胃蛋白酶消化率之間的相關係數，且結果顯示於圖1至圖4中。
因此，如圖1至圖3中所示，顯示在生物質組分中與粗脂肪含量、粗蛋白及粗脂肪重量相比，ω-3脂肪酸含量無顯著相關性。另一方面，如圖4中所示，顯示生物質中之總胺基酸含量與胃蛋白酶消化率之間存在顯著相關性（R2=0.9527）。因為總胺基酸係包括於粗蛋白含量中之概念，所以粗蛋白含量及總胺基酸被視為按比例波動之值，但可證實，如本發明中所描述，即使粗蛋白含量類似，總胺基酸含量可視醱酵條件而改變，且胃蛋白酶消化率隨生物質中之總胺基酸含量提高而提高。
無
[圖1]係展示針對各培養條件，微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率與生物質中之粗脂肪含量之間的相關係數之圖表（平均值±標準差，n=4）。 [圖2]係展示針對各培養條件，微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率與生物質中之粗蛋白含量之間的相關係數之圖表（平均值±標準差，n=4）。 [圖3]係展示針對各培養條件，微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率與ω-3脂肪酸含量相比於生物質中之粗脂肪重量之間的相關係數之圖表（平均值±標準差，n=4）。 [圖4]係展示針對各培養條件，微藻類乾生物質之胃蛋白酶消化率與生物質中之總胺基酸含量之間的相關係數之圖表（平均值±標準差，n=4）。
[寄存編號]寄存機構之名稱：韓國生物科學與生物技術研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology），韓國菌種保藏中心（Korean Collection for Type Cultures；KCTC） 寄存編號：KCTC14345BP 寄存日期：20201026

Claims (19)

  1. 一種衍生自裂殖壺菌屬物種（ Schizochytriumsp.）微藻類之生物質之製備方法，其包含：在培養液中殘餘碳源之濃度維持在按總培養液計7%或更低之條件下培養裂殖壺菌屬物種微藻類。
  2. 如請求項1之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該裂殖壺菌屬物種微藻類係以寄存編號KCTC14345BP寄存之裂殖壺菌屬物種CD01-5004菌株。
  3. 如請求項1之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該培養在MJW01培養基中進行。
  4. 如請求項1之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該培養基之該碳源係選自由葡萄糖、果糖及蔗糖組成之群的至少一者。
  5. 如請求項1之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該培養基包含選自由以下組成之群的至少一者作為氮源：尿素、氨水、硫酸銨、酵母萃取物、蛋白腖及硝酸鈉。
  6. 如請求項1之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該培養基包含酵母萃取物0.01至5 g/L、KH 2PO 41.0至3.0 g/L及K 2HPO 45至20 g/L。
  7. 如請求項1之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該培養進行10至70小時。
  8. 如請求項1之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該微藻類培養方法藉由提高按該微藻類乾重計之總胺基酸含量來提高胃蛋白酶消化率。
  9. 如請求項8之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質之製備方法，其中該胃蛋白酶消化率係70%或更高。
  10. 一種藉由請求項1之製備方法製備的衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類之生物質，其具有優良胃蛋白酶消化率。
  11. 如請求項10之生物質，其中該裂殖壺菌屬物種微藻類係以寄存編號KCTC14345BP寄存之裂殖壺菌屬物種CD01-5004菌株。
  12. 如請求項10之生物質，其中該生物質含有按生物質乾重計60重量%或更高之粗蛋白。
  13. 如請求項10之生物質，其中該生物質含有按生物質乾重計4重量%至23重量%之粗脂肪。
  14. 如請求項10之生物質，其中該生物質含有按總粗脂肪重量計40重量%或更高之二十二碳六烯酸。
  15. 如請求項10之生物質，其中該生物質含有按總粗脂肪重量計0.5重量%或更高之二十碳五烯酸。
  16. 如請求項10之生物質，其中該生物質含有按總粗脂肪重量計41重量%或更高之ω-3脂肪酸。
  17. 如請求項10之生物質，其中該生物質具有70%或更高之胃蛋白酶消化率。
  18. 一種飼料組成物，其包含如請求項10之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類的生物質。
  19. 一種食品組成物，其包含如請求項10之衍生自裂殖壺菌屬物種微藻類的生物質。
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