CN110538185A - 海参磷脂在制备防治炎症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供海参磷脂在制备防治炎症药物中的应用。本发明发现海参磷脂对非感染性炎症反应具有改善作用，海参磷脂通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集和提高SOD的表达达到改善炎症的效果。本发明提示海参磷脂在非感染性炎症相关性疾病防治产品的开发方面具有广阔的市场价值。

Description

海参磷脂在制备防治炎症药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及海参磷脂在制备预防或治疗非感染性炎症的药物中的应用。
背景技术
炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御性反应，巨噬细胞的聚集与吞噬过程在炎症反应中具有重要作用。炎症反应通常被认为是宿主和免疫细胞之间稳态的失衡，这种失衡将导致疾病的产生。炎症反应涉及到多种疾病的发生和发展过程，如感染、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、癌症等。因此有效控制炎症的发生与发展引起众多学者的关注。
在炎症的发生过程中，最关键的是炎症细胞和巨噬细胞被激活，接着，这些细胞将会产生各种介质，其中最为典型的是ROS、NO和TNF-α等，引发进一步的炎症反应和细胞损伤。许多慢性非感染性炎症疾病与巨噬细胞中NO的增加有关，因此NO的浓度可作为间接判断炎症反应的重要指标。在正常的情况下，炎症对于人体是有利的，但是随着炎症介质的不断增加，炎症加剧，使得机体内细胞受损，从而会对机体产生破坏性的影响。炎症与氧化应激存在密切关系，氧化应激是炎症反应的一个组成部分，是指在机体收到刺激时，体内高活性分子(如活性氧自由基、活性氮自由基)过量产生，超出机体的清除能力，使得机体内氧化与抗氧化状态失衡，从而引起机体的氧化损伤。
炎症与氧化应激存在着相互作用。在机体受到刺激时，造成氧化应激，从而激活NF-Kβ，上调TNF-α等多种炎性因子的表达，诱导产生大量的促炎因子，释放一系列的炎症介质。炎症介质激活中性粒细胞等炎症细胞，使其处于激活状态，使得炎症发生。另一方面，SOD(超氧化物歧化酶，Superoxide dismutase)是体内催化超氧阴离子为过氧化氢的限速酶，具有较强的清除氧自由基、过氧化氢的能力。SOD活性下降与机体氧化应激时产生大量氧自由基，使得SOD短时清除氧自由基的效率下降，大量活性自由基堆积，炎症加剧。
引起炎症的原因有感染性和非感染性两种情况，感染性疾病一般采用对因治疗，即通过抗生素减少或消灭病原体，减少病原体刺激，减弱炎症反应；而非感染性炎症一般采用对症治疗，即通过抗炎药物抑制过度的炎症反应对身体的损伤。当前临床用于防治非感染性炎症的药物大多来自于人工化学合成，包括甾体抗炎药和非甾体抗炎药，在抑制炎症症状时常伴有一定副作用，尤其是对于慢性炎症诱发的相关疾病的防治，长期服用抗炎药而带来的严重副作用常导致身体的严重伤害。因此具有抗炎的物质，尤其是天然无毒副作用的具有抗炎活性的物质在非感染性炎症相关疾病防治药物的开发上具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有抗炎药物的缺陷和不足，提供海参磷脂在制备预防或治疗非感染性炎症的药物中的应用。本发明提示海参磷脂对非感染性炎症具有改善作用，其通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集和提高SOD的表达来实现，进而提示海参磷脂在制备预防或治疗非感染性炎症的药物方面具有广阔的市场价值。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供海参磷脂在制备预防或治疗非感染性炎症的药物中的应用。
可选地，所述非感染性炎症包括自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病等。
可选地，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、哮喘等。
可选地，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(即老年痴呆症)、帕金森病等。
本发明还提供海参磷脂在制备抑制中性粒细胞聚集的药物中的应用。
本发明还提供海参磷脂在制备抑制巨噬细胞聚集的药物中的应用。
本发明还提供海参磷脂在制备提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)表达的药物中的应用。
可选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
可选地，所述药物的剂型为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。以上各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
可选地，所述海参磷脂为不溶于乙醇且可溶于水的海参磷脂。
可选地，所述海参磷脂提取自海参，优选地，所述海参磷脂的提取方法包括如下步骤：
1)一次丙酮除油：取海参粉末，加入丙酮，浸泡后，固液分离，将固液分离所得液体旋转蒸发，得到干品；将固液分离所得固体继续用乙醇浸泡提取，再次固液分离，将所得液体旋转蒸发，得到磷脂粗品，合并所述干品以及磷脂粗品，得到混合物。
2)二次丙酮除油：取步骤1)所得的混合物，采用丙酮萃取，得到不溶解于丙酮的部分为精制磷脂组分，取所述精制磷脂组分，加入乙醇，固液分离，得到的固体即为不溶于乙醇的海参磷脂。
可选地，所述步骤1)中，所述海参粉末与所述丙酮的体积之比为1：1-3。
可选地，所述步骤1)中，所述固体与所述乙醇的体积之比为1：2-4，所述乙醇为无水乙醇。
可选地，所述步骤1)中，乙醇浸泡温度为35-45℃，重复浸泡提取3-5次。
可选地，所述步骤2)中，所述混合物与所述丙酮的用量之比为1g：1-8mL，优选为1g：3-5mL，更优选为1g：4mL。
可选地，所述步骤2)中，萃取温度为30-70℃，优选为40-60℃，更优选为50℃。
可选地，所述步骤2)中，每次萃取时间为50-70min，优选为60min。
可选地，所述步骤2)中，萃取次数为2-4次，优选为3次。
本发明具有以下有益效果：
本发明发现海参磷脂对炎症具有改善作用，具体通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集和提高SOD的表达达到改善炎症的效果。本发明提示海参磷脂在非感染性炎症防治产品的开发方面具有广阔的市场价值。
附图说明
图1显示为实施例中海参磷脂提取的工艺流程图。
图2显示为丙酮用量对磷脂得率的影响图(254nm)。
图3显示为温度对磷脂得率的影响图(254nm)。
图4显示为糙海参不同组分的TLC图像(254nm)。
图5显示为Al2O3柱分离后磷脂组分的TLC图像(254nm)。
图6显示为本发明实施例的繁殖箱实物图。
图7显示为本发明实施例的正常发育72hpf的AB品系斑马鱼幼鱼。
图8显示为本发明实施例的加入PTU处理后的发育72hpf的AB品系斑马鱼幼鱼。
图9显示为本发明实施例中各浓度海参磷脂提取物处理的幼鱼(正常发育至72h)的情况。
图10显示为本发明实施例中不同海参磷脂提取物浓度处理幼鱼的存活率统计图。
图11显示为本发明实施例中100μg/mL海参磷脂提取物浓度处理幼鱼的存活率统计图。
图12显示为本发明实施例中炎症持续时间中性染色结果图。
图13显示为本发明实施例中中性红染色法反映海参磷脂提取物预防硫酸铜诱导的巨噬细胞聚集结果图。
图14显示为本发明实施例中中性红染色法反映海参磷脂提取物减轻硫酸铜诱导的巨噬细胞聚集结果图。
图15显示为本发明实施例中苏丹黑染色法硫酸铜反映海参磷脂提取物预防硫酸铜诱导的中性粒细胞聚集的结果图。
图16显示为本发明实施例中LPS炎症模型构建中性红染色结果图。
图17显示为本发明实施例中海参磷脂提取物预防LPS诱导的巨噬细胞聚集的结果图。
图18显示为本发明实施例中海参磷脂提取物预防LPS诱导的中性粒细胞聚集的结果图。
图19显示为本发明实施例中蛋白质标准曲线图。
图20显示为本发明实施例中SOD活性统计结果图。
图21显示为本发明实施例中亚硝酸盐浓度统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
海参自古以来被认为是一种名贵的滋补食品和药材，位列“海八珍”之首，具有较高的食用和药用价值，现代医学显示海参具有免疫调节等多种功效。海参含有许多具有重要的生物学活性的物质，如海参多糖，海参磷脂和海参脑苷脂等。其中，海参磷脂是具有较高生物活性的物质之一。海参体壁含有丰富的磷脂，海参磷脂以磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺为主。磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)又名卵磷脂，是磷脂的重要组成部分。研究表明不同来源的磷脂具有提高机体免疫力、抗氧化、调节脂质代谢、增强脑功能等活性。然而海参磷脂对炎症相关疾病中的影响尚不确切。
斑马鱼作为近年来的新兴模式动物，将其用作生物科学方面的研究已受到广泛关注，它已成为继大小鼠之后的第三种实验模式动物。斑马鱼具有繁殖速度快，周期短，子代多，胚胎透明和用药量低等特点，特别适用于重复性高的实验。同时，斑马鱼基因与人类基因的同源性高达85％，其传导通路也与人类十分相似，生理功能和生理结构也十分接近哺乳动物。随着转基因、诱导突变和反义morpholino knockdown及活体成像等技术的应用，使斑马鱼成为在基因组上研究人类炎症免疫疾病相关的病理生理学及在活体内进行高通量药物筛选的良好模式生物。同时，斑马鱼可以使用浸透的方式给药，十分适合一些复杂成分的活性筛选，特别是一些难以提取的药物。因此选择斑马鱼作为模式动物具有一定的科学性，有利于后期与人类退行性行为的预防与治疗相联系。
参考文献包括：
1.刘晓金,华利,高燕,王平,于宗渊,赵渤年.斑马鱼模式研究现状及应用情况进展[J].辽宁中医药大学学报,2016,18(04):125-127。
2.张勇,贺剑辉,刘洪翠,劳乔聪,李春启.斑马鱼在药物临床前毒理学研究中的应用进展及现状[J].中国药理学与毒理学杂志,2013,27(03):482-483。
3.杨丽玲,余林中.斑马鱼——一种可用于中药抗炎免疫药理研究的模式生物[J].中药药理与临床,2012,28(02):175-178。
目前，实验室常用的诱导动物炎症模型的方法很多，其中在斑马鱼上主要有硫酸铜和脂多糖。硫酸铜，是一种常见的化学试剂。许多科研实验利用硫酸铜特异性化学损伤侧线毛细胞，构造炎症病症，取得了明显的效果。以下实施例利用硫酸铜来构建非感染性炎症模型。
参考文献包括：
4.彭维兵，周玲晓，付先军，何秋霞，王振国，刘可春.基于斑马鱼模型的昆海姜辛汤组分配伍的抗炎作用研究.山东科学，2017,2(30)：37-41。
5.谢佩.基于斑马鱼炎症模型筛选的中药活性成分药理效应与作用机制研究.南京医科大学，学位论文，2019。
6.王荣春，韩利文，何秋霞，陈锡强，刘可春.利用斑马鱼模型研究姜黄素抗炎的分子机制.中国药理学与毒理学杂志,2016,10(30):1031。
脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性菌细胞壁的毒性成分内毒素的主要成分，被认为是细菌不死的灵魂，具有广泛而复杂的生物学效应。革兰氏阴性菌所释放的LPS是炎症反应和天然免疫的高效活化分子，是炎症反应最强的刺激剂。脂多糖的化学本质是由糖类和脂质部分类脂A组成。LPS一般是多聚体的形式存在，但LPS的有效激活形式是单聚体，在水溶液中，LPS可以缓慢水解成单聚体，然而生物体中的脂多糖结合蛋白可以加剧LPS解离成单体，暴露其内部结构，使Toll样受体4(TLR4)结合，活化细胞内的信号转导通路，诱发炎症。因此，LPS广泛应用于构造炎症的疾病模型的相关研究。以下实施例还利用LPS来构建非感染性炎症模型。
参考文献包括：
7.周俊怡，周严严，边宝林，王宏洁，司南，杨健，赵海誉.LPS诱导斑马鱼炎症实热模型构建及脂质生物标志物筛选研究.浙江中医药大学学报.2018，10(42)：782-789。
8.倪立颖，邹娅雪，付晓婷，段德麟，许加超，高昕.利用LPS诱导胚胎期斑马鱼炎症模型研究羊栖菜多酚抗炎机制[J/OL].食品工业科技.http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20190529.1356.014.html。
9.Lee S H,Yang H W,Ding Y,et al.Anti-inflammatory effects ofenzymatic hydrolysates of velvet antler in RAW264.7 cells in vitro andzebrafish model[J].EXCLI Journal.2015,14:1122-1132。
以下实施例中，海参磷脂提取物的制备方法参见申请号为2019107756578的中国专利申请《海参磷脂在制备抑制神经炎症药物中的应用》，具体为该专利中的乙醇不溶相SCW。
海参磷脂的提取方法如下：
1、材料
糙海参由深圳市太丰东方海洋生物科技有限公司提供，取用量为13kg，破碎制成粉末；其它试剂均为国产分析纯。
2、仪器
WFH-201B暗箱式紫外透射反射分析仪，上海精密仪器仪表有限公司；KH-300ZDE超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；RE-6000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；CA-1116A冷却水循环装置，EYELA；MZ2CNT化学隔膜真空泵，Vacuubrand；ME204E梅特勒天平，METTLER TOLEDO；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Agilent 7890A气相色谱仪：CTC顶空进样器，FID检测器和Chemstation工作站。
图1显示为海参磷脂提取的工艺流程图。
3、冷丙酮初次除油及磷脂粗品的制备
海参粉末先用4℃预冷丙酮浸泡过夜，丙酮的体积为海参粉末体积的2倍，抽滤，滤液在50℃下水泵减压旋干，得到初步除去脂肪的物料，称重；滤渣用3倍体积无水乙醇浸泡过夜，40℃超声30min，连续提取4次，4次提取的滤液合并旋干称重，得到磷脂粗品。
4、丙酮二次除油及精制磷脂的制备
丙酮脱去磷脂粗品脂肪成分的最重要的影响因素包括温度、料液比。因此采取萃取时间60min，提取3次，①30℃条件下，研究丙酮用量对磷脂得率的影响，料液比设置分别为1g：1mL、1g：2mL、1g：4mL、1g：6mL、1g：8mL，得出料液比为1g:4mL、超声30min浸泡丙酮除油率最高；②料液比为1g：4mL的条件下，研究温度对磷脂得率的影响，温度设置分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，得出50℃丙酮除油率最高。最后确定丙酮二次脱油的最优条件如下：料液比为1g：4mL、50℃、60min、提取3次。丙酮二次溶解的油脂成分经TLC点板分析与第一次溶解的油脂成分一致，将二者合并得到丙酮提取物(Fr.1)；丙酮不溶解部分为精制磷脂组分(Fr.2)。精制磷脂组分用95％乙醇溶解过滤旋干(上层析柱备用)4℃储存(Fr.2-2)，不溶解部分(Fr.2-1)旋干4℃储存。
5、乙醇可溶部分磷脂的分离
取1000g的氧化铝，在120℃条件下活化3h左右，取出，冷却至室温，加入洗脱溶液(90％乙醇溶液)浸泡，搅拌，使其充分溶胀。采用湿法装柱，将层析柱垂直装置，以自动部分收集器作为洗脱液的接收器。将约20g的Fr.2-2溶解在90％乙醇溶液中，0.22μm滤膜过滤。当溶液流至接近氧化铝上层表面时，立即用配制好的洗脱溶剂连续洗脱。调节洗脱液流速(0.3mL/min)，利用自动部分收集器每10mL换管收集。在紫外分光光度计254nm条件下，检测收集到的液体，根据紫外检测结果，将在254nm条件下吸光谱图相近的液体收集在一起，将最终得到的3个组分Fr.2-2-1、Fr.2-2-2、Fr.2-2-3用旋转蒸发器浓缩至膏状，真空干燥。
6、GC测定磷脂提取物中的丙酮溶剂残留量
称取图1中Fr.2物料，即精制磷脂，取用量为1.0g，精密称定，置25mL量瓶中，加纯化水溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置20mL顶空瓶中，加盖，密封，用于气相测定。取丙酮适量，精密称定，加水制成每1mL约含2.5μg的对照品储备液，精密量取对照品储备液20mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置20mL顶空瓶中，加盖，密封，作为对照品溶液。色谱柱：HP-INNOWAX(30m×0.320mm，0.50μm)；柱温：采用程序升温，初始温度40℃，保持6min，以25℃·min-1速率升温至220℃，保持5min；进样口温度220℃；检测器温度250℃；氮气为载气，流速为2.0mL/min；顶空进样瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30min，进样体积为1.5mL，分流比为5∶1。
结果表明，3批样品中丙酮残留量为0.23±0.01％，少于中国药典2005年版对溶媒丙酮规定的残留限度：不超过0.5％。
图2显示为丙酮用量对磷脂得率的影响图(254nm)：30℃条件下，料液比分别为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8，磷脂粗品得率分别为68.2％，68.5％，68.7％，68.7％，68.7％，丙酮组分TLC结果如图6所示，考虑节省溶剂，料液比为1:4(m/v)(30℃)条件下丙酮除油率最高。
图3显示为温度对磷脂得率的影响图(254nm)。料液比为1:4(m/v)条件下，提取温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，磷脂粗品得率分别为68.2％，69.3％，70.2％，70.3％，70.1％，得出50℃时磷脂粗品得率最高，丙酮组分TLC结果如图5所示。因此，最后选择丙酮二次脱油的最优条件为：料液比1/4、50℃、60min、提取3次。
图4显示为糙海参不同组分的TLC图像(254nm)。丙酮二次溶解的油脂成分经TLC点板分析与第一次溶解的油脂成分一致，将二者合并得到丙酮提取物(Fr.1)；丙酮不溶解部分为精制磷脂组分(Fr.2)。精制磷脂组分用95％乙醇溶解，其中不溶解部分根据文献推测主要为卵磷脂(Fr.2-1)，溶解部分过滤(Fr.2-2)待上柱进一步分离精制，其TLC谱图如图8所示。
图5显示为Al2O3柱分离后磷脂组分的TLC图像(254nm)。
图4和图5中，氯仿：甲醇＝5:1是指体积比，氯仿甲醇混合液是作为层析分离液使用，层析的样品就是图1中的物料Fr.2-2。
如图5所示的TLC谱图，组分Fr.2-2经氧化铝层析柱分离得到3个组分Fr.2-2-1、Fr.2-2-2和Fr.2-2-3，组分Fr.2-2-1为主要磷脂精细组分，推测主要为脑磷脂。
7、分组
步骤4中，精制磷脂组分用95％乙醇溶解过滤旋干(上层析柱备用)，4℃储存，为乙醇可溶部分(Sea cucumber phospholipid extract ethanol-soluble fraction，SCE)，即图1中的物料Fr.2-2；不溶解部分旋干，4℃储存，为乙醇不溶部分(Sea cucumberphospholipid extract water-soluble fraction，SCW)，即图1中的物料Fr.2-1。
图1中的物料Fr.2-1，即SCW，为可溶于水但不溶于乙醇的海参磷脂，用于后续的实验中，具体是将SCW溶于去离子水中，除菌过滤后，得到所需浓度的海参磷脂提取物水溶液，进行后续实验。
实施例1
本实验以斑马鱼幼鱼为实验对象，利用硫酸铜和LPS这两种不同的诱导剂对斑马鱼幼鱼构建炎症模型，探究海参磷脂提取物对不同炎症模型的改善作用。通过探究海参对炎症的改善作用，进而降低神经退行性疾病的发生，为海参在炎症相关疾病防治产品的研发提供实验依据。
1、实验材料与方法
1.1实验动物
本实验以正常发育72hpf的AB品系斑马鱼幼鱼为实验对象。雌雄斑马鱼成鱼在光照14h/黑暗10h、27℃恒温循环系统环境下分开饲养，每天2次喂食，一次用颗粒状饵料，另一次用丰年虾。
选取性成熟的雌雄斑马鱼进行交配，在进入暗周期之前将雌雄斑马鱼按1：1或2:1放入繁殖箱(如图6)，加入加热棒，控制温度在27℃。次日早上8:30抽板，10:00左右获得胚胎。将胚胎用养殖水洗净放入无菌6孔板在28.5℃恒温培养箱孵育。当日晚上20:00将养殖水换成0.003％PTU养殖水，每天更换2次，定期观察胚胎发育情况，去除白卵，孵育至72hpf，挑选正常发育的斑马鱼幼鱼备用。注：加入1-苯基-2-硫脲(PTU)可以抑制幼鱼黑色素的生长，使得鱼体透明，有利于后续染色结果的呈现。
图7所示为正常发育72hpf的AB品系斑马鱼幼鱼。
图8所示为加入PTU处理后的发育72hpf的AB品系斑马鱼幼鱼。
由图7和图8可知，加入PTU可以抑制幼鱼黑色素的生长，使得鱼体透明，有利于后续染色结果的呈现。
1.2实验所用试剂和仪器
中性红染液的配制：先将2mg中性红粉末(即NR粉末)加入0.003％PTU养殖水中，配成250μg/mL的母液，然后用养殖水稀释为2.5μg/mL，得到中性红染色液，备用。
苏丹黑染液的配制：先将0.6g苏丹黑粉末(即SB粉末)溶解于200mL的无水乙醇中，通过磁力搅拌，在其充分溶解后再过滤，得到SB备用液，然后在4℃条件下保存。
缓冲液：取16g苯酚溶解于30mL的无水乙醇中，再取0.3g十二水合磷酸氢二钠溶解于100mL的蒸馏水，最后将两液混合。
染色液：取SB备用液与缓冲液以3:2的体积比混合，然后过滤即得染色液。
1.3实验设计
1.3.1海参磷脂提取物毒性实验
海参磷脂提取物浓度设定：1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL，前述各溶液的溶剂为水，溶质为海参磷脂提取物。挑选正常发育至72hpf的斑马鱼幼鱼，应用24孔板，每孔8条鱼。设定实验组(海参磷脂提取物：1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL)和空白对照组(养殖水)，每个浓度4个复孔，在28.5℃的恒温培养箱孵育72h，每24h换液。分别于给药24h、48h、72h统计各实验组斑马鱼死亡数量和观察幼鱼发育情况，并统计每个时间节点的累计死亡率。
1.3.2海参磷脂提取物对硫酸铜炎症的预防与治疗
(1)硫酸铜炎症时间的确定
挑选正常发育至72dpf的斑马鱼幼鱼，转移进入无菌12孔板，每孔8条鱼。设定1个空白对照组和4个模型组。除空白对照外，以渗透的方式，每个模型组加入20μmol/L硫酸铜，空白对照组加入0.003％PTU养殖水，作用时间为1h。造模完成后，将硫酸铜移除，换取0.003％PTU养殖水，并分别于造模后0h、3h、6h、24h进行中性红染色，观察幼鱼炎症的持续情况。
(2)硫酸铜炎症的预防
选取正常发育至72hpf的斑马鱼幼鱼于无菌12孔板，每孔5-6条幼鱼；设置5个实验组，1个空白组和一个模型组，每组三个平行。以渗透方式给药，实验组分别加入相同体积的1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,1μg/mL和10μg/mL的海参磷脂提取物，空白组和模型组加入0.003％PTU养殖水，作用时间为72h,每24h换液一次。
72h后，将海参磷脂提取物或养殖水吸出，实验组与模型组加入2.5μg/mL的硫酸铜溶液，空白对照组则加入0.003％PTU养殖水，作用时间为1h。1h后，将硫酸铜溶液或养殖水吸出，加入中性红染液，避光环境28.5℃恒温培养箱下染色7h后，在体式显微镜下观察结果，并拍照记录。
(3)硫酸铜炎症的治疗
选取正常发育至72hpf的斑马鱼幼鱼于无菌12孔板，每孔5-6条幼鱼，设置4个实验组，1个空白组和一个模型组，每组2个平行。以渗透的方式将20μmol/L的硫酸铜加入实验组和模型组，时间为1h，空白对照组则加入0.003％PTU养殖水。造模一小时后，将硫酸铜全部吸出，模型组和空白组加入0.003％PTU养殖水，实验组分别加入10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL的海参磷脂提取物，作用时间为0.5h。0.5h后，进行中性红染色，解剖镜下观察实验结果。
1.3.3海参磷脂提取物对LPS炎症的预防作用
(1)LPS炎症模型的构建
选取正常发育至72hpf的斑马鱼幼鱼于12孔板中，每孔5-6条鱼，设置一个空白对照组和一个模型组，每组两个平行。以渗透的方式给药，模型组加入0.05mg/mL LPS，空白对照组加入0.003％PTU养殖水，作用时间为72h，每天换液一次。72h后，进行中性红染色7h，在解剖镜下观察实验结果并拍照记录。
(2)海参磷脂提取物对LPS炎症的预防
选取正常发育至72hpf的斑马鱼幼鱼于24孔板中，每孔5-6条鱼，设置5个实验组(1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1μg/mL和10μg/mL)，一个空白对照组，一个模型组，每组4个复孔。除空白对照组外，往每个组加入LPS，使得每个孔的LPS最终浓度为0.05mg/mL，同时，分别加入不同浓度的海参磷脂提取物，使得最终海参磷脂提取物的浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL和10μg/mL，空白对照组则加入0.003％PTU养殖水。海参磷脂提取物与LPS同时作用，时间为72h，每天换液1次。给药完成后，进行中性红和苏丹黑染色，解剖镜下观察结果。
1.4中性红染色观察巨噬细胞聚集情况
每组取适量鱼转移至干净12孔板中，加入2.5μg/mL中性红染液摇晃均匀，，避光环境28.5℃恒温培养箱下染色7h后,利用琼脂糖固定幼鱼，使其处理双眼重合状态，在体式显微镜下观察结果，并拍照记录。
1.5苏丹黑染色观察中性粒细胞聚集情况
每组取适量鱼转移至干净的12孔板中，加入0.16％麻醉剂将幼鱼麻醉后，加入多聚甲醛(PFA)固定过夜。次日，吸出多聚甲醛，用PBST反复冲洗3遍后，加入苏丹黑染液，包上锡纸，在摇床上均匀摇晃避光染色4h。染色完成后，用70％乙醇反复洗脱苏丹黑染液，直至中性粒细胞清晰可见。利用琼脂糖固定幼鱼，使其处于双眼重合状态，观察中性粒细胞的聚集情况，并拍照记录。
1.6 BCA法测定蛋白浓度
总蛋白浓度BCA法测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，根据说明书步骤测定，具体如下：
(1)配制BCA工作液：根据标准品和样品的数量，按试剂A：试剂B＝5:1的体积比配制适量BCA工作液，充分混匀。试剂A、试剂B为购买的试剂盒所提供的名称。
(2)将蛋白标准品(1mg/mL)按0,1,2,4,6,8,10微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加灭菌双蒸水补足到10微升；每个样品取10微升上清液加入96孔板，每个测定2个平行。
(3).向待测样品孔和蛋白标准品加入200微升BCA工作液混匀。
(4)37℃孵育30分钟，冷却至室温。
(5)酶标仪562nm波长下测定吸光度。
(6)制作蛋白标准曲线，根据标准曲线中求出样品浓度。
1.7超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)生化指标的检测，采用总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)，具体如下：
(1)组织样品的准备：
每组取五个样品，每条鱼单独成一个样，将每个样品放入1.5mL的离心管中，每个样品分别加入200μL的SOD样品制备液在冰浴下进行匀浆。匀浆完成后，4℃约12,000g离心3-5分钟，取上清液作为待测样品。
(2)试剂盒的准备：
WST-8/酶工作液的配制：按照每个反应160μL的体积配制适量的WST-8/酶工作液，根据下表1配制WST-8/酶工作液；配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，尽量现配现用。
表1
反应启动工作液的配制：把试剂盒中的反应启动液(40X)溶解后混匀，按照每1μL反应启动液(40X)加入39μL SOD检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。配制好的反应工作液置于4℃或冰浴保存，尽量现配现用。
(3)样品的测定：
按下表2依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作液后充分混匀，加入反应启动液后，反应即开始，可以使用排枪减小各孔反应时间的差距而产生的误差。
表2
样品/标准品 空白对照1 空白对照2 空白对照3
待测样品 20μL - - 20μL
SOD检测缓冲液 - 20μL 40μL 20μL
WST-8/酶工作液 160μL 160μL 160μL 160μL
反应启动工作液 20μL 20μL - -
加入反应启动液后，在培养箱下37℃恒温孵育30分钟。孵育完成后，在450nm测定吸光度。
亚硝酸盐法测定(Griess反应)NO浓度：
一氧化氮(NO)是许多生物系统的重要生理信使和效应分子，包括免疫、神经和心血管组织。由于它参与了这些不同的系统，在生物组织和液体中测定NO的兴趣仍然很强。研究一氧化氮形成的一种方法是测定亚硝酸盐(NO2-)，它是NO的两种主要的、稳定的、非挥发性的分解产物之一。本实验则通过测定亚硝酸盐的含量反应样品中NO的形成情况。
操作步骤：
a.让磺胺溶液和奈德溶液平衡到室温(15-30分钟)。
b.使用96孔板，每个样本取40μL上清液于孔内。
c.使用多通道吸量管,每个样本孔和亚硝酸盐标准曲线系列孔加入40μL磺胺。
d.室温下孵育5-10分钟，避光。
e.使用多通道吸量器,分发40μL NED于所有的孔。
f.室温下孵育5-10分钟，避光。一个紫色/洋红色将立即开始形成。
g.用520nm-550nm之间的滤光片在30分钟内测量吸光度。
1.8数据统计与分析
本实验统计完所有的数据之后，利用Graphpad prism 6.0软件进行图形处理以及数据分析，采用单因素方差(ANOVA)分析。
2.实验结果
2.1海参磷脂提取物毒性实验结果
本实验通过对斑马鱼幼鱼死亡率的统计来判断海参磷脂提取物不同浓度对斑马鱼幼鱼的毒性作用，进而进行浓度的筛选。根据表型观察(如图9)，100μg/mL斑马鱼幼鱼具有明显的畸形出现。存活率结果显示(如图10和图11)，在15h左右，空白对照组与实验组均有小幅度的死亡；随着时间推移，100μg/mL组相较于其他实验组，存活率下降明显；72h,空白对照与1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/ml组最后的存活率基本趋同，100μg/mL组最终的存活率下降幅度最大，存活率最低，则100μg/mL的海参对斑马鱼具有毒性作用。因此选择1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/ml作为后续的实验剂量。
2.2海参磷脂提取物对硫酸铜炎症的预防与治疗实验结果
2.2.1硫酸铜炎症持续时间的确定
如图12所示，根据中性红的染色结果显示，空白组与造模0h染色组对比，在卵黄囊部分(即圈中部位)，模型组巨噬细胞的聚集明显比空白组较多，鱼体整体颜色也比空白组的偏红，说明硫酸铜炎症模型构建成功。造模后3h染色，卵黄囊巨噬细胞的聚集程度相比较造模后0h染色组下降，但与空白组相比仍表现出炎症现象。造模后6h染色，巨噬细胞的聚集持续下降，炎症状态基本消失。因此选择6h内为后续的给药时间。
2.2.2硫酸铜炎症的预防
如图13所示，与空白组相比，模型组斑马鱼脑部巨噬细胞聚集明显，说明炎症模型造模成功。结合脑部和卵黄囊的巨噬细胞聚集情况，10ng/mL和100ng/mL的海参磷脂提取物均有明显的减弱炎症的效果，其中，加入10ng/mL海参磷脂提取物的幼鱼在脑部和卵黄囊的巨噬细胞聚集都比模型组的明显减弱，说明10ng/mL的海参磷脂提取物有较好的预防炎症的效果。
2.2.3硫酸铜炎症的治疗
海参磷脂提取物对硫酸铜炎症巨噬细胞聚集行为的影响：
如图14所示，根据实验结果显示，硫酸铜炎症模型构建成功。与模型组相比，10ng/mL的海参磷脂提取物通过抑制巨噬细胞的聚集从而改善炎症状态，加入100ng/mL和1μg/mL的海参磷脂提取物实验组巨噬细胞的聚集程度与模型组相接近，无明显的改善作用。10μg/mL的海参磷脂提取物实验组巨噬细胞聚集程度大于模型组，炎症加重。
海参磷脂提取物对硫酸铜炎症中性粒细胞聚集行为的影响：
如图15所示，由于苏丹黑染色明显且易于观察，可作为中性粒细胞炎症的观察方法。对于72hpf左右的斑马鱼幼鱼，其中性粒细胞主要出现在尾部，对于具有炎症表征的幼鱼在其尾部的中性粒细胞会有明显的聚集。根据苏丹黑染色结果显示，模型组较空白组在尾部中性粒细胞聚集程度明显加大，硫酸铜炎症模型构建成功。加入10ng/mL和100ng/mL海参磷脂提取物均有抑制中性粒细胞聚集的作用，但两者相比，10ng/mL的抑制程度较大，对硫酸铜炎症的改善作用最佳。
2.3海参磷脂提取物对LPS炎症的预防实验结果
2.3.1 LPS炎症模型的构建
如图16所示，根据实验结果显示，在幼鱼卵黄囊的部位出现明显的巨噬细胞聚集，这是炎症的典型表征。在卵黄囊的延长部分(即红色箭头部分)，模型组巨噬细胞的聚集长度也比空白组长，由此确认0.05mg/mL LPS，连续给药三天可以构建斑马鱼幼鱼炎症模型。
2.3.2海参磷脂提取物对LPS炎症的预防
海参磷脂提取物对LPS炎症巨噬细胞迁移行为的影响：
如图17所示，根据中性红染色结果显示，control组的卵黄囊呈现橘色，LPS组的卵黄囊呈现明显的红色。与control组相比，LPS组的巨噬细胞往卵黄囊迁移，出现明显的聚集，说明LPS炎症模型构建成功。与LPS模型组相比，加入1ng/mL和10ng/mL的海参磷脂提取物预防实验组在卵黄囊部分巨噬细胞的聚集明显减少，说明1ng/mL和10ng/mL的海参磷脂提取物对LPS炎症具有预防改善作用，其中10ng/mL的海参磷脂提取物改善效果最佳。100ng/mL、1μg/mL和10μg/mL组与LPS组无显著差异。
海参磷脂提取物对LPS炎症中性粒细胞迁移行为的影响：
如图18所示，根据苏丹黑染色结果显示，空白组与LPS组相比，LPS组幼鱼尾部中性粒细胞聚集密集，进一步验证LPS炎症模型构建成功。与模型组相比，可以明显看出加入1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL海参磷脂提取物组中性粒细胞的聚集明显减少，说明1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL的海参磷脂提取物均有改善LPS炎症的作用，其中100ng/mL的改善效果最佳。模型组与加入1μg/mL组相比，1μg/mL组中性粒细胞的聚集有所减少，说明有轻微的改善作用，但效果仍不及低浓度的海参磷脂提取物。
BCA法测定蛋白浓度：
如图19所示为蛋白质标准曲线，标准曲线公式为y＝0.001x+0.134，R2＝0.991。
SOD活性统计结果：
根据图20统计结果显示(与control组比较，“#”P<0.05，与LPS组比较，“*”P<0.05)，与control组比较，LPS模型组的SOD活性明显下降(P<0.05)，说明LPS炎症模型构建成功。与LPS组相比，10ng/mL和100ng/mL实验组SOD的活性均比LPS高，其中100ng/mL实验组SOD的活性明显升高，与LPS组具有显著性差异(P<0.05)，说明100ng/mL的海参磷脂提取物具有明显改善LPS炎症的效果。
NO浓度统计结果：
结合中性红、苏丹黑和SOD活性的统计结果来看，可以明显证明LPS炎症模型的构建成功。然而，如图21所示，亚硝酸盐统计结果显示实验各组均无显著性差异。因此，在NO这一生化指标上，1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,和1μg/mL海参磷脂提取物对抑制NO的表达没有明显差异。
3.总结
本实验通过斑马鱼幼鱼浸透的方式探究海参磷脂提取物对硫酸铜炎症和LPS炎症的改善作用，并找出改善的最佳浓度。实验发现，发育健康72hpf的幼鱼给药20μmol/L硫酸铜，持续时间为1h即可构建硫酸铜炎症模型。在不施于任何药物的情况下，6h硫酸铜的炎症现象基本消失。在硫酸铜炎症预防中，10ng/mL和100ng/mL的海参磷脂提取物均有明显的减弱炎症的效果，其中100ng/ml的效果最佳。在硫酸铜炎症的治疗方面，10ng/mL和100ng/mL的海参磷脂提取物对炎症都有改善作用，10ng/ml治疗效果最佳。可以看出，在对硫酸铜炎症的预防或治疗上均是低剂量组起作用，高剂量组没有明显的改善效果，还发现有轻度炎症的发生的迹象。原因可能是由于高剂量组的海参磷脂提取物对斑马鱼幼鱼仍存在轻微毒性作用，毒性作用尚未达到致死的程度，但是本身已经对幼鱼造成了一定的刺激作用，因此对炎症没有明显的改善作用。由此进行猜测，10ng/mL-100ng/mL浓度的海参磷脂提取物对硫酸铜炎症具有改善作用，但在预防或治疗方面所需的最佳浓度不同，预防需要较高浓度的海参磷脂提取物才能预防炎症，而在炎症已经发生的情况下，较低浓度的海参磷脂提取物即可对炎症起到改善作用。
根据LPS炎症模型的预防实验可得，发育健康72hpf的幼鱼连续给药3天0.05mg/mLLPS即可成功构建LPS炎症模型。从中性红和苏丹黑两项染色指标来看，10ng/mL和100ng/mL的海参磷脂提取物对LPS炎症模型均起到了一定的预防作用。从SOD的统计结果发现，经过LPS处理的幼鱼，明显比空白对照组的要低，这是由于LPS诱发炎症后使得体系内氧化与抗氧化状态失衡，自由基增多，SOD的表达下降。经过海参磷脂提取物处理后，100ng/mL实验组SOD表达水平明显高于LPS组，且有显著性差异(P<0.05)。原因可能是由于海参磷脂提取物抑制巨噬细胞等炎细胞的释放，促使SOD的表达上升，使得SOD清除氧自由基的效率提高，机体恢复氧化还原稳态，炎症得到缓解。从NO统计结果发现，空白组与模型组NO的表达没有达到预期的效果，可能是由于活性氮这个化学指标在氧化应激中起着间接作用或在炎症生成的过程中不通过NO的生成来体现而导致结果没有直观的体现出来。另外的原因可能是由于在实验的操作过程出现偏差或者在实验过程中一些外界因素导致实验动物体内发生了变化。但是，总体看来，实验结果的总趋势较一致。由此推测，海参磷脂提取物对LPS炎症模型有预防作用，最佳浓度处于10ng/mL-100ng/mL之间。
本实验结果揭示了海参磷脂提取物对炎症具有改善作用，具体是与抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集和提高SOD的表达有关。本发明提示海参磷脂在炎症防治产品的开发方面具有广阔的市场应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.海参磷脂在制备预防或治疗非感染性炎症的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述非感染性炎症包括自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、哮喘。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病。
5.海参磷脂在制备抑制中性粒细胞聚集的药物中的应用。
6.海参磷脂在制备抑制巨噬细胞聚集的药物中的应用。
7.海参磷脂在制备提高超氧化物歧化酶表达的药物中的应用。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的应用，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的辅料，所述药物的剂型包括注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂。
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