CN110327358B - 海参磷脂在制备抑制神经炎症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了海参磷脂在制备抑制神经炎症药物中的应用。本发明研究发现，海参磷脂提取物具有抑制LPS诱导的BV2细胞神经炎症反应的作用，海参磷脂提取物能显著抑制BV2细胞增殖，降低NO的释放以及抑制p‑P38的激活，在防治神经炎症相关的阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关产品的开发方面具有广阔的市场应用价值和前景。

Description

海参磷脂在制备抑制神经炎症药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物新用途领域，特别是涉及海参磷脂在制备抑制神经炎症药物中的应用。
背景技术
神经退行性疾病作为全球老年人群体发病率较高的神经疾病之一，其中包括两种较为常见和研究较为深入的疾病，即阿尔茨海默病和帕金森病。前者会使人产生大脑萎缩、记忆力下降、判断力变差等症状，后者会产生运动迟缓、身体静止性震颤等症状。近年来，越来越多的研究表明，神经退行性疾病往往伴随着神经炎症。脑内胶质细胞的激活、血脑屏障被破坏和外周免疫细胞进入大脑实质内是神经炎症的表现。
小胶质细胞是脑内的主要免疫细胞，小胶质细胞的激活是神经炎症的主要表现。王钰的研究表明，在阿尔茨海默病和帕金森病患者的变性神经元周围有大量受到激活的小胶质细胞堆积于此；马文培等论述了神经炎症因子造成神经炎症加剧，抑制了脑组织细胞外淀粉样肽β的清除，从而导致阿尔茨海默病恶化；余先凤研究表明小胶质细胞标记物和促炎因子在帕金森病患者的消化道神经系统的表达有所增加。研究证明，小胶质细胞株(BV2)受刺激作用后，会从静息状态转变为激活状态，并伴随有形态学和免疫功能的改变，激活p-P38通路，并释放出不同种类的炎症介质，如NO，进一步加剧神经炎症，引发神经细胞的损伤，从而诱发多种神经系统相关疾病。
研究发现，阿尔茨海默病的发生与大脑中磷脂含量降低和磷脂代谢活动异常均有密切联系，并且磷脂对于提高人体的免疫力与再生力具有重要的作用。海参可食部分含有大量的磷脂，目前的研究显示，海参(Sea cucumber)作为一种海洋生物，一直被看作是具有高营养价值的食品。国内外不乏对海参提取物的免疫调节作用的研究。目前已有较多人对海参多糖和皂苷提取物的抗疲劳、降血压、抑制肿瘤等功能做了较多的研究。在免疫学方面，邱鹏新等证明了黑海参多糖对淀粉样蛋白诱导的皮质神经元损伤有保护作用；李媛媛等发现海参胶可显著改善胰岛素抵抗小鼠的慢性炎症；Minjung Song等研究了刺参提取物对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞具有抗炎的作用；宋佳佳等研究了血红素氧合酶-1介导海参蛋白肽对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应有抑制作用。
但是目前没有人发现海参磷脂在制备神经炎症药物方面的用途。
发明内容
本发明的目的是提供海参磷脂在制备抑制神经炎症的药物中的应用。
本发明通过实验发现，海参磷脂具有抑制LPS诱导的BV2细胞神经炎症反应的作用，海参磷脂在治疗神经炎症相关疾病方面具有良好的前景，在防治神经炎症相关的阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关产品的开发方面具有广阔的市场价值。
本发明还提供海参磷脂在制备预防和/或治疗由神经炎症导致的神经退行性疾病药物中的应用。
作为可选择的实施方式，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症等。
本发明还提供海参磷脂在制备抑制脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞激活药物中的应用。
作为可选择的实施方式，所述小胶质细胞包括BV2细胞。
本发明还提供海参磷脂在制备抑制小胶质细胞增殖的药物中的应用。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂为可溶于乙醇的海参磷脂。
作为可选择的实施方式，所述可溶于乙醇的海参磷脂在海参磷脂乙醇混合溶液中的浓度为10ng/mL～100ng/mL。细胞实验中，通常将药物溶解在液体中，根据浓度大小来确定剂量。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂为不溶于乙醇但可溶于水的海参磷脂。
作为可选择的实施方式，所述不溶于乙醇但可溶于水的海参磷脂在海参磷脂水溶液中的浓度为10ng/mL～100ng/mL。
本发明还提供海参磷脂在制备抑制小胶质细胞NO释放的药物中的应用。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂为可溶于乙醇的海参磷脂时，所述海参磷脂在海参磷脂乙醇混合液中的浓度≥100ng/mL。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂为不溶于乙醇但可溶于水的海参磷脂时，所述海参磷脂在海参磷脂水溶液中的浓度≥100ng/mL。
本发明还提供海参磷脂在制备抑制磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38(p-P38)表达的药物中的应用。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂为不溶于乙醇但可溶于水的海参磷脂。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂在海参磷脂水溶液中的浓度＜100ng/mL，优选为5-50ng/mL，具体可以为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL等。
本发明还提供一种用于抑制神经炎症的药物，含有海参磷脂。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂为不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂。
作为可选择的实施方式，所述海参磷脂的提取方法包括如下步骤：
1)一次丙酮除油：取海参粉末，加入丙酮，浸泡后，固液分离，将固液分离所得液体旋转蒸发，得到干品；将固液分离所得固体继续用乙醇浸泡提取，再次固液分离，将所得液体旋转蒸发，得到磷脂粗品，合并所述干品以及磷脂粗品，得到混合物。
2)二次丙酮除油：取步骤1)所得的混合物，采用丙酮萃取，得到不溶解于丙酮的部分为精制磷脂组分，取所述精制磷脂组分，加入乙醇，固液分离，得到可溶于乙醇的海参磷脂以及不溶于乙醇的海参磷脂。
作为可选择的实施方式，所述步骤1)中，所述海参粉末与所述丙酮的体积之比为1：1-3。
作为可选择的实施方式，所述步骤1)中，所述固体与所述乙醇的体积之比为1：2-4，所述乙醇为无水乙醇。
作为可选择的实施方式，所述步骤1)中，乙醇浸泡温度为35-45℃，重复浸泡提取3-5次。
作为可选择的实施方式，所述步骤2)中，所述混合物与所述丙酮的用量之比为1g：1-8mL，优选为1g：3-5mL，更优选为1g：4mL。
作为可选择的实施方式，所述步骤2)中，萃取温度为30-70℃，优选为40-60℃，更优选为50℃。
作为可选择的实施方式，所述步骤2)中，每次萃取时间为50-70min，优选为60min。
作为可选择的实施方式，所述步骤2)中，萃取次数为2-4次，优选为3次。
作为可选择的实施方式，所述药物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
作为可选择的实施方式，所述药物的剂型为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。以上各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明具有以下有益效果：
本发明发现，海参磷脂提取物具有抑制LPS诱导的BV2细胞神经炎症反应的作用，且低浓度的SCW具有最佳的抑制效果。因此，海参磷脂提取物在治疗神经炎症相关疾病方面具有良好的前景，在防治神经炎症相关的阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关产品的开发方面具有广阔的市场应用价值和前景。
附图说明
图1显示为实施例中海参磷脂提取的工艺流程图。
图2显示为丙酮用量对磷脂得率的影响图(254nm)。
图3显示为温度对磷脂得率的影响图(254nm)。
图4显示为糙海参不同组分的TLC图像(254nm)。
图5显示为Al2O3柱分离后磷脂组分的TLC图像(254nm)。
图6显示为SCE对细胞活性的影响结果图。
图7显示为SCW对细胞活性的影响结果图。
图8显示为SCE对LPS刺激后的细胞的增长活性的影响图。
图9显示为SCW对LPS刺激后的细胞的增长活性的影响图。
图10显示为Griess法测定BV2细胞释放于细胞上清液中NO的含量图。
图11显示为细胞上清液中p-P38免疫荧光图。
图12显示为免疫荧光法检测细胞上清液中p-P38表达的结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
研究显示炎症与多种神经退行疾病和精神系统疾病的发生、发展有关。为研究海参磷脂提取物在抑制神经炎症方面的药效功能，本发明以脂多糖(LPS)激活小胶质细胞(BV2)的神经炎症模型为研究对象，探究海参磷脂提取物是否具有抗神经炎症的作用。方法如下：LPS诱导的激活BV2细胞作为神经炎症模型，MTT法检测细胞的增殖活率，Griess法检测NO的释放水平，细胞免疫荧光法检测p-P38的活性。结果显示，和对照组相比，LPS激活BV2细胞，细胞增殖活性增加，释放的NO增多，激活p-P38。而和LPS组相比，海参磷脂提取物能显著抑制BV2细胞增殖，降低NO的释放以及抑制p-P38的激活。实验结果发现，海参磷脂提取物能有效抑制LPS诱导的BV2细胞产生的神经炎症反应，并且可能是通过P38通路抑制神经炎症。
本发明利用细菌脂多糖LPS激活BV2细胞诱导的炎症模型，来检测海参磷脂提取物是否具有抗神经炎症的作用，通过MTT法检测其细胞活率，通过Griess法检测细胞上清NO水平，用免疫荧光法检测p-P38的激活，从细胞形态学、细胞增殖活性、NO的释放和信号传导通路探究海参磷脂提取物对神经炎症的影响及可能机制，为海参磷脂在神经炎症相关脑疾病防治产品的研发奠定基础。
实施例1
1、实验方法
1.1BV2细胞培养(复苏、传代、计数、种板)
1.1.1复苏
(1)从液氮低温保存罐中小心取出保存着小胶质细胞BV2细胞系(购自上海中科院细胞库，货号CBP60922)冻存管，快速浸入提前预热的37℃恒温水浴锅中，快速摇晃冻存管，使冻存管中的冻存液在1min内融化。
(2)提前用紫外杀菌灯照射超净操作台10min左右，对其进行消毒并点燃酒精灯。
(3)在无菌操作台以无菌操作将细胞冻存悬液移入10mL离心管中，加入10倍悬液体积以上的完全培养基，以1000rpm/min的速度于低温离心机中离心5min。
(4)弃去上清液，加入含10％胎牛血清DMEM高糖型完全培养基缓慢重悬底部细胞，并对其中的BV2细胞进行细胞计数。
(5)根据所计细胞数，将细胞悬液转移至在无菌培养皿中调整BV2细胞浓度，将稀释后的BV2细胞悬液分装至无菌细胞培养瓶中，置于细胞培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养。
1.1.2传代
(1)提前用紫外杀菌灯完成超净操作台的消毒工作并燃酒精灯。
(2)从细胞培养箱中取出细胞状态良好且细胞密度达到80％以上的细胞培养瓶，快速置于无菌操作台的环境当中。
(3)将镊子在酒精灯的上焰旁灼烧消毒，放凉后用镊子撕开装有0.25％的胰蛋白酶的离心管的封口膜和装有完全培养基的培养瓶的封口膜。
(4)将细胞培养瓶的盖子在酒精灯的上焰旁消毒，旋开培养瓶盖，将培养瓶口也在酒精灯的上焰旁消毒，注意不要靠的太近，以免将培养瓶熔化。将细胞培养上清液顺着没有贴壁细胞的一侧倾入废液缸。
(5)吸取1ml 0.25％的胰蛋白酶到细胞培养瓶里，平放培养瓶并对其进行缓慢摇晃，使胰蛋白酶与细胞充分接触，进行消化处理。在显微镜下观察细胞状态，直到观察到少量BV2细胞漂浮在细胞液中时，指示细胞消化结束，用移液枪迅速吸干净培养瓶中的胰蛋白酶。
(6)吸取3mL完全培养基到培养瓶中，用移液枪缓慢吹打贴壁的BV2细胞，将所有贴壁细胞吹下并与完全培养基混合均匀。用自动细胞计数仪对培养基中的BV2细胞进行细胞计数。
(7)根据所需的BV2细胞的数量，将其分装到新的培养瓶里，每个培养瓶里的细胞数目达到102即可。将含有BV2细胞的培养基的体积最终调整为5mL。
1.1.3细胞计数
(1)吸取原倍数的细胞悬液。移取20μL的细胞悬液，与等体积的台盼蓝试剂1：1体积在0.2mL无菌离心管中混合均匀，吸取20mL BV2细胞与台盼蓝的混合匀液，缓慢注入洁净的细胞计数板，使其充满计数板的孔，防止留有气泡。
(2)把细胞计数板正面朝上，插入自动细胞计数仪中，进行细胞计数。每个视野计数1次，每个样品计数3个视野，得到平均值。视野当中不能出现台盼蓝沉淀，因此吸取台盼蓝试剂时避免摇晃试剂瓶或将移液枪头触碰到试剂瓶底，防止吸入沉淀。
1.1.4细胞种板
(1)根据细胞计数仪的检测结果，计算出原倍BV2细胞液所需要稀释的倍数，在无菌培养皿中按比例加入一定量完全培养基与一定量的细胞匀液，使其稀释至细胞浓度为2.5×104个/ml。
(2)使用移液枪转移相应的细胞匀液至孔板中，注意每次转移之前都需要缓慢吹打细胞或者摇晃均匀，以防细胞贴壁导致种板不均匀。
1.2海参磷脂的提取
1.2.1材料
糙海参由深圳市太丰东方海洋生物科技有限公司提供，取用量为13kg，破碎制成粉末；其它试剂均为国产分析纯。
1.2.2仪器
WFH-201B暗箱式紫外透射反射分析仪，上海精密仪器仪表有限公司；KH-300ZDE超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；RE-6000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；CA-1116A冷却水循环装置，EYELA；MZ2CNT化学隔膜真空泵，Vacuubrand；ME204E梅特勒天平，METTLER TOLEDO；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Agilent 7890A 气相色谱仪：CTC顶空进样器，FID检测器和Chemstation工作站。
图1显示为海参磷脂提取的工艺流程图。
1.2.3冷丙酮初次除油及磷脂粗品的制备
海参粉末先用4℃预冷丙酮浸泡过夜，丙酮的体积为海参粉末体积的2倍，抽滤，滤液在50℃下水泵减压旋干，得到初步除去脂肪的物料，称重；滤渣用3倍体积无水乙醇浸泡过夜，40℃超声30min，连续提取4次，4次提取的滤液合并旋干称重，得到磷脂粗品。
1.2.4丙酮二次除油及精制磷脂的制备
丙酮脱去磷脂粗品脂肪成分的最重要的影响因素包括温度、料液比。因此采取萃取时间60min，提取3次，①30℃条件下，研究丙酮用量对磷脂得率的影响，料液比设置分别为1g：1mL、1g：2mL、1g：4mL、1g：6mL、1g：8mL，得出料液比为1g:4mL、超声30min浸泡丙酮除油率最高；②料液比为1g：4mL的条件下，研究温度对磷脂得率的影响，温度设置分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，得出50℃丙酮除油率最高。最后确定丙酮二次脱油的最优条件如下：料液比为1g：4mL、50℃、60min、提取3次。丙酮二次溶解的油脂成分经TLC点板分析与第一次溶解的油脂成分一致，将二者合并得到丙酮提取物(Fr.1)；丙酮不溶解部分为精制磷脂组分(Fr.2)。精制磷脂组分用95％乙醇溶解过滤旋干(上层析柱备用)4℃储存(Fr.2-2)，不溶解部分(Fr.2-1)旋干4℃储存。
1.2.5乙醇可溶部分磷脂的分离
取1000g的氧化铝，在120℃条件下活化3h左右，取出，冷却至室温，加入洗脱溶液(90％乙醇溶液)浸泡，搅拌，使其充分溶胀。采用湿法装柱，将层析柱垂直装置，以自动部分收集器作为洗脱液的接收器。将约20g的Fr.2-2溶解在90％乙醇溶液中，0.22μm滤膜过滤。当溶液流至接近氧化铝上层表面时，立即用配制好的洗脱溶剂连续洗脱。调节洗脱液流速(0.3mL/min)，利用自动部分收集器每10mL换管收集。在紫外分光光度计254nm条件下，检测收集到的液体，根据紫外检测结果，将在254nm条件下吸光谱图相近的液体收集在一起，将最终得到的3个组分Fr.2-2-1、Fr.2-2-2、Fr.2-2-3用旋转蒸发器浓缩至膏状，真空干燥。
1.2.6GC测定磷脂提取物中的丙酮溶剂残留量
称取图1中Fr.2物料，即精制磷脂，取用量为1.0g，精密称定，置25mL量瓶中，加纯化水溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置20mL顶空瓶中，加盖，密封，用于气相测定。取丙酮适量，精密称定，加水制成每1mL约含2.5μg的对照品储备液，精密量取对照品储备液20mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置20mL顶空瓶中，加盖，密封，作为对照品溶液。色谱柱：HP-INNOWAX(30m×0.320mm，0.50μm)；柱温：采用程序升温，初始温度40℃，保持6min，以25℃·min-1速率升温至220℃，保持5min；进样口温度220℃；检测器温度250℃；氮气为载气，流速为2.0mL/min；顶空进样瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30min，进样体积为1.5mL，分流比为5∶1。
结果表明，3批样品中丙酮残留量为0.23±0.01％，少于中国药典2005年版对溶媒丙酮规定的残留限度：不超过0.5％。
图2显示为丙酮用量对磷脂得率的影响图(254nm)：30℃条件下，料液比分别为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8，磷脂粗品得率分别为68.2％，68.5％，68.7％，68.7％，68.7％，丙酮组分TLC结果如图6所示，考虑节省溶剂，料液比为1:4(m/v)(30℃)条件下丙酮除油率最高。
图3显示为温度对磷脂得率的影响图(254nm)。料液比为1:4(m/v)条件下，提取温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，磷脂粗品得率分别为68.2％，69.3％，70.2％，70.3％，70.1％，得出50℃时磷脂粗品得率最高，丙酮组分TLC结果如图7所示。因此，最后选择丙酮二次脱油的最优条件为：料液比1/4、50℃、60min、提取3次。
图4显示为糙海参不同组分的TLC图像(254nm)。丙酮二次溶解的油脂成分经TLC点板分析与第一次溶解的油脂成分一致，将二者合并得到丙酮提取物(Fr.1)；丙酮不溶解部分为精制磷脂组分(Fr.2)。精制磷脂组分用95％乙醇溶解，其中不溶解部分根据文献推测主要为卵磷脂(Fr.2-1)，溶解部分过滤(Fr.2-2)待上柱进一步分离精制，其TLC谱图如图8所示。
图5显示为Al2O3柱分离后磷脂组分的TLC图像(254nm)。
图4和图5中，氯仿：甲醇＝5:1是指体积比，氯仿甲醇混合液是作为层析分离液使用，层析的样品就是图1中的物料Fr.2-2。
如图5所示的TLC谱图，组分Fr.2-2经氧化铝层析柱分离得到3个组分Fr.2-2-1、Fr.2-2-2和Fr.2-2-3，组分Fr.2-2-1为主要磷脂精细组分，推测主要为脑磷脂。
1.2.7分组
步骤1.2.4中，精制磷脂组分用95％乙醇溶解过滤旋干(上层析柱备用)，4℃储存，为乙醇可溶部分(Sea cucumber phospholipid extract ethanol-soluble fraction，SCE)，即图1中的物料Fr.2-2；不溶解部分旋干，4℃储存，为乙醇不溶部分(Sea cucumberphospholipid extract water-soluble fraction，SCW)，即图1中的物料Fr.2-1。将BV2细胞分为对照组(Control team，CT)、模型组(LPS)、药物对照组(SCE或SCW)、药物加模型组(SCE或SCW+LPS)；海参磷脂提取物最终浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL，此处的浓度为海参磷脂提取物早细胞悬液中的浓度。LPS最终浓度为100ng/mL。
SCE为可溶于乙醇的海参磷脂，进行细胞实验时，将SCE溶于少量的乙醇中，除菌过滤后，再加入细胞悬液中，制成含有所需浓度海参磷脂的细胞悬液；SCW为可溶于水但不溶于乙醇的海参磷脂，进行细胞实验时，将SCW溶于少量水中，除菌过滤后，再加入细胞悬液中，制成含有所需浓度海参磷脂的细胞悬液。
1.3形态观察
用倒置显微镜观察细胞培养瓶和细胞培养板中BV2细胞生长状况和形态特征的变化。
1.4MTT法测细胞活率
(1)取一瓶生长状况优良的BV2细胞，倒掉培养液后用0.25％的胰蛋白酶消化，消化完毕将胰酶吸取干净，加入3mL完全培养基将贴壁细胞完全吹打下来并混匀。
(2)用细胞计数法计算细胞悬液中细胞的浓度，在无菌培养皿中按比例加入一定量完全培养基与一定量的细胞悬液，使其稀释至细胞浓度为2.5×104个/ml。
(3)每孔添加100μL稀释后的细胞悬液种植到两块96孔细胞培养板中，每块中间共种60个孔，每块最外围一圈用无菌液体补满，放置在细胞培养箱中培养12h左右至细胞贴壁生长。
(4)分组：第1块96孔板设置CT组、模型组(LPS)、药物对照组(SCE)、药物加模型组(LPS+SCE)；第2块96孔板设置CT组、模型组(LPS)、药物对照组(SCW)、药物加模型组(LPS+SCW)。LPS的最终浓度为100ng/mL；海参磷脂提取物两部分最终浓度梯度安排相同，分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL。
1.4.1MTT法测定LPS(脂多糖)对BV2细胞的活性影响
(1)按照实验分组情况，LPS模型组加入1μL终浓度为100ng/mL的LPS。将细胞培养板放置在细胞培养箱中培养24h左右。
(2)向每个含有BV2细胞的孔中分别添加10μL MTT试剂，置于细胞培养箱继续培养4h。
(3)用移液枪靠着孔壁将细胞培养液缓缓吸出，不能吸出已贴壁的BV2细胞。
(4)向每个含有BV2细胞的孔中分别添加150μL二甲基亚砜试剂，将细胞培养板置于摇床上以100rpm/min的速度摇晃约10min，直至将培养板置于浅色背景下肉眼观察到底部紫色结晶完全溶解。
(5)利用酶标仪，调整为490nm的波长检测96孔细胞培养板每个孔的吸光度值。
(6)最终，利用吸光度值计算BV2细胞存活率。计算方法：
细胞存活率＝(OD药物组－OD空白组)/(OD对照组－OD空白组)×100％。
1.4.2MTT法测定海参磷脂提取物对BV2细胞的活性影响
(1)按照实验分组情况，药物对照组中分别加入1μL不同浓度的海参磷脂提取物。将细胞培养板放置在细胞培养箱中培养24h左右。
(2)余下步骤与“MTT法测定LPS脂多糖对BV2细胞的活性影响”的步骤(2)到步骤(6)相同。
1.4.3MTT法测定海参磷脂提取物对受LPS刺激的BV2细胞的活性影响
(1)按照实验分组情况，药物加LPS模型组中加入1μL不同浓度的海参磷脂提取物。将细胞培养板放置在细胞培养箱中培养1h，进行预防处理。
(2)按照实验分组情况，每孔分别加入1μL 100ng/mL的LPS。将细胞培养板放置在细胞培养箱中培养24h。
(3)余下步骤与“MTT法测定LPS脂多糖对BV2细胞的活性影响”的步骤(2)到步骤(6)相同。
1.5Griess法测定NO的含量
(1)取一瓶生长状况良好的BV2细胞，消化后吸取一定量的细胞悬液，调整细胞悬液的细胞浓度，与完全培养基在无菌培养皿中稀释配制成2.5×104个/mL的细胞悬液。
(2)分组：CT组、药物加LPS组(SCE+LPS、SCW+LPS)、LPS组；海参磷脂提取物SCE与SCW最终浓度安排相同，分别10ng/mL、100ng/mL。
(3)将稀释后的细胞悬液种板于96孔板，每孔添加100μL细胞悬液，在细胞培养箱中培养12h左右。
(4)按照实验分组情况，药物加LPS组中加入1μL不同浓度的海参磷脂提取物。将细胞培养板放置在细胞培养箱中培养1h，进行预防处理。
(5)预防处理之后，药物加LPS组与LPS组每孔分别加入1μL 100ng/mL的LPS，于细胞培养箱培养24h。
(6)取50μL细胞培养上清液按照相同的分组情况加入一块新的96孔板中。其中要预留一列孔，每孔加入分别50μL试剂盒所给的不同浓度的标准品。孔板每孔加入50μLGriess A试剂，于水平摇床反应10min。每孔再加50μL Griess B试剂，于水平摇床反应10min。于酶标仪540nm波长处检测其吸光度。全程需要避光。
(7)根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，将各样品数值带入标准曲线计算得出其上清液的NO含量。
1.6免疫荧光法测定BV2细胞中p-P38的激活
(1)通过细胞计数法计算生长状况良好的BV2细胞，将其稀释制成2.5×104个/mL的细胞悬液。
(2)分组：CT组、LPS组、药物加LPS组(SCE+LPS、SCW+LPS)；SCE与SCW最终浓度安排相同，分别10ng/mL、100ng/mL。
(3)每孔添加400μL稀释后的细胞悬液种植到8孔细胞培养板中，共种满8孔。放置在细胞培养箱中培养12h左右至细胞贴壁生长。
(4)按照实验分组情况，药物加LPS组中加入4μL不同浓度的海参磷脂提取物。将细胞培养板放置在细胞培养箱中培养1h，进行预防处理。
(5)预防处理之后，药物加LPS组与LPS组每孔分别加入4μL终浓度为100ng/mL的LPS，于细胞培养箱培养24h。
(6)去掉细胞培养液，稍作沥干，用1×PBS静置清洗3次，每次5min。
(7)去掉PBS，稍作沥干，每孔加入300μL左右的4％PFA多聚甲醛，浸没贴壁细胞即可。在室温静置1h。
(8)去掉4％PFA，稍作沥干，用0.2％Triton-X(用PBS稀释)静置清洗3次，每次5min。
(9)去掉0.2％Triton-X，稍作沥干，每孔加入200μL现配的一抗溶液，于4℃冰箱过夜。
(10)去掉一抗溶液，稍作沥干，用0.2％Triton-X静置清洗3次，每次5min。
(11)去掉0.2％Triton-X，稍作沥干，每孔加入200μL现配的二抗溶液，室温避光保存2h以上。
(12)去掉二抗溶液，用0.2％Triton-X静置清洗3次，每次5min。第三次洗完后再加少量0.2％Triton-X浸没。全程避光。
(13)于荧光显微镜拍片。
1.7数据统计方法
免疫荧光图利用ImageJ软件处理并得到数据。本实验所有数据利用GraphpadPrism 7统计软件进行处理，各组数据均以mean±SEM表示，两组间的数据利用t检验进行比较，以P<0.05表示有统计学差异。
2、结果与分析
2.1MTT法测定海参磷脂提取物对BV2细胞的活性影响
在测定海参磷脂提取物对BV2细胞活性影响的分组中，SCE与SCW的最终浓度安排相同，最终浓度梯度分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL。
从图6中(该图中，***P＜0.001vs.CT)可以发现，与CT组相比较，SCE在1000ng/mL的浓度下对BV2细胞的生长有明显的抑制作用(P<0.001)，表明SCE高浓度对BV2细胞具有一定毒性，在1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL的浓度下无明显作用(P>0.05)。
从图7可发现，与CT组相比较，SCW在1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的浓度下对BV2细胞的生长均无明显作用(P>0.05)，表明在本实验剂量条件下SCW对BV2细胞不具有明显毒性。
2.2MTT法测定LPS对BV2细胞的活性影响
从图8(该图中，***P<0.001vs.CT；#P<0.05vs.LPS)与图9(该图中，***P＜0.001vs.CT；##P＜0.01vs.LPS；#P＜0.05vs.LPS)中可以看出，与CT组相比较，LPS在100ng/mL浓度下对BV2细胞有明显的增殖作用(P<0.001)，表明100ng/mL的LPS能够激活BV2细胞使其活性增加。
2.3MTT法测定海参磷脂提取物对受LPS刺激的BV2细胞的活性影响
从图8可知，与LPS组相比较，SCE浓度为10ng/mL和100ng/mL这2个浓度剂量能显著抑制LPS诱导下的BV2细胞的增殖(P＜0.05)，而浓度为1ng/mL和1000ng/mL的浓度剂量没有明显的抑制作用。结果表明，SCE在10ng/mL到100ng/mL之间能够抑制LPS诱导的BV2的增殖并使其增殖率接近正常组细胞，而低于10ng/mL则不能到达抑制作用。当浓度过高时，由于海参磷脂本身的毒性作用，也不能达到抑制作用。
从图9可知，与LPS组相比较，SCW浓度为10ng/mL和100ng/mL这个两个浓度剂量显著抑制了LPS诱导下的BV2细胞的激活作用(P＜0.001)；在浓度为1000ng/mL的浓度剂量抑制了LPS诱导下的BV2细胞的激活作用并具有统计学差异(P＜0.05)；而浓度为1ng/mL的浓度剂量下对LPS诱导下的BV2细胞的激活无显著抑制作用。表明在此实验条件下，SCW在10ng/mL到1000ng/mL之间能够抑制LPS诱导的BV2细胞的增殖，低于10ng/mL则不能达到抑制作用。
2.4Griess法测定NO的含量
从图10(图10中，***P＜0.001vs.CT；##P＜0.01vs.LPS；#P＜0.05vs.LPS)可知，与CT组相比，LPS组上清液中NO的含量显著升高(P<0.001)。和LPS组相比，药物加LPS组(SCE+LPS)中SCE在100ng/mL的浓度下能明显抑制LPS诱导的BV2细胞释放NO于细胞上清液并具有显著性差异(P<0.01)，但是SCE在10ng/mL的浓度下对BV2细胞NO的释放无明显抑制作用；比较LPS组NO的释放量，药物加LPS组(SCW+LPS)中SCW在100ng/mL的浓度下对BV2细胞NO释放的抑制作用具有统计学意义(P<0.05)，但是SCW在10ng/mL的浓度下对BV2细胞NO的释放无明显抑制作用。表明在此实验条件下，100ng/mL浓度的海参磷脂提取物能有效地抑制LPS诱导BV2细胞NO的释放，低于100ng/mL浓度的海参磷脂提取物对抑制NO的释放作用不显著。
2.5免疫荧光法测定BV2细胞中p-P38的激活
结合图11和图12(图12中，***P<0.001vs.CT；#P<0.05vs.LPS)可知，与CT组相比较，LPS组细胞中p-P38的表达显著增加(P＜0.001)；与LPS组相比较，SCE在10ng/mL和100ng/mL的浓度剂量并未明显抑制BV2细胞p-P38的激活(P>0.05)，由于图6的结果显示，SCE在1000ng/mL时有一定毒性，所以不再使用1000ng/mL这一高剂量进行本次实验。低浓度的SCE(即≤100ng/mL)不抑制P38蛋白，可能SCE通过其它的因素来抑制炎症；而SCW在10ng/mL的浓度下对BV2细胞p-P38的激活有抑制作用，并具有统计学差异(P<0.05)。通过上述比较，在相同的实验条件下，SCE对p-P38激活的抑制作用无显著效应。而10ng/mL浓度的SCW则能显著地抑制LPS诱导的BV2细胞p-P38的激活。
3、总结
本文以LPS激活的小胶质细胞株BV2细胞作为神经炎症模型，发现海参磷脂提取物可抑制LPS对BV2细胞的激活，降低BV2细胞的增殖率、NO的释放量以及p-P38的激活。BV2细胞作为中枢神经系统免疫防御的第一道防线，当受到来自外界的刺激或有细胞凋亡，BV2细胞就会被激活并介导炎症反应，发挥了重要作用。利用LPS诱导的BV2细胞神经炎症模型以及其各生物学指标的检测已广泛用于神经炎症相关研究中。在本实验研究中，为了证明海参磷脂提取物能够有效抑制BV2细胞的激活作用，运用MTT法测定并对比了BV2细胞的活性。当LPS刺激BV2细胞时所造成的细胞应激反应，BV2细胞数量会受到激活并因此而增加，这与王俊所做的LPS诱导的BV2细胞神经炎症模型的结果相符。本实验结果表明海参磷脂提取物能够抑制LPS诱导的BV2细胞增殖，但SCE浓度过高时会具有毒性。
NO可参与调节神经系统的多种生理过程以及实现其生理功能，但是当神经细胞受到外来刺激而产生神经炎症，使细胞形成并释放过量的NO时，就会产生神经毒性作用。研究通过Griess法检测细胞上清液中NO的含量，测定海参磷脂提取物是否具有抑制BV2细胞释放NO的功能。结果表明，高浓度的海参磷脂提取物能有效地抑制BV2细胞中NO的形成与释放，这可能是海参磷脂抑制LPS诱导的BV2细胞增殖的原因之一。
P38(MAPK)作为一种细胞信号传导通路，通过细胞应激和炎症刺激将其激活，磷酸化形成p-P38。当LPS刺激BV2细胞时，能够活化P38(MAPK)，磷酸化形成p-P38，而合成NO的关键酶iNOS诱导型一氧化氮合酶可作为P38(MAPK)通路的下游位点，并受其控制合成NO。利用免疫荧光法检测BV2细胞中p-P38的表达，LPS模型组所表达的p-P38的量显著多于CT组表达的p-P38的量，这与刘德祥所做的LPS诱导的BV2细胞神经炎症模型p-P38的表达情况相符。对比LPS模型组，添加了低浓度的SCW的药物加LPS模型组表达的p-P38的量有所减少，具有统计学差异，但添加了SCE的药物加LPS模型组表达的p-P38的量没有变化。从本实验结果可以看出，药物加LPS模型组中SCW相较于SCE能更显著地抑制BV2细胞中p-P38的激活，并且低浓度的SCW具有更好的效果。
海参磷脂中主要包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，有研究显示PC对阿尔茨海默病有预防的功效，并且磷脂中所包含的二十碳五烯酸(EPA)与二十二碳六烯酸(DHA)具有神经保护的作用。因此海参磷脂提取物对LPS诱导的BV2细胞炎症反应的抑制作用可能与这些成分有关。
综上所述，海参磷脂提取物具有抑制LPS诱导的BV2细胞神经炎症反应的作用。并且经过筛选，低浓度的SCW具有最佳的抑制效果。通过上述结果可以表明，海参磷脂提取物在治疗神经炎症相关疾病方面具有良好的前景。海参磷脂提取物在防治神经炎症相关的阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关产品的开发方面具有广阔的市场价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂在制备预防和/或治疗由神经炎症导致的神经退行性疾病药物中的应用，其特征在于，所述海参磷脂的提取方法包括如下步骤：
1)一次丙酮除油：取海参粉末，加入丙酮，浸泡提取后，固液分离，将固液分离所得液体旋转蒸发，得到干品；将固液分离所得固体继续用乙醇浸泡提取，再次固液分离，将所得液体旋转蒸发，得到磷脂粗品，合并所述干品以及磷脂粗品，得到混合物；
2)二次丙酮除油：取步骤1)所得的混合物，采用丙酮萃取，得到不溶解于丙酮的部分，即为精制磷脂组分，加入乙醇，固液分离，得到可溶于乙醇的海参磷脂以及不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂在制备抑制脂多糖诱导的小胶质细胞激活药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂在制备抑制小胶质细胞增殖的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂在制备抑制小胶质细胞NO释放的药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂在制备抑制磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38表达的药物中的应用。
7.一种用于抑制神经炎症的药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述应用中所述不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂。
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