CN115024428A - 一种具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents
一种具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂及其制备方法。该饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：S1、将微藻藻种接种于A0培养基中，使用光照培养，当藻液的光密度值OD达到600‑700后，离心将微藻均分成三份进行培养；S2、将步骤S1得到的微藻进行藻蛋白强化培养，收获微藻A；S3、将步骤S1得到的微藻进行藻脂类强化培养，收获微藻B；S4、将步骤S1得到的微藻进行藻发酵强化培养，得到微藻C；S5、将微藻A、微藻B和微藻C分别进行干燥，混合，得到无抗饲料添加剂。本发明利用微藻功能成分得到的饲料添加剂配方具有定向改善水禽肠道功能、肠道菌群的组成，代替抗生素的功能，可以有效减少饲料的使用与营造水禽养殖的健康养殖环境。
Description
技术领域
本发明属于水禽饲料技术领域，具体涉及一种具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
农业是我国的重要的支柱产业，而其中水禽养殖业是最重要的组成部分。通过集中饲养与集约化，可以提高水禽的养殖密度与养殖利润，然后，密集养殖却又会带来水禽疾病与环境污染的问题。传统水禽养殖业采用大量使用抗生素与的清洁的养殖模式。散播在环境与动物体内的抗生素，最终将危害我们赖以生存的环境。因此，开发既能减少抗生素使用，又能减少水禽病害，提高免疫的饲料将是目前发展的方向。水禽低抗饲料的庞大需求，为微藻制品开发低抗饲料提供机遇。养殖业的高速发展，使饲料滥用抗生素的问题更加凸显；饲料减抗的研发有助于减少饲料抗生素产的微藻，应用于本行业的低抗饲料研发，将有可能代替50％以上的抗生素用量，但目前还没有基于现场实验的系统研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂及其制备方法。本发明利用微藻功能成分，配合先进加工技术生产水禽饲料的方法，得到的饲料添加剂配方具有定向改善水禽肠道功能、肠道菌群的组成，代替抗生素的功能，可以有效减少饲料的使用与营造水禽养殖的健康养殖环境。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
S1、微藻的预培养：将微藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，使用光照培养，当藻液的光密度值OD达到600-700后，离心将微藻均分成三份进行培养；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，收获微藻A；
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，培养5-7天后，收获微藻B；
S4、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，测定生物量增加至200-350mg/L，再培养24-48h，得到微藻C；
S5、饲料添加剂配制：将步骤S2、S3和S4得到的微藻A、微藻B和微藻C分别进行干燥，混合，得到无抗饲料添加剂。
优选地，上述制备方法，具体包括如下步骤：
S1、微藻的预培养：将微藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，当藻液的光密度值OD达到600-700后，离心将微藻均分成三份进行培养；
A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3-4次，培养温度为20℃-30℃，光照强度为4500-6000Lux，培养4-6天，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，收获微藻A；
A1培养基成分为：改性的铁皮石斛粉末50-100mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3-4次，培养温度为20-30℃，光照强度为4500-6000Lux，培养2-4天，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，有光培养条件为：培养温度20℃-30℃，光照强度6000-7000Lux，培养18-30h，震荡培养；无光培养条件为：150rpm震荡培养，每隔18-30h更换一次光线的开关，并在暗培养时加入脉冲超声波培养，参数如下：22KHz，25瓦功率下，以30s超声，30s停止为周期，在超声下培养10-20min，每天1-2次，培养5-7天后，收获微藻B；
A2培养基成分为：板栗壳-改性高岭土100-200mg/L，NaNO3 100-200mg/L，KH2PO460mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S4、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3-4次，培养温度为20℃-30℃，光照强度为4500-6000Lux，培养2-4天，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，培养条件为：避光，150rpm震荡培养，培养24-48h后，测定生物量增加至200-350mg/L，再培养24-48h，得到微藻C；
A3培养基成分为：葡萄糖100-200mg/L，海藻酸钠100-150mg/L，NH4Cl 100-200mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4100 mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH7-8；
S5、饲料添加剂配制：将步骤S2、S3和S4得到的微藻A、微藻B和微藻C分别进行干燥，离心后，55℃-60℃烘干，按照微藻A、微藻B和微藻C的质量比为50-60：25-35：20-30进行混合，得到无抗饲料添加剂。
优选地，步骤S1所述的微藻选在小球藻、栅藻和螺旋藻中的一种。本发明培养的淡水微藻来自于驯化后的自养型淡水微藻，可于各大藻种保藏中心或市售获得，如小球藻、栅藻和螺旋藻等，可在藻种保藏中心获得。
优选地，步骤S2所述的改性铁皮石斛粉末具体由如下步骤得到：将石斛粉末烘干至恒重后磨粉，过60-80目筛，加入无水乙醇，缓慢加入去离子水，去除上清液，烘干至恒重，获得改性铁皮石斛粉末。
改性铁皮石斛粉末由如下步骤制备得到：石斛粉末经过处理后，粉碎成粉末，并经过100目的筛网，置于托盘中于电热恒温干燥烘箱105℃杀青30min，随后调整烘箱温度至55℃-60℃烘干至恒重，取出磨粉，过60-80目筛，然后进行纳米化处理，将粉末加入无水乙醇(1g粉末溶入50mL无水乙醇)，逐步缓慢加入去离子水，直到加入与无水乙醇等量的去离子水后停止，然后9000rpm后离心，去除上清液，55℃-60℃烘干至恒重，获得纳米石斛粉末，收集于粗口试剂瓶中备用。
优选地，步骤S1所述的光照培养条件为：每天震荡3-4次，培养温度为20℃-30℃，光照强度为3000-4500Lux，培养5-7天。
优选地，步骤S3所述的板栗壳-改性高岭土采用如下步骤制备：将偏高岭土、氧化钙、硅酸钠和板栗壳均匀混合后得到混合粉末，按混合粉末与水的质量比为8-12：1的量加入水粘合后，烘干，再进行煅烧，冷却过筛，得到板栗壳-改性高岭土。
进一步优选，按混合粉末与水的质量比为10：1的量加入水粘合后，烘干，再500℃煅烧2h，冷却后过100目，得到板栗壳-改性高岭土。
改性高岭土主要用于增加微藻反应时的吸收能力，另外增加超声的刺激效果，板栗壳可以提高微藻的吸附能力，提供一定的碳源。板栗经过清洗后，晾干，然后通过研磨机或手动研磨，研磨时间30min，把板栗壳粉碎为100目的粉末，待用。
所述的板栗壳-改性高岭土，以质量份数计，包括如下组分：偏高岭土65-75份，氧化钙5-7份，硅酸钠3-5份，板栗壳8-12份。偏高岭土可直接购买，或者采用高岭土经900℃煅烧3h后获得偏高岭土。进一步优选，板栗壳-改性高岭土，以质量份数计，包括如下组分：偏高岭土70份，氧化钙6份，硅酸钠4份，板栗壳10份。
优选地，还包括步骤S6、对步骤S5得到的无抗饲料添加剂进行超微粉碎，得到微藻粉；将载体与微藻粉混合，载体选自脱脂米糠、麸皮、砻糠和玉米芯粉的一种以上，载体与微藻粉的质量比为3-5：2-3。
用高速气流粉碎机对步骤S5得到的无抗饲料添加剂进行超微粉碎，气流工作压力0.8MPa，分选频率40-60Hz，80％过80目筛，得到小球藻粉。烘干载体的水分要在10％以下，粉碎细度在30～80目之间。如果载体选择脱脂米糠、麸皮、砻糠和玉米芯粉，脱脂米糠、麸皮、砻糠和玉米芯粉的质量比为50：10：20：20。载体的作用是保持小球藻的功能成分的稳定。采用高速、密封的混合机，将两者混合，要求机内残留物不超过0.3％。混合机的加料顺序是先放载体，然后加进小球藻粉，载体与小球藻粉的质量比为3-5：2-3，混合时间10～15分钟/批。进一步优选，载体与小球藻粉的质量比为5：3，混合时间10分钟/批。
计量装袋时，要求质量精度标准到0.1-0.5，封口严密，无漏料，附有产品质量检验合格证，注明适用对象为水禽、推荐添加量为5-20kg/吨。
本发明还保护通过上述制备方法得到的具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂。
本发明还保护上述无抗饲料添加剂在改善水禽免疫力与肠道中的应用。
更具体的是将上述无抗饲料添加剂以质量分数0.5％-2％的比例加入到水禽基础日粮中。
本发明指的水禽指生活在水中或近水处禽类的总称，包括鸭、鹅、鸿雁、灰雁等以水面为生活环境的禽类动物(其中，迁徙水鸟包括天鹅、雁鸭类和三种鹤：丹顶鹤、白枕鹤、蓑羽鹤)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过不同的培养方式获得不同成分的小球藻藻体，混合使用可以达到以下效果：(1)具有较高的营养价值，富含的藻蛋白、高度不饱和脂肪酸是优良的饲料营养补充；(2)十种多糖与多肽成分不但是营养来源，还是可以直接刺激水禽的肠道结构，并通过改善肠道的形态与微环境；(3)微藻成分具有的特殊小分子物质可以塑造肠道微生物的变化。
2、本发明通过三种不同的培养方法，收获的藻体具有一定的特性的产物，通过本发明的技术，可以达到定向改善水禽肠道结构、菌群结构的目标。
附图说明
图1为实施例1采用藻蛋白强化培养阶段所获得的小球藻A与对比例1普通培养的小球藻的蛋白含量比较图，其中BG111培养基指普通培养，营养液A培养指采用藻蛋白强化培养；
图2为实施例1采用藻脂类强化培养阶段所获得的小球藻B与对比例2普通培养的小球藻的脂类含量比较图，其中BG111培养基指普通培养，营养液B培养指藻脂类强化培养；
图3为实施例1采用改性铁皮石斛得到的小球藻A与对比例2采用未改性铁皮石斛得到的小球藻A藻体生长比较图；
图4为实施例1采用改性铁皮石斛获得小球藻A与对比例2采用未改性铁皮石斛得到的小球藻A的蛋白含量比较图；
图5为实施例1采用藻脂类强化培养阶段(B组)所获得的小球藻与对比例3未采用改性高岭土得到的小球藻的脂类含量比较图，其中BG111培养基指普通培养；
图6为不同的小球藻组分的抗氧化能力比较图；
图7为实验例1实验鸭子中回肠的长度，其中1代表ck组，2代表A组，3代表B组，4代表C组；
图8为实验例1四组实验组微生物的差别(CK，A，B，C)；
图9为实验例1四组实验组乳酸杆菌数量对比图；
图10为实验例1四组实验组乳酸杆菌种对比图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，视为可以通过常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。下述实施例中蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为市购。
下述实施例中，改性的铁皮石斛粉末由如下步骤制备得到：石斛粉末经过处理后，粉碎成粉末，并经过100目的筛网，置于托盘中于电热恒温干燥烘箱105℃杀青30min，随后调整烘箱温度至55℃-60℃烘干至恒重，取出磨粉，过70目筛，然后进行纳米化处理，将粉末加入无水乙醇(1g粉末溶入50mL无水乙醇)，逐步缓慢加入去离子水，直到加入与无水乙醇等量的去离子水后停止，然后9000rpm后离心，去除上清液，55℃-60℃烘干至恒重，获得纳米石斛粉末备用。
板栗壳-改性高岭土由如下步骤制备得到：将偏高岭土、氧化钙、硅酸钠和板栗壳均匀混合后得到混合粉末，按混合粉末与水的质量比为10：1的量加入水粘合后，烘干，再500℃煅烧2h，冷却后过100目筛，得到板栗壳-改性高岭土。板栗经过清洗后，晾干，然后通过研磨机或手动研磨，研磨时间30min，把板栗壳粉碎为100目的粉末，待用。
板栗壳-改性高岭土，以质量份数计，包括如下组分：偏高岭土70份，氧化钙6份，硅酸钠4份，板栗壳10份。
实施例1：
一种无抗饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
S1、小球藻的预培养：将小球藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为4000Lux(一般需要培养5-7天)，当藻液的光密度值OD达到650后，离心分离，小球藻均分成三份进行培养；
A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux(培养4-6天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，收获小球藻A。
A1培养基成分为：改性的铁皮石斛粉末70mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，有光培养条件为：培养温度25℃，光照强度6500Lux，培养24h，60rpm震荡培养；无光培养条件为：150rpm震荡培养，每隔24h更换一次光线的开关，并在暗培养时加入脉冲超声波培养，参数如下：22KHz，25瓦功率下，以30s超声，30s停止为周期，在超声下培养15min，每天2次，培养6天后，收获小球藻B。
A2培养基成分为：板栗壳-改性高岭土150mg/L，NaNO3 150mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S4、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，培养条件为：避光，150rpm震荡培养，培养36h后，测定生物量增加至300mg/L以上，再培养36h，得到微藻C；
A3培养基成分为：葡萄糖150mg/L，海藻酸钠125mg/L，NH4Cl 150mg/L，KH2PO460mg/L，K2HPO4100 mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S5、饲料添加剂配制：将步骤S2、S3和S4得到的小球藻A、小球藻B和小球藻C分别进行干燥，离心后，55℃-60℃烘干，按照小球藻A、小球藻B和小球藻C的质量比为55：30：25进行混合，得到无抗饲料添加剂。
对比例1：
小球藻的培养：将小球藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为4000Lux，培养12天；A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
将实施例1培养的小球藻A和小球藻B分别进行蛋白含量和脂类含量测试，与对比例1常规培养的小球藻进行蛋白含量和脂类含量测试，如图1和图2所示，采用藻蛋白强化培养阶段(A组)所获得的小球藻蛋白含量比普通培养的小球藻的蛋白更多，显示培养基改动的必要性。采用藻蛋白强化培养阶段(B组)所获得的小球藻脂类含量比普通培养的小球藻的脂类更多，显示培养基改动的必要性。
对比例2：
与实施例1相同，不同之处在于，步骤S2中A1培养基成分为：铁皮石斛粉末70mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
如图3和图4所示，改性的铁皮石斛粉末比不改性的铁皮石斛粉末能进一步促进小球藻的生长与黏附性，生长可以提高20％-30％(以叶绿素a计算)，同时能促进蛋白质的合成量，提高促生的效率，改性的石斛能促进藻蛋白的合成。
对比例3：
与实施例1相同，不同之处在于，步骤S3中A2培养基成分为：高岭土150mg/L，NaNO3150mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH7-8。
如图5所示，改性高岭土的加入可以改善藻类生长的聚集，增加板栗壳对藻体的附着性能。在高岭土的矿物学、物理和化学的主要性质及其结构特点的基础上，结合高岭土表面改性、无机包覆提升藻类脂类的累积量。
对比例4：
一种无抗饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
S1、小球藻的预培养：将小球藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为4000Lux(一般需要培养5-7天)，当藻液的光密度值OD达到650后，离心分离，小球藻均分成两份进行培养；
A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux(培养4-6天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，收获小球藻A。
A1培养基成分为：改性的铁皮石斛粉末70mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S3、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，培养条件为：避光，150rpm震荡培养，培养36h后，测定生物量增加至300mg/L，再培养36h，得到微藻C；
A3培养基成分为：葡萄糖150mg/L，海藻酸钠125mg/L，NH4Cl 150mg/L，KH2PO460mg/L，K2HPO4100 mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S4、饲料添加剂配制：将步骤S2和S3得到的小球藻A和小球藻C分别进行干燥，离心后，55℃-60℃烘干，按照小球藻A和小球藻C的质量比为55：25进行混合，得到无抗饲料添加剂。
对比例5：
一种无抗饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
S1、小球藻的预培养：将小球藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为4000Lux(一般需要培养5-7天)，当藻液的光密度值OD达到650后，离心分离，小球藻均分成三份进行培养；
A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux(培养4-6天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，收获小球藻A。
A1培养基成分为：改性的铁皮石斛粉末70mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，有光培养条件为：培养温度25℃，光照强度6500Lux，培养24h，60rpm震荡培养；无光培养条件为：150rpm震荡培养，每隔24h更换一次光线的开关，并在暗培养时加入脉冲超声波培养，参数如下：22KHz，25瓦功率下，以30s超声，30s停止为周期，在超声下培养15min，每天2次，培养6天后，收获小球藻B。
A2培养基成分为：板栗壳-改性高岭土150mg/L，NaNO3 150mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S4、饲料添加剂配制：将步骤S2和S3得到的小球藻A和小球藻B分别进行干燥，离心后，55℃-60℃烘干，按照小球藻A和小球藻B的质量比为55：30进行混合，得到无抗饲料添加剂。
将小球藻A、小球藻B、小球藻C、实施例1(A+B+C)、对比例4(A+C)、对比例5(A+B)进行抗氧化测试，小球藻蛋白质抗溶血率测试方法(测试方法参见纳雨农等，金柚幼果黄酮对AAPH诱导红细胞氧化损伤的保护作用，现代食品科技，2022，38(2)：36-45)：小球藻蛋白对AAPH诱导的红细胞溶血活性的抑制程度，让红细胞在测试中收到AAPH诱导的破坏而破裂溶血，加入小球藻蛋白后进行保护与抑制，最后与没有添加的对照组进行比较，得出哪一个添加方式更加能保护红血球，说明其抗氧化保护机体的能力的大小。
测试结果如图6所示，对比不同组分的小球藻组分，实施例1中小球藻A、小球藻B、小球藻C三种组分共同作用，抗氧化能力最强(即实施例1)，该组别准备用于下述无抗饲料的配方。
实施例2：
一种无抗饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
S1、小球藻的预培养：将小球藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，每天震荡3次，培养温度为20℃，光照强度为4500Lux(一般需要培养5-7天)，当藻液的光密度值OD达到600后，离心分离，小球藻均分成三份进行培养；
A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3次，培养温度为20℃，光照强度为6000Lux(培养4-6天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，收获小球藻A。
A1培养基成分为：改性的铁皮石斛粉末100mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3次，培养温度为30℃，光照强度为4500Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，有光培养条件为：培养温度30℃，光照强度6000Lux，培养18h，60rpm震荡培养；无光培养条件为：150rpm震荡培养，每隔18h更换一次光线的开关，并在暗培养时加入脉冲超声波培养，参数如下：22KHz，25瓦功率下，以30s超声，30s停止为周期，在超声下培养10min，每天2次，培养7天后，收获小球藻B。
A2培养基成分为：板栗壳-改性高岭土100mg/L，NaNO3 100mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S4、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3次，培养温度为20℃，光照强度为6000Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，培养条件为：避光，150rpm震荡培养，培养24h后，测定生物量增加至200mg/L，再培养48h，得到微藻C；
A3培养基成分为：葡萄糖100mg/L，海藻酸钠100mg/L，NH4Cl 100mg/L，KH2PO460mg/L，K2HPO4100 mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S5、饲料添加剂配制：将步骤S2、S3和S4得到的小球藻A、小球藻B和小球藻C分别进行干燥，离心后，55℃-60℃烘干，按照小球藻A、小球藻B和小球藻C的质量比为60：25：30进行混合，得到无抗饲料添加剂。
实施例3：
一种无抗饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
S1、小球藻的预培养：将小球藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为30℃，光照强度为3000Lux(一般需要培养5-7天)，当藻液的光密度值OD达到700后，离心分离，小球藻均分成三份进行培养；
A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为30℃，光照强度为4500Lux(培养4-6天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，收获小球藻A。
A1培养基成分为：改性的铁皮石斛粉末50mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为20℃，光照强度为6000Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，有光培养条件为：培养温度20℃，光照强度7000Lux，培养30h，震荡培养；无光培养条件为：150rpm震荡培养，每隔30h更换一次光线的开关，并在暗培养时加入脉冲超声波培养，参数如下：22KHz，25瓦功率下，以30s超声，30s停止为周期，在超声下培养20min，每天2次，培养5天后，收获小球藻B。
A2培养基成分为：板栗壳-改性高岭土200mg/L，NaNO3 200mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S4、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份小球藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡4次，培养温度为30℃，光照强度为4500Lux(培养2-4天)，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，培养条件为：避光，150rpm震荡培养，培养48h后，测定生物量增加至350mg/L，再培养24h，得到微藻C；
A3培养基成分为：葡萄糖200mg/L，海藻酸钠150mg/L，NH4Cl 200mg/L，KH2PO460mg/L，K2HPO4100 mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8。
S5、饲料添加剂配制：将步骤S2、S3和S4得到的小球藻A、小球藻B和小球藻C分别进行干燥，离心后，55℃-60℃烘干，按照小球藻A、小球藻B和小球藻C的质量比为50：35：20进行混合，得到无抗饲料添加剂。
实施例4：
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤S6、对步骤S5得到的无抗饲料添加剂进行超微粉碎，得到微藻粉；将载体与微藻粉混合10分钟即得饲料添加剂，载体包括脱脂米糠、麸皮、砻糠和玉米芯粉，脱脂米糠、麸皮、砻糠和玉米芯粉的质量比为50：10：20：20，载体与微藻粉的质量比为5：3。
实验例1：
通过实施例4所获得的饲料添加剂进行鸭子喂养试验。实验选取420只刚出壳龄樱桃谷肉鸭(公鸭，0d)分为4个处理组，每组设6个重复组，每组15只鸭。4个处理组处理如下：(1)基础日粮(玉米-豆粕型饲粮)ck组；(2)基础日粮+0.5％饲料添加剂A组；(3)基础日粮+1％饲料添加剂B组；(4)基础日粮+2％饲料添加剂C组。各处理组中饲料添加剂等量取代豆粕方式添加，各处理日粮能值、氨基酸等营养水平一致。
试验结束前1天，在每个重复栏中选取2只接近平均体重的试验鸭，翅静脉采血5mL，3000rpm离心15min，分离血清-80℃分装冻存。
试验鸭采血后放血致死，打开腹腔，迅速采集肝脏样品，分离十二指肠、空肠和回肠组织，度量长度并称重，采集回肠中段1cm，10％福尔马林保存，并采集回肠样品液氮中速冻后-80℃保存待测。
检测结果如图7、表1和表2所示：
表1喂食饲料添加剂后鸭子肠道绒毛高度、宽度和表面积
注：同行数据无肩标或肩标有相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05)，肩标小写字母完全不同者表示差异显著(P<0.05)。下同。
表2小球藻对42日龄肉鸭回肠抗氧化酶
由图7、表1和表2得出，进食不同含量饲料添加剂的无抗饲料后，鸭子的肠道结构发生明显变化，其中小肠绒毛高度、宽度与表面积均有显著变化，其中以1％((3)组)与2％((4)组)组别最为明显。显示该配方能改善鸭子的肠道外观形态。
图7表示经过喂食实验，有效改善鸭子的回肠长度，该长度显示鸭子有较好的吸收能力，提高营养吸收的效率。表2显示，经过喂食后，对鸭子回肠抗氧化能力有所提高。
同时，对喂食后肠道微生物的的组成与功能进行了测定，发现喂食饲料添加剂后的组别的微生物会产生特定的响应，从微生物组成而言，喂食添加剂后的群落明显杆菌的组成与对照组(CON)差别巨大(图8)，其中乳酸杆菌类均有明显的提高，显示该调节剂可以促进肠道中乳酸杆菌的繁殖与定值(图9和图10)，乳酸杆菌在B、C组数量比其他对照组要高。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、微藻的预培养：将微藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，使用光照培养，当藻液的光密度值OD达到600-700后，离心将微藻均分成三份进行培养；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，收获微藻A；
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，培养5-7天后，收获微藻B；
S4、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，测定生物量增加至200-350mg/L，再培养24-48h，得到微藻C；
S5、饲料添加剂配制：将步骤S2、S3和S4得到的微藻A、微藻B和微藻C分别进行干燥，混合，得到无抗饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、微藻的预培养：将微藻藻种经无菌操作接种于灭过菌的A0培养基中，然后使用光照培养，当藻液的光密度值OD达到600-700后，离心将微藻均分成三份进行培养；
A0培养基成分为：NH4Cl 600mg/L，KH2PO470 mg/L，K2HPO4 88mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S2、藻蛋白强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3-4次，培养温度为20℃-30℃，光照强度为4500-6000Lux，培养4-6天，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A1培养基，再培养2-4天后，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，收获微藻A；
A1培养基成分为：改性的铁皮石斛粉末50-100mg/L，NH4Cl 700mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S3、藻脂类强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3-4次，培养温度为20-30℃，光照强度为4500-6000Lux，培养2-4天，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上时，离心后，将藻体转入A2培养基，采用无光-有光交替培养，有光培养条件为：培养温度20℃-30℃，光照强度6000-7000Lux，培养18-30h，震荡培养；无光培养条件为：150rpm震荡培养，每隔18-30h更换一次光线的开关，并在暗培养时加入脉冲超声波培养，在超声下培养10-20min，每天1-2次，培养5-7天后，收获微藻B；A2培养基成分为：板栗壳-改性高岭土100-200mg/L，NaNO3 100-200mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4 100mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S4、藻发酵强化培养：将步骤S1得到的一份微藻加入A0培养基，然后使用光照培养，每天震荡3-4次，培养温度为20℃-30℃，光照强度为4500-6000Lux，培养2-4天，测定氨氮去除率、总氮去除率分别为90％以上和70％以上，离心后，将藻体转入A3培养基，进行发酵培养，培养条件为：避光，150rpm震荡培养，培养24-48h后，测定生物量增加至200-350mg/L，再培养24-48h，得到微藻C；
A3培养基成分为：葡萄糖100-200mg/L，海藻酸钠100-150mg/L，NH4Cl 100-200mg/L，KH2PO4 60mg/L，K2HPO4100 mg/L，MgSO47H2O 80mg/L，CaCl2 50mg/L，水1000mL，pH 7-8；
S5、饲料添加剂配制：将步骤S2、S3和S4得到的微藻A、微藻B和微藻C分别进行干燥，离心后，55℃-60℃烘干，按照微藻A、微藻B和微藻C的质量比为50-60：25-35：20-30进行混合，得到无抗饲料添加剂。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的微藻选自小球藻、栅藻和螺旋藻中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述的改性铁皮石斛粉末具体由如下步骤得到：将石斛粉末烘干至恒重后磨粉，过60-80目筛，加入无水乙醇，缓慢加入去离子水，去除上清液，烘干至恒重，获得改性铁皮石斛粉末。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的光照培养条件为：每天震荡3-4次，培养温度为20℃-30℃，光照强度为3000-4500Lux，培养5-7天。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的板栗壳-改性高岭土采用如下步骤制备：将偏高岭土、氧化钙、硅酸钠和板栗壳均匀混合后得到混合粉末，按混合粉末与水的质量比为8-12：1的量加入水粘合后，烘干，再进行煅烧，冷却过筛，得到板栗壳-改性高岭土。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤S6、对步骤S5得到的无抗饲料添加剂进行超微粉碎，得到微藻粉；将载体与微藻粉混合，载体选自脱脂米糠、麸皮、砻糠和玉米芯粉的一种以上，载体与微藻粉的质量比为3-5：2-3。
8.权利要求1所述的制备方法得到的具有改善水禽免疫力与肠道的无抗饲料添加剂。
9.权利要求8所述的无抗饲料添加剂在改善水禽免疫力与肠道中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，是将权利要求9所述的无抗饲料添加剂以质量分数0.5％-2％的比例加入到水禽基础日粮中。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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