CN101717800A - 利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法。本发明利用隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)在气升式生物反应器中发酵同时生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂，包括微藻种子液制备、发酵、藻体收集和干燥、多不饱和脂肪酸的提取几个步骤。本发明方法得到的精炼油中DHA含量达36.5％，提取多不饱和脂肪酸后微藻渣(干)蛋白质含量达到46.3％，本发明方法不仅可以生产多不饱和脂肪酸以及DHA，而且可以充分利用提取脂肪酸的藻渣，具有经济可行性，而且可以变藻渣为宝，实现多不饱和脂肪酸的清洁生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵生产领域，具体涉及一种利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法。
背景技术
微藻中含有脂肪酸、蛋白质和碳水化合物等多种营养成分，是一种很好的可再生资源。隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)中脂肪酸含量可高达50％左右，二十二碳六烯酸(DHA)的含量可占到脂肪酸含量的50％左右。提取脂肪酸的藻渣中蛋白质含量大幅提高，高达46％左右，同时还有残存的多不饱和脂肪酸，是一种很好的蛋白质饲料资源。隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)制备脂肪酸以及藻体作为水产饵料的安全性已经被广泛认可。如何最大限度的利用发酵生产微藻中的多不饱和脂肪酸和蛋白质资源是一个需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法，本发明方法不仅可以生产多不饱和脂肪酸以及DHA，而且可以充分利用提取脂肪酸的藻渣，具有经济可行性，而且可以变藻渣为宝，实现多不饱和脂肪酸的清洁生产。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
(1)低温保存的隐甲藻经扩大培养制得微藻种子液；将微藻种子液接种到灭菌后的发酵培养基，在20～30℃下发酵，通气量为0.5～1.5vvm，当糖浓度低于5g/L时，终止发酵，得到发酵液；
(2)分离步骤(1)得到的发酵液后，洗涤并干燥不溶物，得到藻体；
(3)将藻体进行压榨提取，得到粗品油，经碱炼、脱色和脱臭后得到多不饱和脂肪酸精炼油；
(4)压榨后的藻渣粉碎后作为饲料添加剂。
步骤(1)所述扩大培养是将低温保存的隐甲藻经试管和摇瓶逐级放大，在20～30℃条件下，分别培养24～60小时，制得微藻种子液。试管和摇瓶培养阶段均采用和发酵培养基相同的培养基，制得微藻种子液；
步骤(1)所述发酵是在气升式反应器中进行。
步骤(1)所述发酵培养基采用Porphyridium培养基，组成如下：人造海水500mL，蒸馏水400mL，土壤水100mL，胰蛋白胨1g/L，酵母粉1g/L g，葡萄糖30g/L。
所述的人造海水组成如下：NaCl 18g/L，MgSO4·7H2O 2.44g/L，KCl 0.6g/L，NaNO31.00g/L，CaCl2·2H2O 0.3g/L，KH2PO40.05g/L，Tris 1.00g/L，NH4Cl 0.267g/L，VB12 1.5×10-7g/L，金属离子溶液10mL，螯合铁离子溶液3mL。
所述的金属离子溶液组成如下：H3BO3 0.3246g/100mL，CoCl2·6H2O 1.215×10-4g/100mL，MnCl2·6H2O 4.320×10-5g/100mL，ZnCl2 3.150×10-3g/100mL，浓硫酸1mL，(NH4)6Mo7O24·4H2O 3.119×10-3g/100mL。
所述的螯合铁离子溶液组成如下：0.1mol/L HCl 50mL，FeCl3·6H2O 0.081g/100mL，蒸馏水50mL，Na2EDTA 1.000g/100mL。
步骤(1)所述接种的接种量为5～10％。
步骤(2)所述分离为采用离心分离或板框压滤。
步骤(2)所述干燥为采用喷雾干燥或冷冻干燥。
步骤(2)所述洗涤为洗涤不溶物3～5次。
步骤(1)所述的灭菌是将发酵培养基在115℃下灭菌30分钟。
步骤(1)所述的低温为4℃、-20℃、-80℃或-196℃。
步骤(1)所述发酵时，当糖浓度低于10g/L时，将碳源以及氮源以流加方式进行补加，延长了藻类对数生长期，可以有效地提高藻体浓度，降低下游工艺的生产成本。
步骤(1)所述的隐甲藻为Crypthecodinium cohnii。例如ATCC30556或者其驯化菌株。
本发明相对于现有技术所具有的优点和有益效果：
1.利用一种异养微藻，隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)在气升式反应器中发酵生产多不饱和脂肪酸，可以降低机械搅拌反应器的剪切力对藻生长和产脂肪酸的影响，具有设备结构简单、节能和节省投资等优点。
2.采用流加工艺，延长藻类对数生长期，可以有效地提高藻体浓度，降低下游工艺的生产成本。
3.通过压榨进行多不饱和脂肪酸的提取，工艺简单可行。
4.压榨后的藻渣经粉碎后可以用作蛋白质饲料添加剂。
具体实施方式
本发明实施例所用培养基采用Porphyridium培养基，组成如下：人造海水500mL，蒸馏水400mL，土壤水100mL，胰蛋白胨1g/L，酵母粉1g/Lg，葡萄糖30g/L。
人造海水组成如下：NaCl 18g/L，MgSO4·7H2O 2.44g/L，KCl 0.6g/L，NaNO3 1.00g/L，CaCl2·2H2O 0.3g/L，KH2PO4 0.05g/L，Tris 1.00g/L，NH4Cl 0.267g/L，VB12 1.5×10-7g/L，金属离子溶液10mL，螯合铁离子溶液3mL。
金属离子溶液组成如下：H3BO3 0.3246g/100mL，CoCl2·6H2O 1.215×10-4g/100mL，MnCl2·6H2O 4.320×10-5g/100mL，ZnCl2 3.150×10-3g/100mL，硫酸1mL，(NH4)6Mo7O24·4H2O3.119×10-3g/100mL。
螯合铁离子溶液组成如下：0.1mol/L HCl 50mL，FeCl3·6H2O 0.081g/100mL，蒸馏水50mL，Na2EDTA 1.000g/100mL。
实施例1
利用微藻在气升式反应器中发酵同时生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法，具体如下：
(1)微藻种子液制备：-80℃保存的隐甲藻Crypthecodinium cohnii(ATCC30556)经试管和摇瓶逐级放大，采用Porphyridium培养基，在20℃条件下，试管和摇瓶阶段分别培养48小时，制得微藻种子液；
(2)发酵：10L气升式反应器中加入5000mL发酵培养基(Porphyridium培养基)，在115℃下灭菌30分钟，冷却至25℃，将制好的微藻种子液以5％接种量接种至发酵培养基，控制温度25℃，通入无菌空气0.5vvm，发酵60小时后，当葡萄糖浓度低于10g/L时，分两次加入总量为500g/L碳源以及100g/L酵母抽提物和蛋白胨，120小时藻体含量达到35.3g/L，当糖浓度低于5g/L时，终止发酵，得到发酵液；
(3)藻体收集和干燥：对发酵液进行离心分离、洗涤不溶物3次，收集不溶物，将收集的藻体进行喷雾干燥，得到186克干燥藻体；
(4)将多次发酵收集所得的干燥藻体约1000克进行压榨提取，经碱炼、脱色和脱臭后得到多不饱和脂肪酸精炼油352克，含DHA 36.5％；
(5)压榨后的藻渣632.5克，蛋白质含量46.1％，经粉碎可以作为蛋白质饲料添加剂。
实施例2
利用微藻在气升式反应器中发酵同时生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法，具体如下：
(1)微藻种子液制备：-196℃保存的隐甲藻Crypthecodinium cohnii(ATCC30556)经试管和摇瓶逐级放大，采用Porphyridium培养基，在25℃条件下，试管和摇瓶阶段分别培养40小时，制得微藻种子液；
(2)发酵：10L气升式反应器中加入5000mL发酵培养基(Porphyridium培养基)，在115℃下灭菌30分钟，冷却至28℃，按照5％接种量接入种子液，控制温度28℃，通入无菌空气1.0vvm，发酵54小时后，当葡萄糖浓度低于10g/L时，分两次补加500g/L碳源以及100g/L酵母抽提物和蛋白胨，108小时藻体含量达到34.2g/L，当糖浓度低于5g/L时，终止发酵；
(3)藻体收集和干燥：对发酵液进行离心分离，并洗涤不溶物5次，收集不溶物藻体，将收集的藻体进行喷雾干燥，得到179克干燥藻体；
(4)将多次发酵收集所得的干燥藻体约1000克进行压榨提取，经碱炼、脱色和脱臭后得到多不饱和脂肪酸精炼油338克，含DHA 33.4％；
(5)压榨后的藻渣约632克，蛋白质含量约47.2％，经粉碎可以作为蛋白质饲料添加剂。
实施例3
利用微藻在气升式反应器中发酵同时生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法，具体如下：
(1)微藻种子液制备：4℃保存的隐甲藻Crypthecodinium cohnii(ATCC30556)经试管和摇瓶逐级放大，采用Porphyridium培养基，在30℃条件下，试管和摇瓶阶段培养24小时，制得微藻种子液；
(2)发酵：10L气升式反应器中加入5000mL发酵培养基(Porphyridium培养基)，在115℃下灭菌30分钟，冷却至30℃，按照10％接种量接入种子液，控制温度30℃，通入无菌空气1.5vvm，发酵48小时后，分两次加入总量为500g/L碳源以及100g/L酵母抽提物和蛋白胨，84小时藻体含量达到36.2g/L，当糖浓度低于5g/L时，终止发酵；
(3)藻体收集和干燥：对发酵液进行离心分离，并洗涤不溶物3次，收集不溶物藻体。将收集的藻体进行喷雾干燥，得到191克干燥藻体；
(4)将多次发酵收集所得的干燥藻体约1000克进行压榨提取，经碱炼、脱色和脱臭后得到多不饱和脂肪酸精炼油308克，含DHA 28.5％
(5)压榨后的藻渣约667克，蛋白质含量约45.5％，经粉碎可以作为蛋白质饲料添加剂。
Claims (9)
1.一种利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)低温保存的隐甲藻经扩大培养制得微藻种子液；将微藻种子液接种到灭菌后的发酵培养基，在20～30℃下发酵，通气量为0.5～1.5vvm，当糖浓度低于5g/L时，终止发酵，得到发酵液；
(2)分离步骤(1)得到的发酵液后，洗涤并干燥不溶物，得到藻体；
(3)将藻体进行压榨提取，得到粗品油，经碱炼、脱色和脱臭后得到多不饱和脂肪酸精炼油；
(4)压榨后的藻渣粉碎后作为饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的隐甲藻为Crypthecodiniumcohnii。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述扩大培养是将低温保存的隐甲藻经试管和摇瓶逐级放大，在20～30℃条件下，分别培养24～60小时，制得微藻种子液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵是在气升式反应器中进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵培养基采用Porphyridium培养基，组成如下：人造海水500mL，蒸馏水400mL，土壤水100mL，胰蛋白胨1g/L，酵母粉1g/Lg，葡萄糖30g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述接种的接种量为5～10％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述分离为采用离心分离或板框压滤。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述干燥为采用喷雾干燥或冷冻干燥。
9.据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述洗涤为洗涤不溶物3～5次。
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