CN105250248A

CN105250248A - 虾青素在制备预防治疗肾小球纤维化和水肿药物中的应用

Info

Publication number: CN105250248A
Application number: CN201510631886.4A
Authority: CN
Inventors: 步世忠; 洪梦琪; 陈争跃; 吴佳燕; 王福艳; 包蓓艳
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2016-01-20

Abstract

本发明公开了虾青素在制备预防和治疗糖尿病肾病肾小球纤维化和水肿中抑制α-SMA和FN表达的药物组合物中的应用；以及一种预防和治疗糖尿病肾病肾小球纤维化和水肿的药物组合物，其特征在于，含有虾青素。

Description

虾青素在制备预防治疗肾小球纤维化和水肿药物中的应用

技术领域

本发明涉及虾青素在制备治疗预防和治疗糖尿病肾病肾小球纤维化和水肿中的应用，更具体地说，本发明涉及虾青素在制备抑制肾小球纤维化和水肿中α-SMA和FN表达的药物中的应用。

背景技术

随着全球经济的发展，人类物质生活水平的提高，糖尿病的患病率越来越高。糖尿病肾病(DiabeticNephropathy，DN)是糖尿病最严重的慢性并发症之一，也是导致终末期肾脏疾病(EndStageRenalDisease，ESRD)的重要原因，DN是糖尿病的主要微血管并发症之一已得到公认。据国际糖尿病联盟(IDF)2013年的最新数据显示，目前全球糖尿病患者已达到3.66亿人，中国大约有1.14亿糖尿病患者，其中1/3患有糖尿病肾病，20岁以上人群糖尿病患病率已达9.7％，其中伴有慢性肾脏病变的约占25％-60％，远远超过其他国家。来自美国肾脏数据系统2013年年度数据报告显示，约30％的1型糖尿病和20％的2型糖尿病发展为DN，糖尿病约占终末期肾脏疾病(EndStageRenalDisease，ESRD)发病率的44.0％，现有患病率约占ESRD的37.8％^[1]。糖尿病肾病的患病率与病程关系极为密切，2型糖尿病病程＜5年约为7％-10％，20-25年为20％-35％，25年以上约为57％。美国Joslin临床报告显示^[2]，蛋白尿患者的平均病程为17年，出现蛋白尿后患者平均生存期为10年左右，6年内约25.0％，10年内约50.0％，15年内约75.0％的患者发生终末期肾衰。

糖尿病肾病病因和发病机制不清。目前认为系多因素参与，在一定的遗传背景以及部分危险因素的共同作用下致病。

1.遗传因素

男性发生糖尿病肾病的比例较女性为高；来自美国的研究发现在相同的生活环境下，非洲及墨西哥裔较白人易发生糖尿病肾病；同一种族中，某些家族易患糖尿病肾病，凡此种种均提示遗传因素存在。1型糖尿病中40％～50％发生微量白蛋白尿，2型糖尿病在观察期间也仅有20％～30％发生糖尿病肾病，均提示遗传因素可能起重要作用。

2.肾脏血流动力学异常

糖尿病肾病早期就可观察到肾脏血流动力学异常，表现为肾小球高灌注和高滤过，肾血流量和肾小球滤过率(GFR)升高，且增加蛋白摄入后升高的程度更显著。

3.高血糖造成的代谢异常

血糖过高主要通过肾脏血流动力学改变以及代谢异常引致肾脏损害，其中代谢异常导致肾脏损害的机制主要包括：①肾组织局部糖代谢紊乱，可通过非酶糖基化形成糖基化终末代谢产物(AGES)；②多元醇通路的激活；③二酰基甘油-蛋白激酶c途径的激活；④已糖胺通路代谢异常。上述代谢异常除参与早期高滤过，更为重要的是促进肾小球基底膜(GBM)增厚和细胞外基质蓄积；增加肾小球毛

4.高血压

几乎任何糖尿病肾病均伴有高血压，在1型糖尿病肾病高血压与微量白蛋白尿平行发生，而在2型中则常在糖尿病肾病发生前出现。血压控制情况与糖尿病肾病发展密切相关。

5.血管活性物质代谢异常

糖尿病肾病的发生发展过程中可有多种血管活性物质的代谢异常。其中包括RAS，内皮素、前列腺素族和生长因子等代谢异常。

临床表现和疾病分期

糖尿病肾病是糖尿病全身微血管病性合并症之一，因此发生糖尿病肾病时也往往同时合并其他器官或系统的微血管病如糖尿病视网膜病变和外周神经病变。1型糖尿病病人发生糖尿病肾病多在起病10-15年左右，而2型糖尿病病人发生糖尿病肾病的时间则短，与年龄大、同时合并较多其他基础疾病有关。

根据糖尿病肾病的病程和病理生理演变过程，Mogensen曾建议把糖尿病肾病分为以下五期：

1.肾小球高滤过和肾脏肥大期

这种初期改变与高血糖水平一致，血糖控制后可以得到部分缓解。本期没有病理组织学损伤。

2.正常白蛋白尿期

GFR高出正常水平。肾脏病理表现为GBM增厚，系膜区基质增多，运动后尿白蛋白排出率(UAE)升高(＞20μg/min)，休息后恢复正常。如果在这一期能良好的控制血糖，病人可以长期稳定处于该期。

3.早期糖尿病肾病期，又称“持续微量白蛋白尿期”

GFR开始下降到正常。肾脏病理出现肾小球结节样病变和小动脉玻璃样变。UAE持续升高至20～200μg/min从而出现微量白蛋白尿。本期病人血压升高。经ACEI或ARB类药物治疗，可减少尿白蛋白排出，延缓肾脏病进展。

4.临床糖尿病肾病期

病理上出现典型的K-W结节。持续性大量白蛋白尿(UAE＞200μg/min)或蛋白尿大于500mg/d，约30％病人可出现肾病综合征，GFR持续下降。该期的特点是尿蛋白不随GFR下降而减少。病人一旦进入IV期，病情往往进行性发展，如不积极加以控制，GFR将平均每月下降1ml/min。

5.终末期肾衰竭

GFR＜10ml/min。尿蛋白量因肾小球硬化而减少。尿毒症症状明显，需要透析治疗。

以上分期主要基于1型糖尿病肾病，2型糖尿病肾病则不明显。

蛋白尿与糖尿病肾病进展关系密切。微量白蛋白尿不仅表示肾小球滤过屏障障碍，同时还表示全身血管内皮功能障碍并发现其与心血管并发症密切相关。

糖尿病肾病的肾病综合征与一般原发性肾小球疾病相比，其水肿程度常更明显，同时常伴有严重高血压。由于本病肾小球内毛细血管跨膜压高，加之肾小球滤过膜蛋白屏障功能严重损害，因此部分终末期肾衰竭病人亦可有大量蛋白尿。

现如今全球都在研究和开发疗效好而且毒副作用小，甚至无毒副作用的天然糖尿病肾病防治药物，自上世纪60年代初以来，具有巨大开发潜力的海洋生物资源一直是医药界关注的焦点，寻找新的海洋生物资源现已成为天然药物研究的一个重要目标。虾青素(astaxanthin，ASX)全称为3，3′-二羟基-β胡萝卜素-4，4′-酮，是一种红色类胡萝卜素，广泛分布在海洋细菌，藻类，甲壳类和鱼类中，已经有不少文献报道虾青素在抗氧化、抗炎症、抗癌、抗幽门螺杆菌(HP)感染和抗紫外灯过程中显示出强大的作用^24-27，且少有毒副作用。

越来越多的研究结果表明：虾青素在保护胰岛β细胞功能，促进胰岛素抵抗防治糖尿病方面有相当的药用价值。ZhangM等人采用四氯化碳建立肝纤维化模型，分别用20，40，80mg/kg剂量对大鼠进行虾青素治疗，实验观察到虾青素能明显减轻肝纤维化的病理改变，也能抑制NF-kb和TGF-β的表达量，从而减少肝星状细胞的激活和细胞外基质的生成，尤其是用大剂量的虾青素干预，肝纤维化改善程度越大。BhuvaneswariS发现虾青素的抗氧化性和抗炎作用能有效减少肝细胞内质网氧化应激的发生，阻止并延缓炎症导致的慢性症状，进而对糖尿病的二级预防具有重要作用。

发明内容

现有技术中，还没有有药物用于抑制肾小球纤维化和水肿中抑制α-SMA和FN的表达，此处α-SMA是指α平滑肌肌动蛋白，FN是指纤维连接蛋白。本发明人建立经典糖尿病动物模型(1型和2型均可，本说明书中以2型为例)，观察虾青素在高脂喂养STZ给药之前和成模后对2型糖尿病大鼠血糖，血脂，24小时尿蛋白定量和血肌酐的影响，以及虾青素对2型糖尿病大鼠肾小球纤维化和水肿及肾功能障碍是否有所改善作用时，惊喜地发现虾青素能够抑制肾小球纤维化和水肿中α-SMA和FN，从而完成了本发明。

在我们的治疗作用实验中，虾青素治疗组肾脏α-SMA和FN的表达量显著减少，肾小球的纤维化和水肿明显减轻，说明虾青素能减少肾脏病变，保护了肾脏功能。

本发明所涉及的虾青素(astaxanthin)，又名虾黄质、龙虾壳色素，是一种类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，呈深粉红色，化学结构类似于β-胡萝卜素。而β-胡萝卜素、叶黄素、角黄素、番茄红素等都是类胡萝卜素合成的中间产物，因此在自然界，虾青素具有最强的抗氧化性。广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼、藻体、酵母和鸟类的羽毛中含量较高，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一。

虾青素化学名称：3，3′-二羟基-4，4′-二酮基β-胡萝卜素，色素Aj067-69CASNo：472-61-7，分子式C40H52O4，分子量为596.86。由于两端的羟基(-OH)旋光性原因，虾青素具有3S-3′S、3R-3′S、3R-3′R(也称为左旋、内消旋、右旋)这3种异构型态，其中人工合成虾青素为3种结构虾青素的混合物(左旋占25％、右旋占25％，内消旋50％左右)，极少抗氧化活性，与鲑鱼等养殖生物体内的虾青素(以反式结构——3S-3S型为主)截然不同.酵母菌源的虾青素是100％右旋(3R-3′R)，有部分抗氧化活性；上述两种来源虾青素主要用在非食用动物和物资的着色上。只有藻源的虾青素是100％左旋(3S-3′S)结构，具有最强的生物学活性。

附图说明

图1：本发明实施例1的实验流程图。

图2：本发明实施例2的实验流程图。

图3：本发明实施例1中各组大鼠血糖的变化(与对照组比较，*P＜0.05；与高脂组比较，#P＜0.05)。

图4：本发明实施例2中各组大鼠血糖的变化(与对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05)。

图5：本发明实施例1和2中各组大鼠OGTT曲线下面积的变化。

图6：本发明实施例1中各组大鼠尿蛋白与肌酐的比值(与对照组比较，*P＜0.05；与高脂组比较，#P＜0.05)。

图7：本发明实施例2中各组大鼠尿蛋白与肌酐的比值(与对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05)。

图8：本发明实施例1中各组大鼠肾组织α-SMA蛋白表达量的变化(与对照组比较，*P＜0.05；与高脂组比较，#P＜0.05)。

图9：本发明实施例2中各组大鼠肾组织α-SMA蛋白表达量的变化(与对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05)。

图10：本发明实施例1中各组大鼠肾组织FN蛋白表达量的变化(与对照组比较，*P＜0.05；与高脂组比较，#P＜0.05)。

图11：本发明实施例2中各组大鼠肾组织FN蛋白表达量的变化(与对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病组比较，#P＜0.05)。

图12：本发明实施例2中各组大鼠肾组织肾小球纤维化和水肿经虾青素治疗明显改善(HE染色所示)。

图13：本发明实施例2中各组大鼠肾组织肾小球纤维化和水肿经虾青素治疗明显改善(马松染色所示)。

具体实施方式

材料与方法

1.1实验动物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，鼠龄一个月，体重100-120g，由浙江省实验动物中心提供。动物分笼饲养，实验动物于动物中心适应环境一周后再开始实验，自由饮水标准大鼠饲料喂养，保持笼内清洁，室温控制在24℃，自然光源，通风良好，相对湿度为60％。动物实验在宁波大学实验动物中心完成。

1.2实验仪器与试剂

1.2.1主要实验仪器

表1实验仪器名称和生产厂家

1.2.2实验药品和试剂

表2实验药品名称和生产厂家

实验方法

1.2.32型糖尿病模型成功的标准

实验大鼠先喂以高脂饲料(每100g中各成分比例为粗蛋白∶脂肪∶碳水化合物＝20∶40∶40)6周，再按25mg/kg的剂量一次性腹腔注射1％链脲菌素(STZ)柠檬酸缓冲液(用pH为4.2-4.4的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液新鲜配制)进行造模，剪尾取血测随机血糖，随机血糖值≥11.1mmol/L为2型糖尿病模型成功的标准³⁰。每天观察大鼠的精神状况，保证充足的食物和饮水。

1.2.4药物干预

预防组给药时间和治疗组给药时间分别为4周和6周，灌胃剂量为25mg/kg，其余组同步给予等量的生理盐水，自由饮食饮水。

1.2.5随机血糖测定与口服葡萄糖耐量试验

药物预防和治疗过程中，各组每只大鼠每隔3天在同一时刻测一次随机血糖，用自动血糖仪从大鼠尾静脉取血测定，即刻做好相关记录，待实验结束后统计血糖值变化。

在动物实验进行中，各组大鼠分别在药物干预4周后行口服葡萄糖耐量试验。具体方法为：大鼠禁食12h后，用50％葡萄糖的溶液进行灌胃(灌胃剂量是2g/kg)。于灌胃0h、0.5h、1h和2h后剪尾取尾静脉血测血糖值。实验结束后绘制各组大鼠葡萄糖耐量曲线，并计算葡萄糖耐量曲线下面积。

1.2.6血液采集、标本固定与石蜡切片、H&E染色

1.2.6.1血标本采集

血液采集：治疗结束后，每只大鼠选内眦静脉取血，具体方法为：提前备好真空采血管并做好标记，左手固定大鼠，右手用直径1mm长度5cm左右的毛细玻璃管在大鼠眼球内侧旋转插入，调整好深度后静脉血随即流出，用采血管接取血液，待血液静置2-3h后，用低速离心机离心2000rpm，10min，取上清，用自动生化仪器检测血脂指标。

1.2.7定量PCR方法分析肾脏α-SMA和FN的mRNA表达量。

1.2.8用代谢笼收集实验鼠24小时尿，做蛋白定量分析。

【实施例1】

虾青素对2型糖尿病的预防性干预作用

图1现实了实施例1中的实验流程图。具体地说，20只健康雄性SD大鼠被随机分为五个实验组，分别为：A组(正常对照组)，B组(单纯高脂组)，C组(高脂+STZ组)，D组(高脂+虾青素预防+STZ组)，E组(高脂+虾青素预防组)，每组各4只大鼠。正常对照组喂以普通大鼠饲料10周，其余各组大鼠均同步喂以高脂饲料，从第7周开始，D组和E组大鼠均以25mg/kg的剂量用虾青素进行预防，同时A、B、C组给予等量的生理盐水，时间周期为4周。预防结束后对每组大鼠进行空腹12h，次日C组和D组大鼠以25mg/kg的剂量一次性腹腔注射1％STZ柠檬酸缓冲液，A、B、E组大鼠同步注射等量的生理盐水，然后行OGTT试验。待实验结束后描绘各组大鼠葡萄糖耐量曲线以展示大鼠葡萄糖耐量的变化，计算并比较各组大鼠糖耐量曲线下面积值(AUC)，最后处死大鼠收集血清和组织样本，随后检测各组大鼠血清生化指标和进行H&E染色，观察各组大鼠肝组织形态学的改变，并用定量PCR方法检测肾脏各因子表达量的变化。

实验表明，高脂情况下肾脏α-SMA和FN的mRNA表达明显增高。在本发明中，为了解虾青素是否通过抑制α-SMA和FN，进而保护肾脏阻止其纤维化改变，本实验检测了各组大鼠肾脏α-SMA和FN的mRNA表达量，统计结果表明，如图6，图8，图10所示，用虾青素干预后高脂喂养大鼠肾脏α-SMA和FN的mRNA表达量明显下降，尿蛋白改善；肾小球纤维化和水肿改善(图12HE染色，图13马松染色所示)。

【实施例2】

虾青素对2型糖尿病的治疗作用

该实验与上述预防作用实验同步进行。如实验流程图(见图2)所示：取雄性健康SD大鼠20只，先随机选取4只作为正常对照组，喂以普通大鼠饲料6周。其余组大鼠同步喂以高脂饲料6周后以25mg/kg的剂量一次性腹腔注射1％STZ柠檬酸缓冲液。随后剪尾取血测随机血糖值，选取8只随机血糖值≥11.1mol/L的动物为实验大鼠，并随机分为糖尿病组和治疗组各4只大鼠。治疗组给予虾青素的剂量是25mg/kg；其余组同时给予等量的生理盐水，各鼠每天灌胃1次，时间周期为6周，自由饮食饮水。待治疗结束后，各组大鼠进行OGTT试验。随后大鼠处死，取大鼠血清摘取肝脏样本，进行后续血糖值变化分析，提取新鲜肝组织RNA和蛋白，用RT-qPCR方法在mRNA水平上检测肾脏纤维化相关因子表达量。如图7，图9，图11所示：糖尿病对照组大鼠α-SMA和FN的mRNA的表达量比正常对照组明显增加(^*P＜0.05)；经虾青素治疗后大鼠肾脏α-SMA和FN的mRNA的表达量较糖尿病对照组明显下降(#P＜0.05)；肾小球纤维化和水肿改善(图12HE染色，图13马松染色所示)。

表3说明书中英文缩略词对照表

STZ	链脲佐菌素
		AUC	糖耐量曲线下面积
OGTT	口服葡萄糖耐量试验
		HE	苏木精伊红染色
Nrf-2	核因子E2相关因子
		HMOX-1	血红素加氧酶-1
SOD-1	超氧化物歧化酶-1
		IRS-1	胰岛素受体底物-1
IRS-2	胰岛素受体底物-2
		SREBP-1C	固醇调节元结合蛋白
PPAR-α	过氧化物酶体增殖激活受体α
		CPT-1	肉毒碱棕榈酰转移酶-1

Claims

1.虾青素在制备抑制糖尿病肾病肾小球纤维化和水肿中抑制α-SMA和FN表达的药物组合物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述虾青素为天然虾青素。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述肾小球纤维化和水肿选自糖尿病肾病、IgA肾病、系膜增生性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、狼疮性肾炎中的1种或多种。

4.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述肾小球纤维化和水肿由糖尿病肾病引起。

5.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述肾小球纤维化和水肿来自2型糖尿病大鼠。

6.一种预防和治疗肾小球纤维化和水肿的药物组合物，其特征在于，含有虾青素。

7.如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述虾青素是天然虾青素。

8.如权利要求6或7所述的要去组合物，其中，所述肾小球纤维化和水肿选自糖尿病肾病、IgA肾病、系膜增生性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、狼疮性肾炎中的1种或多种。

9.如权利要求6或7所述的要去组合物，其中，所述肾小球纤维化和水肿由2型糖尿病引起。

10.如权利要求6或7所述的要去组合物，其中，所述肾小球纤维化和水肿来自2型糖尿病大鼠。