KR20130001209A - 효모 균주로부터 바이오디젤을 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 유질 효모, 예컨대, 피치아(Pichia) 속의 새로운 효모 분리물로부터의 오일 및 바이오디젤의 생산 및 추출에 관한 방법 및 조성물을 개시하고 있다. 또한 본원에서는 미정제 글리세롤 및 옥수수 침지액을 포함하는 저렴한 원료를 사용하여 높은 밀도로 효모의 생산을 위한 발효 조건을 제공하는 방법이 개시된다.

Description

효모 균주로부터 바이오디젤을 생산하는 방법{PROCESS FOR BIODIESEL PRODUCTION FROM A YEAST STRAIN}
관련 특허출원의 참조
본 발명은 2009년 10월 29일자 출원된 인도 가특허 2514/MUM/2009의 출원인의 이익을 주장하며, 이는 본원에서 전체적으로 참조로 포함된다.
본 발명은 수탁번호 MTCC 5493하에 기탁된 신규한 피치아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii) 효모 균주 뿐만 아니라, 피치아 쿠드리아브제비를 포함하는 유질 효모(oleaginous yeast) 및 유질 효모로부터의 오일 및 바이오디젤의 생산에 관한 것이다.
배경
바이오디젤은 지구 온난화, 에너지 위기 및 고갈되는 화석 연료 공급에 대한 환경 친화적 용액이다. 오늘날, 바이오 디젤(예, 지방산 메틸 에스테르, "FAMEs")는 생분해성 및 비독성인 생물학적 재생 가능한 자원으로부터 생산되는 클린 버닝(clean burning) 대체 연료로 주어진 이름이다. 바이오 디젤은 직접 사용되거나 어떠한 수준으로 석유 제품, 예컨대, 석유 디젤과 배합될 수 있다.
바이오연료는 온실 가스와 관련된 환경 문제를 처리하는 명백한 이점을 지니며 농부의 새로운 수입원이다. 그러나, 통상의 오일-풍부 작물은 경지 이용성, 뿐만 아니라, 연료를 위한 사료 및 식품 작물의 사용과 관련된 환경 및 사회적 문제에 의해서 제한되고 있다. 식품 작물과의 경쟁 없이 녹색 및 지속 가능한 방법으로 바이오디젤을 생산하기 위한 대안적인 방법은 미생물을 사용하는 것이다. 질소-제한 조건하에 성장하는 경우 건조 중량의 60% 까지 오일/지질을 축적하거나 저장하는 고유의 능력을 지니는 몇몇의 미생물이 자연에 존재한다. 이들 지질은 일반적으로 많은 식물 시드 오일과 유사한 지방산 조성으로 80% 내지 90% 트리아실글리세릴로 이루어져 있다(Ratledge, C, Evans, C. T. (1984) Influence of nitrogen metabolism on lipid accumulation in oleaginous yeasts. J Gen . Microbiol.130: 1693-704); Ykema A, Verbree EC, Kater MM, Smit H (1988) Optimization of lipid production in the oleaginous yeast Apiotrichum curvatum in whey permeate. Appl Microbiol Biotechnol 29:211-218). 이들 미생물은 유질 미생물로 일컬어진다. 단세포 오일로도 일컬어지는 미생물 오일은 일부 유질 미생물, 예컨대, 효모, 진균류, 박테리아 및 미세조류(microalgae)에 의해서 생성된다(Ma, Y. L. (2006) Microbial oils and its research advance. Chin . J. Bioprocess . Eng . 4(4):7- 11.). 그러한 미생물 오일은 바이오디젤 생산을 위한 공급원료로서 사용될 수 있다. 다른 식물성 오일 및 동물성 지방과 비교하여, 미생물 오일의 생산은 많은 이점이 있다: 미생물은 식물에 비해서 수명이 짧아서, 수확시간이 짧고, 노동력이 덜 요구되고, 미생물 오일 생산은 현지, 계절 및 기후에 덜 영향을 받고, 대규모 생산이 더 용이하다(Li, Q., Wang, M. Y. (1997) Use food industry waste to produce microbial oil. Science and Technology of Food Industry 6:65-69.). 따라서, 미생물 오일은 미래의 바이오디젤 생산에 주된 오일 공급원료 중 하나가 될 큰 잠재력이 있다. 새로운 개념은 아니지만, 본 분야에서의 연구는 매우 제한되었다(Li, Qiang., Wei, Du., Dehua, Liu. (2008) Perspectives of microbial oils for biodiesel production. Appl . Microbiol . Biotechnol. 80:749-756.). 바이오디젤 생산에서의 사용을 위한 오늘날까지 연구된 미생물 세포는 박테리아, 효모 및 진균류를 포함한다. 바람직한 진균 속은 모르티에렐라( Mortierella ), 피코마이세스 ( Phycomyces ), 엔토모프토라 ( Entomophthora ), 피튬( Pythium ), 트라우스토키트륨 ( Thraustochytrium ), 블레이크슬레아 ( Blakeslea ), 리조무코르( Rhizomucor ) 및 아스페르길루스( Aspergillus )를 포함한다. 연구된 예시적인 박테리아는 프로피오니박테리움 ( Propionibacterium ) 속의 박테이라들을 포함한다. 연구된 조류는 와편모류(dinoflagellate)를 포함하고/거나 크립테코디늄( Crypthecodinium), 포르피리듐 ( Porphyridium ) 또는 니츠키아 ( Nitschia ) 속, 예를 들어, 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii)에 속한다.
효모, 예컨대, 야로이야 ( Yarrowia ), 칸디다( Candida ), 로도토룰라( Rhodotorula ), 로도스포리듐 ( Rhodosporidium ), 크립토코쿠스 ( Cryptococcus ), 트리코스포론( Trichosporon ) 및 리포마이세스(Lipomyces)가 이들의 미생물성 오일 성질에 대해서 연구되었으며, 이들 중 유질 효모, 크립토코쿠스 쿠르바투스( Cryptococcus curvatus)가 주목을 받았는데, 그 이유는 이것은, 유청막 투과액(whey permeate)과 같은 저렴한 탄소원(Ykema, A. (1989) Lipid production in the oleaginous yeast Apiotrichum curvatum. PhD thesis. Free University Amsterdam, The Netherlands.) 및 그 밖의 탄화수소-풍부 농작물 또는 식품 가공 폐기물을 이용하여, 세포 건조 중량의 60%까지의 대량(Ratledge, C. (1991). Microorganisms for lipids. Acta . Biotechnol . 11 :429-438)의 오일을 축적할 수 있기 때문이다. 크립토코쿠스 쿠르바투스에 의해서 생성된 효모 오일은 팜유와 같은 식물 씨드 오일과 유사하다(Davies, R. J. (1988) yeast oil from cheese whey; process development. In: Moreton RS (ed) Single cell oil. Longman, London, pp 99-145.). 피치아 및 사카로마이세스 ( Saccharomyces ) 속, 예를 들어, 피치아 시페리( ia ciferrii )의 효모가 또한 연구되었다. 현재, 효모 오일의 생산은 식물성 오일의 생산에 비해서 더 비용이 든다. 따라서, 단세포 오일 발효는 특정의 오일은 높은 부가 가치로 생산될 수 있을 때에 경제적으로 실행가능할 것이다. 따라서, 이전의 연구는 더 높은 지질 생산율, 더높은 세포성 지질 함량 및 더 높은 바이오매스 생산을 이룩하고자 하는 공정 조작을 이용하였고, 이들 모두를 더욱 경제적으로 실현 가능한 공정을 이루도록 맞추어져 있다. 배양물 중의 유질 미생물의 세포 밀도를 증가시키기 위한 유가식(fed-batch) 및 연속 발효를 포함한 상이한 배양 방식이 보고되었다. 그러나, 종래 기술 중 어느 것도 발효 배지로부터의 오일의 효율적인 추출에 대해 촛점을 맞추지는 않았다.
발명의 요약
본원에서는 마이크로바이알-타입 컬쳐 컬렉션(Microbial-Type Culture Collection)("MTCC") 수탁번호 5493하에 기탁된 피치아 쿠드리아브제비로 공지된 유질 효모의 신규 분리된 균주를 개시한다. 본원에서는 또한 유질 효모, 예컨대, 피치아 쿠드리아브제비를 발효시키는 특정의 방법, 유질 효모, 예컨대, 피치아 쿠드리아브제비를 발효시키는 방법, 유질 효모, 예컨대, 피치아 쿠드리아브제비에 의해서 생성된 오일을 추출하는 방법, 및 유질 효모, 예컨대, 피치아 쿠드리아브제비로부터 바이오디젤을 생성시키는 방법을 개시하고 있다. 몇몇의 구체예에서, 이들 방법은 저렴하고 경제적인 구성요소 및 공정을 사용한다.
따라서, 본원에서는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493의 분리된 효모 세포가 개시된다. 몇몇 구체예에서, 분리된 효모 세포는 오일 생산 조건하에 오일로서 약 50중량% 또는 그 초과를 축적할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 분리된 효모 세포는 배양 배지 중에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 배양 배지는 미정제 글리세롤, 옥수수 침지액, 및 효모 자가용해물을 포함한다.
또한, 본원에서는 수탁번호 MTCC 5493하에 기탁된 피치아 쿠드리아브제비 효모 균주가 개시된다. 또한, 본원에서는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 5493의 생물학적으로 순수한 배양액이 개시된다. 또한, 본원에서는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 5493의 분리된 효모 세포를 포함하는 미생물 조성물이 개시된다. 또한, 본원에서는 분리된 효모 세포에 의해서 생성된 오일을 포함하는 조성물이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 분리된 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 5493이다. 몇몇 구체예에서, 오일은 약 10% 이상의 팔미트산, 약 8% 이상의 팔미톨레산, 약 1% 이상의 스테아르산, 약 41% 이상의 올레산, 약 15% 이상의 리놀레산, 및 약 6% 이상의 리놀렌산을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 추출된 오일은 에스테르교환반응에 주어진다.
또한, 본원에서는 분리된 효모 세포 및 배양 배지를 포함하는 조성물이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 배양 배지는 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 효모 자가용해물을 포함하고, 그러한 조성물은 약 5.5의 pH를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493를 포함한다.
또한, 본원에서는 세포에 의한 오일 생산을 유도하는 효모 세포를 배양하는 방법이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 그러한 방법은 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 크립토코쿠스 효모 자가용해물을 포함하며 약 5.5의 pH를 지닌 배양 배지를 제공하고; 약 28℃에서 약 100 시간 이상 동안 유가식 발효를 이용하여 배양 배지에서 효모 세포를 발효시킴을 포함한다. 몇몇의 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 발효는 약 110 시간 이상 동안 진행된다. 몇몇 구체예에서, 유가식 발효는 발효 동안 글리세롤을 첨가함을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 첨가된 글리세롤은 미정제 글리세롤을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 발효액의 글리세롤 농도가 약 8g/L 미만인 때에 글리세롤이 배양 배지에 첨가된다. 다른 구체예에서, 발효는 효모의 OD가 약 110 내지 150일 때까지 계속된다. 몇몇 구체예에서, 발효는 건조 중량 기준으로 약 14% 이상의 오일 수율을 유도한다. 다른 구체예에서, 발효는 건조 중량 기준으로 약 20% 이상의 오일 수율을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 발효 후의 발효된 세포 바이오매스는 건조 중량 기준으로 약 30g/L 이상이다. 몇몇의 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함한다.
또한, 본원에서는 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 오일을 생산하는 방법이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 방법은 분리된 효모 세포를 오일 생산 조건하에 배양하고; 배양된 효모 세포로부터 오일을 추출함을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 추출된 오일은 에스테르교환반응된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 조건하의 배양은 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 크립토코쿠스 효모 자가용해물을 포함하며 약 5.5의 pH를 지닌 배양 배지를 제공하고; 약 28℃에서 약 100 시간 이상 동안 유가식 발효를 이용하여 배양 배지에서 효모 세포를 발효시킴을 포함한다. 몇몇의 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함한다.
또한, 본원에서는 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 몇몇 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 효모 세포, 예를 들어, 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493 세포를 배양하고; 배양된 효모 세포로부터 오일을 추출하고; 추출된 오일을 에스테르교환반응시킴을 포함한다.
또한, 본원에서는 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호. 5493을 포함하는 효모 세포를 배양하고; 직접적인 에스테르교환반응에 의해서 지방산 메틸 에스테르를 추출함을 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493를 포함하는 효모 세포를 배양하고, 배양된 효모 세포로부터 지방산 메틸 에스테르를 분리함을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 분리된 효모 세포, 예컨대, 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493를 배양하고, 배양된 효모 세포로부터 지방산 메틸 에스테르를 분리함을 포함한다.
따라서, 본원에서는 MTCC 수탁번호 5493로 동정된 피치아 쿠드리아브제비의 분리된 효모 세포가 개시되고 있다. 몇몇 구체예에서, 분리된 효모 세포는 오일 생산 조건하에 오일로서 그 중량의 약 50중량%를 축적할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 분리된 효모 세포는 배양 배지에 존재한다. 몇몇 구체예에서, 배양 배지는 미정제 글리세롤, 옥수수 침지액, 및 효모 자가용해물을 포함한다.
또한, 본원에서는 수탁번호 MTCC 5493하에 기탁된 피치아 쿠드리아브제비 균주의 분리된 효모 세포가 개시된다. 또한, 본원에서는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 5493의 생물학적으로 순수한 배양액이 개시되고 있다. 또한, 본원에서는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 5493의 분리된 효모 세포를 포함하는 미생물 조성물이 개시되고 있다. 또한 본원에서는 분리된 효모 세포에 의해서 생성된 오일을 포함하는 조성물이 개시되며; 몇몇 구체예에서, 분리된 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493이다. 몇몇 구체예에서, 오일은 약 10% 이상의 팔미트산, 약 8% 이상의 팔미톨레산, 약 1% 이상의 스테아르산, 약 41% 이상의 올레산, 약 15% 이상의 리놀레산, 및 약 6% 이상의 리놀렌산을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 추출된 오일은 에스테르교환반응에 주어진다.
또한, 본원에서는 분리된 효모 세포 및 배양 배지를 포함하는 조성물이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 배양 배지는 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 효모 자가용해물을 포함하고, 그러한 조성물은 약 5.5의 pH를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493를 포함한다.
또한, 본원에서는 세포에 의한 오일 생산을 유도하는 효모 세포를 배양하는 방법이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 그러한 방법은 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 크립토코쿠스 효모 자가용해물을 포함하며 약 5.5의 pH를 지닌 배양 배지를 제공하고; 약 28℃에서 약 100 시간 이상 동안 유가식 발효를 이용하여 배양 배지에서 효모 세포를 발효시킴을 포함한다. 몇몇의 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 발효는 약 110 시간 이상동안 진행된다. 몇몇 구체예에서, the 유가식 발효는 발효 동안 글리세롤을 첨가함을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 첨가된 글리세롤은 미정제 글리세롤을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 발효액의 글리세롤 농도가 약 8g/L 미만인 때에 글리세롤이 배양 배지에 첨가된다. 다른 구체예에서, 발효는 효모의 OD가 약 110 내지 150일 때까지 계속된다. 몇몇 구체예에서, 발효는 건조 중량 기준으로 약 14% 이상의 오일 수율을 유도한다. 다른 구체예에서, 발효는 건조 중량 기준으로 약 20% 이상의 오일 수율을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 발효 후의 발효된 세포 바이오매스는 건조 중량 기준으로 약 30g/L 이상이다. 몇몇의 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함한다.
또한, 본원에서는 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 오일을 생산하는 방법이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 방법은 분리된 효모 세포를 오일 생산 조건하에 배양하고; 배양된 효모 세포로부터 오일을 추출함을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 추출된 오일은 에스테르교환반응된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 조건하의 배양은 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 크립토코쿠스 효모 자가용해물을 포함하며 약 5.5의 pH를 지닌 배양 배지를 제공하고; 약 28℃에서 약 100 시간 이상 동안 유가식 발효를 이용하여 배양 배지에서 효모 세포를 발효시킴을 포함한다. 몇몇의 구체예에서, 효모 세포는 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함한다.
또한, 본원에서는 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 몇몇 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 효모 세포, 예를 들어, 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493 세포를 배양하고; 배양된 효모 세포로부터 오일을 추출하고, 추출된 오일을 에스테르교환반응시킴을 포함한다.
또한, 본원에서는 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법이 개시된다. 몇몇 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 피치아 쿠드리아 브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함하는 효모 세포를 배양하고; 직접적인 에스테르교환반응에 의해서 지방산 메틸 에스테르를 추출함을 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493을 포함하는 효모 세포를 배양하고, 배양된 효모 세포로부터 지방산 메틸 에스테르를 분리함을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 오일 생산 조건하에 분리된 효모 세포, 예컨대, 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 기탁번호 5493를 배양하고, 배양된 효모 세포로부터 지방산 메틸 에스테르를 분리함을 포함한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며 상세한 설명과 함께 도면 중 하나 이상을 참조로 더 잘 이해될 수 있는 본 개시내용의 특정 관점을 추가로 입증하도록 포함된다.
도 1은 피치아 쿠드리아브제비 (MTCC 수탁번호 5493로 기탁됨)의 바이오매스 생산에 대한 접종 밀도의 효과를 나타낸다.
도 2는 피치아 쿠드리아브제비의 바이오매스 생산에 대한 배지의 pH의 효과를 나타낸다.
도 3은 피치아 쿠드리아브제비의 바이오매스 생산에 대한 접종 에이지의 효과를 나타낸다.
도 4은 피치아 쿠드리아브제비의 바이오매스 생산에 대한 탄소원의 효과를 나타낸다.
도 5은 피치아 쿠드리아브제비의 바이오매스 생산에 대한 글리세롤 농도의 효과를 나타낸다.
도 6은 피치아 쿠드리아브제비의 바이오매스 생산에 대한 질소원의 효과를 나타낸다.
도 7은 피치아 쿠드리아브제비의 바이오매스 생산에 대한 옥수수 침지액 농도의 효과를 나타낸다.
도 8은 피치아 쿠드리아브제비의 바이오매스 생산에 대한 배치 발효 프로파일을 나타낸다.
도 9는 피치아 쿠드리아브제비 바이오매스의 생산에 대한 유가식 발효 프로파일을 나타낸다.
도 10은 저비용 배지를 사용한 피치아 쿠드리아브제비의 생산에 대한 유가식 발효 프로파일을 나타낸다.
도 11은 바이오디젤 산업으로부터 유래된 미정제 글리세롤을 사용한 높은 세포 밀도 발효를 나타낸다.
도 12는 맥아 추출물이 없는 유가식 발효를 나타낸다.
도 13은 맥아 추출물 없이 유가식 발효를 27L 양으로 대량화하는 동안의 프로파일을 도시하고 있다.
도 14는 질소원으로서 오일 제거된 크립토코쿠스 효모를 사용한 유가식 발효를 나타낸다.
도 15는 동일한 조성으로 의한 씨드 및 생성물 배지를 사용한 유가식 발효를 도시하고 있다.
도 16은 동일한 조성으로 씨드 및 생성물 배지를 사용한 대량의 유가식 발효를 나타내고 있다.
상세한 설명
I. 정의
본원에서 사용된 용어 "피치아 쿠드리아브제비"는 효모 피치아 속의 종을 나타낸다. 한 예는 MTCC 수탁번호 5493하에 기탁된 새로운 효모 균주이다.
용어 "바이오디젤"은 장쇄 알킬(메틸, 프로필 또는 에틸) 에스테르를 포함하는 디젤 연료를 의미한다. 바이오디젤은 효모로부터 분리된 오일의 지방산 메틸 에스테르(FAME), 및 FAME의 화학적 변경 또는 변형을 포함한다.
효모로부터 분리되거나 그에 의해서 생산된 오일과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "오일"은 효모에서 생산된 지질(예컨대, 지방산 메틸 에스테르), 또는 지질 또는 효모로부터 분리된 전체 지질 함유물을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "오일 생산 조건"은 효모가 오일을 생산하게 되는 성장 또는 발효 조건을 의미한다. 그러한 조건은 과량의 탄소 및 제한된 양의 그 밖의 영양물, 특히 질소를 함유한 배지를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, "오일 생산 조건"은 성장 배지중에 탄소원과 질소원의 비율이 약 40 내지 50인 경우에 실현된다. 몇몇 구체예에서, "오일 생산 조건"은 트리카르복실산 사이클이 억제되고, 대사 경로가 변경되고, 단백질 합성이 중단되고 지질 축적 과정이 활성화되는 경우에 실현된다. 몇몇 구체예에서, "오일 생산 조건"은 대조 조건하의 동일한 효모 균주에 비해서 유질 효모 균주에서 NAD-IDH 활성이 감소되거나 부재하고, 유질 효모 균주가 더 이상 아세트산을 탄소원으로서 이용할 수 없고 글리세롤 또는 락트산을 탄소원으로서 이용할 수 있는 경우에 실현된다.
본원에서 사용된 용어 "약" 및 용어 "약"에 의해서 정성(qualified)되든지 그렇지 않든지 간에 일반적인 범위의 사용은 포함되는 수가 본원에 기재된 정확한 수로 제한되지 않으며 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 실질적으로 인용된 범위 내에 있는 범위들을 나타내고자 한다. 본원에서 사용된 용어 "약"은 당업자에 의해서 이해될 것이며, 이것이 사용되는 문맥에서 어떠한 범위로 변화될 것이다. 당업자에게 명확하지 않은 용어 용어의 사용이 그러한 용어가 사용된 문맥이 존재하는 경우에, "약"은 특정 용어의 ±10%까지, 및 ± 5%, 1%, 0.1%, 0.01%까지를 의미하거나, 일반적으로 측정에 대하 표준 과정을 사용한 표준 편차를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "에스테르교환반응" 또는 "에스테르교환반응되는"은 에스테르의 유기기 R"를 알콜의 유기기 R과 교환시키는 공정을 의미한다. 개략적인 반응이 이하 기재된다.
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본원에서 사용된 용어 "배양"은 세포(예, 효모 세포)가 사람 조절된 조건하에 성장하는 과정을 의미한다. 몇몇 구체예에서, 배양은 발효를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "배양 배지" 또는 "성장 배지" 또는 "발효 배지"은 미생물 또는 세포, 예를 들어, 효모 세포의 성장을 지지하도록 설계된 액체 또는 겔을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "효모 세포 바이오매스"는 발효에 의해서 또는 다른 배양 수단에 의해서 생성되는 효모 세포를 의미한다. 몇몇 구체예에서, 효모 세포 바이오매스는 원심분리에 의해서 수집되고 배양액 또는 발효 배지로부터 어떠한 정도로 분리된다. "발효된 효모 세포 바이오매스"는 발효에 의해서 생성되는 효모 세포를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "건조 중량 기준"은 액체 부분의 적어도 일부가 제거된 경우의 조성물의 질량을 의미한다. 예를 들어, 발효된 효모 세포 바이오매스의 건조중량을 측정하기 위해서, 1 ml의 배양액이 10분 동안 10,000rpm에서 원심분리된다. 바이오매스 펠릿은 증류수로 2회 세척되고 40℃에서 항량으로 건조된다(일반적으로 24시간). 이러한 예에서, 바이오매스는 중량 측정되고, 밀리리터당 그램 리터당 그램 등의 단위로 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "건조 중량 기준으로 오일 수율"은 건조 중량 기준으로 측정된 단위 효모 세포 바이오매스에 의해서 생성된 오일의 양을 의미한다. 예를 들어, 건조 중량 기준으로 효모 세포 바이오매스가 32.8 g/L이고, 7g의 오일이 이러한 바이오매스로부터 추출되면, 오일 수율은 건조 중량 기준으로 21%이다.
효모 균주와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "분리된"은 자연 발생 환경에서 발견되는 비-효모 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 효모 세포를 의미한다. 따라서, 분리된 효모 세포는 더 이상 자연 환경에 존재하지 않는 효모 세포이며, 예를 들어, 배양액, 예를 들어, 실험실에서 성장하거나 보존된다.
II . 신규한 유질 효모 균주의 분리
다양한 부패한 과일 샘플로부터 분리된 효모를 오일을 생산하는 능력에 대해서 스크리닝하였다. 8가지의 상이한 부패 과일 샘플(망고, 구아바, 오랜지, 석류(pomegranate), 포도, 바나나, 파파야 및 치쿠)을 인도 나비 뭄바이 소재의 간솔리(Ghansoli) 과일 시장에서 수집하였다. 과일의 껍질을 벗기고, 250-ml의 엘르바이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 중의 100ml의 글루코스-부화된 배지 함유(g/L): 글루코스 20, 펩톤 5, 효모 추출물 5, 맥아 추출물 3, KH2P04 1 및 MgS04·7H20 0.5에 첨가하였다. 샘플들을 28℃에서 48 시간(h) 동안 분당 200회전("rpm")에서 인큐베이터 쉐이커(incubator shaker)내에서 인큐베이션하여 효모에 대해서 부화시켰다.
이어서, 상기 부화된 효모 배양액을 일련의 10-배 희석으로 희석시키고, 10-6 대 10-12의 범위의 희석액으로부터의 0.1ml 분취액을 MGYP 한천(1 % 글루코스, 0.5% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 2% 한천, 및 5 ml의 스트렙토마이신 용액)상에 도포하였다. 플레이트를 28℃에서 72 시간 동안 인큐베이션하고, 분리된 효모 콜로니를 실시예 13에 기재된 용매 추출 방법에 의해서 이들의 지질-생성 능력에 대해서 추가로 스크리닝하였다(Folch, J., M. Lees, and G. H. Sloane Stanley, (1957) J. Biol . Chem. 226: 497).
이어서, 오일 생성에 대한 잠재력을 지닌 분리된 효모를 26S 리보좀 RNA 유전자의 D1/D2 도메인의 서열화를 기준으로 하는 동정을 위해서 IMTECH (Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India)에 보냈다. 효모 균주가 피치아 쿠드리아브제비의 신규한 아종(subspecies)인 것으로 밝혀졌다.
이러한 분리된 효모 균주를 부다페스트 조약하의 특허를 위해서 국제특허 유기물 기탁 IMTECH (Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India)에서 기탁번호 MTCC 5493로서 2009년 10월 12일자 기탁하였다.
신규한 피치아 쿠드리아브제비 효모 균주는 효모의 배양을 위해서 전형적으로 사용되는 배지에서 배양될 수 있다. 영양 요건은 질소원, 예컨대, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 비프 추출물, 옥수수 침지액, 염화암모늄, 질산나트륨 및 황산암모늄, 및 탄소원, 예컨대, 글루코스, 갈락토스, 전분, 아라비노스, 글리세롤, 만니톨, 수크로스 및 프룩토스를 포함할 수 있다.
배양은 성장에 부작용을 주지 않는 범위의 조건하에, 또는 요구된 성장률 또는 성장 패턴을 얻기 위한 조건하에(예, 오일 생산 조건하에) 수행될 수 있다. 최대 성장 및 오일 생산을 위한 다양한 물리적 화학적 파라미터, 예컨대, pH, 접종 밀도 및 접종 에이지(inoculums age)가 평가되었다. 또한, 상이한 탄소원 및 질소원(유기 및 무기)이 영양 파라미터로서 시험되었다. 예를 들어, 그러나, 제한하고자 하는 것은 아니지만, 배양물은 호기성 조건하에, 약 5.0 내지 약 7.0의 pH 범위내에서, 1 내지 5%의 접종 밀도 및 6 내지 24 시간의 접종 에이지에 의해서 성장될 수 있다.
본 발명은 또한 추출에 의한 바이오연료의 생산을 위한 과정 및 분리된 효모 균주에 의해서 축적된 오일의 에스테르교환반응을 제공한다.
III . 구체예
몇몇 구체예에서, MTCC 수탁번호 5493을 지니는 종 피치아 쿠드리아브제비의 신규한 피치아 균주를 포함하는 조성물이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 조성물은 분리된 피치아 쿠드리아브제비 세포를 포함하며, 그러한 세포는 오일 생산 조건하에 오일로서 이의 중량의 50% 이상, 예컨대, 약 50%를 축적할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 분리된 피치아 쿠드리아브제비 세포는 질소원, 탄소원 및 맥주 효모(brewer's yeast) 또는 효모 자가용해물을 포함하는 배양 배지 중에 존재한다.
몇몇 구체예에서, 오일을 축적할 수 있는 효모의 새로운 균주(예, 유질 효모)를 스크리닝하고 분리하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 유질 효모를 함유할 수 있는 샘플은 효모를 부화시키는 조건하에 배양된다. 몇몇 구체예에서, 그러한 조건은 글루코스-부화된 배지를 포함한다. 한 가지 예시적인 구체예에서, 그러한 배지는 20 g/L 글루코스, 5 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 3 g/L 맥아 추출물, 1 g/L KH2P04 및 0.5 g/L MgS04·7H20를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 부화된 배양액의 샘플은 각각의 콜로니가 지질 생산 능력에 대해서 평가될 수 있도록 플레이팅된다. 몇몇 구체예에서, 각각의 콜로니는 이들의 지질 생산 능력에 대해서 선택되고 시험된다(예, 용매 추출 방법).
몇몇 구체예에서, 유질 효모의 성장 조건을 최대화하기 위한 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 성장 조건은 효모에 의해서 생산된 오일의 생산 및 추출을 위한 유질 효모의 발효, 및/또는 효모에 의해서 생산된 오일을 사용한 바이오디젤의 제조에 관한 것이다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 성장 조건은 또한 "오일 생산 조건"이다. 몇몇 구체예에서, 성장 조건 또는 오일 생산 조건은 다음 파라미터 중 하나 이상을 평가함으로써 측정된다: 1) 발효된 효모의 바이오매스; 2) 발효된 효모의 광학 밀도("O.D."); 3) 발효된 효모 바이오매스의 단위당 비용; 및 5) 효모에 의해서 생산된 오일로부터 제조된 바이오디젤의 단위당 비용. 몇몇 구체예에서, 발효된 피치아 쿠드리아브제비의 요망되는 바이오매스, 발효된 피치아 쿠드리아브 제비의 광학 밀도("O.D."); 발효된 피치아 쿠드리아브제비 바이오매스의 단위당 비용; 발효된 피치아 쿠드리아브제비로부터 추출된 오일의 단위당 비용; 및 피치아 쿠드리아브제비에 의해서 생산된 오일로부터 제조된 바이오디젤의 단위당 비용중 하나 이상이 달성되도록 피치아 쿠드리아브제비에 대한 성장 조건(오일 생산 조건)이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 특정의 영양학적 및 생리학적 파라미터를 제공함으로써 유질 효모를 위한 성장 조건(오일 생산 조건)을 최대화하는 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 그러한 파라미터는 효모 바이오매스, 오일 생산, 발효된 바이오매스의 단위 비용, 발효된 효모에 의해서 생산된 오일의 단위 비용, 또는 효모에 의해서 생산된 오일로부터 제조된 바이오디젤의 단위 비용 중 하나 이상에 대해서 개선된 수율을 유도한다. 예를 들어, 그러나, 이로 한정되는 것은 아니지만, 생리학적 및 영양학적 파라미터는 접종 에이지, 접종 밀도 및 발효 배지의 pH, 탄소원, 탄소원 농도, 질소원, 질소원 농도, 및 방식, 예컨대, 배치 또는 유가식 발효를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 특정의 영양학적 및 생리학적 파라미터를 제공함으로써 오일 생산 효모의 성장 조건(오일 생산 조건)을 최대화하고 효모 바이오매스, 오일 및/또는 바이오디젤의 생산을 경제적이게 하는 방법을 제공한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 저렴한 원료가 성장 조건(및 오일 생산 조건)을 최대화하기 위한 성장 및 발효 배지에 사용된다. 예를 들어, 그러나, 이로 한정되는 것은 아니지만, 저렴한 원료는 옥수수 침지액 (CSL), 미정제 글리세롤 및 오일 제거된 효모 자가용해물, 예를 들어, 오일 제거된 크립토코쿠스 효모 자가용해물을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모의 성장을 위한 배지는 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 효모 자가용해물을 포함하며 약 5.5의 pH를 지닌다. 몇몇 구체예에서, 저렴한 원료, 옥수수 침지액, 미정제 글리세롤 및 오일 제거된 효모 자가용해물을 사용하는 피치아 쿠드리아브제비의 성장 조건(오일 생산 조건)이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모의 성장 조건(오일 생산 조건)은 대량의 발효 및/또는 고밀도 발효를 가능하게 하도록 수행된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산은 소규모의 양(예, 5리터(L))로 수행되며; 다른 구체예에서, 오일 생산은 더 큰 규모의 양(예, 27L 또는 그 초과)으로 수행된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산은 소량의 발효 용적으로 수행되고, 이어서, 파라미터가 더 큰 용적의 발효기에 사용하기 위해서 확대된다. 몇몇 구체예에서, 영양학적 및 생리학적 파라미터는 작은 용적으로부터 확대된 후에 더 큰 용적의 발효기에 추가적으로 제공된다. 몇몇 구체예에서, 저렴한 원료, 예컨대, 옥수수 침지액 및 미정제 글리세롤이 사용된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모는 피치아 쿠드리아브제비, 예컨대, 수탁번호 MTCC 5493하에 기탁된 효모 균주이다.
몇몇 구체예에서, 방법은 미정제 글리세롤 및 옥수수 침지액을 포함한 저렴한 원료를 사용하여 발효기에서 고밀도로 오일 생산 효모를 생성시키도록 제공된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모는 피치아 쿠드리아브제비, 예컨대, 수탁번호 MTCC 5493하에 기탁된 효모 균주이다.
몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모로부터 오일 추출을 위한 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모는 오일 생산 조건하에 발효되고, 오일이 발효된 세포로부터 추출된다. 몇몇 구체예에서, 추출은 발효된 효모 세포를 용해시키고(예, 균질화 및 동결에 의해서) 극성 유기 용매를 사용하여 오일을 추출함을 포함한다. 예를 들어, 그러나, 이로 한정되는 것은 아니지만, 극성 유기 용매는 클로로포름 및 헥산을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 발효를 위한 성장 배지는 저렴한 원료, 예컨대, 미정제 글리세롤 및 옥수수 침지액을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 발효는 큰 용적(예, 27L 또는 그 초과)에서 고밀도로 수행된다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 대규모 생산에서 비용 효과적이고 시판 가능하고 용이한 오일 생산 효모로부터의 오일 추출을 위한 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모는 피치아 쿠드리아브제비, 예컨대, 수탁번호 MTCC 5493하에 기탁된 효모 균주이다.
몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모로부터 바이오디젤(예, 지방산 메틸 에스테르("FAME")를 포함하는 바이오디젤)의 생산을 위한 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 수탁번호 MTCC 5493하에 기탁된 새롭게 분리된 효모 피치아 쿠드리아브제비로부터 추출된 오일을 이용한 바이오디젤 생산을 위한 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 오일 생산 효모로부터 추출된 오일의 에스테르교환반응을 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 바이오디젤을 생산하기 위한 오일 생산 효모 바이오매스의 직접적인 에스테르교환반응을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 대규모 생산에서 비용 효과적이고 시판 가능하고 용이한 오일 생산 효모, 예컨대, 피치아 쿠드리아브제비로부터의 오일 추출 및 바이오디젤 생산을 위한 방법이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 오일을 축적할 수 있는 효모의 새로운 균주를 스크리닝하고 분리하는 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 새롭게 분리된 효모 피치아 쿠드리아브제비 MTCC 5493으로부터 추출된 오일을 사용하여 바이오디젤 생산을 입증하는 방법이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 시간 방법에서 한 가지 변수(one-variable-at-a-time method)에 의해서 효모 바이오매스의 개선된 생산을 위한 생리학적 및 영양학적 파라미터를 최적화하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 미정제 글리세롤 및 옥수수 침지액을 포함하는 저렴한 원료를 사용하여 발효기에서 고밀도로 효모 생산을 최적화하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 발효된 효모로부터의 오일의 추출을 위한 과정을 제공하고, 바이오디젤을 생산하기 위한 효모를 에스테르교환반응시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 바이오디젤을 제조하기 위한 효모 바이오매스의 직접적인 에스테르교환반응의 과정을 제공하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
몇몇 구체예에서, 과정, 예를 들어, 대규모 생산에서 비용 효과적이고 시판 가능하고 용이한 오일 생산 효모로부터의 바이오디젤 생산을 위한 과정을 제공하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 미정제 글리세롤 및 옥수수 침지액을 포함하는 저렴한 원료를 사용하여 발효기에서 고밀도로 효모 생산을 최대화하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 오일을 축적할 수 있는 효모의 새로운 균주를 스크리닝하고 분리하는 방법 및 조성물이 제공된다. 한 가지 구체예에서, 본 발명은 유전자 서열 분석에 의해서 특성화되는 새로운 오일 축적 균주, 피치아 쿠드리아브제비 MTCC 5493이 동정을 기재하고 있다.
몇몇 구체예에서, 한 가지 시간 방법에서 한 가지 변수를 이용하여 영양학적 및 생리학적 파라미터를 최적화하는 방법 및 조성물을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 그러한 방법은 효모 바이오매스의 수율을 개선시키기 위해서 사용된다. 몇몇 구체예에서, 효모의 배치 및 유가식 발효를 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 그러한 방법은 미정제 글리세롤 및 옥수수 침지액을 사용하여 효모 바이오매스를 생산함을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 효모는 25L 규모까지의 대규모 발효기에서 발효된다.
몇몇 구체예에서, 효모로부터 오일을 추출하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 효모 오일의 에스테르교환반응을 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
몇몇 구체예에서, 바이오디젤을 제조하기 위한 효모 바이오매스의 직접적인 에스테르교환반응을 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
IV . 실시예
하기 실시예는 본 발명의 구체예를 입증하기 위해서 포함된다. 당업자라면 이하 기재된 실시예에 개시된 기술은 본 발명을 잘 실시하도록 본 발명의 발명자가 발견한 기술을 나타낸다. 그러나, 당업자라면 본 개시내용을 고려하여 많은 변화가 개시된 특정의 구체예내에서 이루어질 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 유사한 결과를 얻을 것임을 인지할 것이다.
실시예 1: 유질( oleaginous ) 효모의 스크리닝 및 분리
8가지의 상이한 썩은 과일 샘플(망고, 구아바, 오렌지, 석류, 포도, 바나나, 파파야 및 치쿠(chikku))을 유질 효모에 대해 스크리닝하였다. 과일 샘플은 인도 나비뭄바이 강솔리(Ghansoli, Navi Mumbai, India) 소재의 과일 시장으로부터 수집하였다. 과일 껍질을 벗기고, 250 ml 에른마이어 플라스크 중에 글루코스 10, 펩톤 5, 효모 추출물 5, 맥아 추출물 3, KH2P04 1 및 MgS04-7H20 0.5(g/L)을 함유하는 100 ml의 글루코스-농축 배지에 첨가하였다. 샘플을 200ppm에서 흔들어 주면서 48시간 동안 28℃에서 인큐베이터 쉐이커에 인큐베이팅하여 효모에 대해 농축시켰다.
실시예 2: 효모 분리
이후, 농축된 배양물을 멸균 증류수로 연속해서 희석하고, 10-6 내지 10-12 범위의 희석율의 분취액을 MGYP 아가 플레이트(1% 글루코스, 0.5% 펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 2% 아가, 및 스트렙토마이신(0.2 g/L)) 상에 플레이팅하였다. 상기 플레이트를 72시간 동안 28℃에서 인큐베이팅하고, 효모의 전형적인 형태를 지닌 분리된 콜로니를 추가의 연구에 사용하였다. 약 250개의 분리된 균주를 추가로 용매 추출법(Folch et al., 1997)에 의해 지질 축적에 대해 스크리닝하였으며, 분리된 나머지 균주들은 무사할 정도의 양(측정가능하지 않음)의 오일을 생성함에 따라 한 균주는 축적하는 오일 중에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 효모에 대해, 지질 축적 과정은 과잉의 탄소를 지질에 혼입되게 하기 위해 영양소, 보통 질소의 소비를 필요로 한다. 따라서, 바이오매스 및 오일 생성을 증가시키기 위해 이러한 균주에 추가의 최적화를 수행하였다.
실시예 3: 효모 균주의 확인
실시예 2에서 논의된 바와 같이, 오일 축적에 매우 효과적인 효모 균주가 미생물 Type Culture Collection, Chandigarh에 의해 265 리보좀 RNA 유전자의 D1/D2 도메인 시퀀싱을 기초로 하여 피치아 쿠드리아브제비로서 확인되고, 수탁번호 5493를 부여받았다.
상기 균주는 본 발명자들에 의해 분리되었으며, 최초로 기탁되었으며, 수탁 번호 MTCC 5493를 부여받았다.
실시예 4: 미생물의 성장 및 유지
하기 실시예 5에서 논의되는 실험에서 사용되는 효모 균주 피치아 쿠드리아브제비 MTCC 5493을 글루코스 10; 펩톤 50; 효모 추출물 5; K2HP04 3; 및 KH2P04 1(g/L); pH 5.5을 함유하는 100 ml의 MGYP 배지를 함유하는 250ml 플라스크에서 성장시켰다. 배지를 121℃에서 20분 동안 멸균시키고, 2% 시드(seed) 접종물(2 ml)로 접종시키고, 200rpm에서 24시간 동안 30 ± 1℃에서 인큐베이팅하였다.
시드 접종물을 상기와 같이 배양시켰다.
실시예 5: 개선된 바이오매스 생성
하기 실시예들은 미생물 지질 발효를 위한 고밀도 세포 배양을 달성하는, 상이한 기질 및 배양 형태의 임계적 균형을 확인한다.
A. 효모 바이오매스의 개선을 위한 물리 화학적 인자의 선택
피치아 효모 세포(Pichia kudriavzevii, MTCC 수탁번호 5493)의 성장에 대한여러 물리화학적 파라미터 또는 변수를 한번에 하나씩 검정하는 방법을 수행함으로써 실시예를 수행하였다. pH, 접종물 밀도, 접종물 크기를 물리적 파라미터로서 조사하는 한편, 상이한 탄소 및 질소 공급원(유기 및 무기)을 영양적 파라미터로서 조사하였다. 개선된 효모 세포(바이오매스)의 생성을 위한 특정 농도에 도달하기 위해 탄소, 질소 및 염의 선택된 공급원을 추가로 조사하였다. 실시예 5에서 기술된 각각의 실험에서, 시드 접종물, 및 세포의 실험 배치를 다르게 명시하지 않는 한 실시예 4에 기술한 바와 같이 성장시켰다.
B. 효모 건조 매스의 측정
실시예 5 내지 12에서 기술되는 실험에 대해, 효모 세포 바이오매스의 건조 중량을 하기와 같이 측정하였다. 1ml의 배양물을 10분 동안 10,000 rpm에서 원심분리시켰다. 바이오매스 펠릿을 증류수로 2회 세척하고, 40℃에서 일정 중량으로(보통 24시간) 건조시켰다. 바이오매스를 중량 측정하였다.
C. 접종물 밀도의 효과
1 내지 5 %(v/v) 범위의 접종물 밀도 및 이것의 효모 바이오매스 생성에 대한 효과를 평가하였다. 도 1은 접종물 밀도가 효모 균주의 성장에 상당한 영향을 미치지 않음을 보여주며, 따라서 이후 모든 실험에서는 1%(v/v) 접종물을 사용하였다.
D. 효모 바이오매스에 대한 pH 효과
효모 바이오매스 생성에 대한 초기 pH의 효과를 연구하였으며, 이때 초기 pH 는 5.0 내지 7.0에서 달라진다. 발효를 pH 5.5에서 수행한 경우 16.86(7.2 g/L의 효모 세포 바이오매스의 건조 중량)의 최대 광학 밀도를 얻었다(도 2).
E. 접종물 연령의 효과
효모 바이오매스에 대한 접종물 연령의 효과를 측정하기 위해 6시간 내지 24시간 범위의 시간 변동에 대한 접종물 성장을 사용하였다. 24시간 지난 접종물은 8.1 g/L의 효모 세포 바이오매스의 건조 중량과 함께 최대 19.6의 OD를 제공함을 보였다(도 3)
F. 상이한 탄소원의 효과
탄소원은 바이오매스 및 지질 생성 둘 모두에 작용한다. 바이오매스 생성에 대한 글루코스, 갈락토스, 전분, 아라비노스, 글리세롤, 만니톨, 수크로스 및 프룩토스를 포함하는 다양한 탄소원의 효과를 평가하였다. 시험된 모든 탄소원 중, 글리세롤이 가장 우수한 탄소원(도 4)이었으며, 25.35의 O.D. 및 8.3 g/L의 효모 세포 바이오매스의 건조 중량을 나타내었다. 배지 중 글리세롤의 농도와 관련된 추가의 최적화는, 1%의 글리세롤 농도에서 7.8 g/L의 건조 세포 중량과 함께 25.25의 최고 광학 밀도를 얻음을 나타내었다(도 5).
G. 상이한 질소원의 효과
배지의 질소원을 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 비프 추출물, 옥수수침지액, 염화암모늄, 질산나트륨 및 황산암모늄을 포함하는 여러 유기 및 무기 질소원으로 배지의 질소원을 교체하였다. 옥수수침지액("CSL")이 가장 우수한 질소원인 것으로 나타났다(도 6). CSL 농도의 평가에서는, 2% CSL에서 9.85 g/L의 건조 세포 중량과 함께 OD가 31.92로 부스팅됨을 보여준다(도 7).
실시예 6: 7L 발효기에서의 대규모화 연구
효모 세포(Pichia kudriavzevii, MTCC 수탁번호 5493)의 대규모화 생산을 작업 용적이 5.0리터("L")인 바이오반응기(Sartorius B-plus, Germany)에서 수행하였다. 대규모화는 하기 섹션 A-C에서 기술되는 바와 같이 수행하였다.
A. 오일 수율의 측정
실시예 7 내지 12에서 기술되는 실험에 대해, 오일의 양을 오일 추출을 위해 취한 세포의 건조 세포 중량으로 나눔으로써 발효된 효모 세포로부터의 오일 수율을 측정하였다.
B. MGYP 배지를 사용하는 배치식 및 유가식 ( fed batch ) 발효
고밀도 성장을 촉진시키기 위해, 피치아 쿠드리아브제비 세포(MTCC 5493)를 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물 및 글루코스를 함유하는 MGYP 배지에서 성장시켰다. 세포를 발효기에서 배치식 또는 유가식으로 성장시켰다. 발효는 pH 5.5에서 수행하였다. 필요에 따라 액체 암모니아를 첨가함으로써 수행하는 동안 pH를 유지시켰다. 3vvm의 통기(aeration)와 함께 350rmp에서 교반을 유지시켰다. 배치식 발효를 위해, 28℃에서 48시간 작동시켜 8.4 g/L의 효모 세포 바이오매스의 건조 중량과 함께 48시간에서의 24.2의 O.D.을 얻었다. 이후, 바이오매스 생성이 감소하였다. 효모 세포 밀도를 개선시키기 위해, 유가식 발효를 시도하였다. 글루코스 수준이 5 g/L 미만으로 떨어지는 경우에 공급물로서 1% 글루코스를 첨가하는 것을 제외하고, 배치식에 대해 사용된 조건 하에서 발효기를 120시간 동안 작동시켰다. 도 9에 도시된 결과는, 34.5 g/L의 바이오매스의 최대 건조 중량을 110 시간 에 얻었음을 나타낸다. O.D.는 101.35였다. 오일 추출은 수행되지 않았다.
C. 저가 기질, 예컨대 미정제 글리세롤 및 CSL 을 사용하는 유가식 발효
발효 배지의 비용을 낮추기 위해, 펩톤 및 효모 추출물을 저렴한 원료인 옥수수침지액("CSL")으로 대체하고, 글루코스를 미정제 글리세롤로 대체하였다. 글리세롤 및 CSL은 실시예 5에서 확인되었다. 발효기 배지는 미정제 글리세롤 2%; CSL 1% 및 맥아 추출물 0.2%로 구성되었다. 발효를 28℃ 및 pH 5.5에서 120시간 동안 수행하였다. 3vvm의 통기와 함께 350rmp에서 교반을 유지시켰다. 글리세롤 농도가 8 g/L 미만으로 감소되면, 인큐베이션 후 17시간 및 65시간 후에 발효기에 공급물로서 미정제 글리세롤(2%)을 첨가하였다. 글리세롤 수준이 30 g/L까지 이르렀다. 결과는 42 g/L의 바이오매스를 112 시간에 얻었으며(도 10); 112시간에서의 O.D.가 106임을 나타낸다.
실시예 7: 바이오디젤 산업으로부터 유래된 미정제 글리세롤을 사용하는 고 세포 밀도 발효
작업 용적이 5.0L인 바이오반응기(Sartorius C-plus, Germany)에서 유가식 발효를 수행하였다. 고밀도 성장을 촉진시키기 위해, 피치아 쿠드리아브제비 세포(MTCC 5493)를 미정제 글리세롤 1% w/v; 옥수수침지액 2% w/v, 빵 효모 0.5% w/v 및 맥아 추출물 0.2% w/v을 함유하지 배지에서 성장시켰다. 상기 실시예 4에서 기술된 바와 같이 제조된 20% v/v 접종물로 상기 배지를 접종시켰다. 발효기를 pH 5.5에서 유가식으로 작동시켰다. 수행하는 동안 필요에 따라 3N 수산화나트륨 및/또는 3N 황산을 첨가함으로써 pH를 조절하였다. 발효 파라미터를 1vvm의 통기와 함께 700 rpm에서 교반하였다. 글리세롤 수준이 8 g/L 미만으로 떨어지는 지면 발효 과정 동안 각각의 공급 동안에 최종 농도가 1%가 되도록 농축된 글리세롤 원액으로부터 첨가되는 공급물로서 총 6% v/v 글리세롤을 첨가하였다. 도 11에 도시된 결과는 123의 최대 O.D. 및 30.4 g/1의 바이오매스의 건조 중량을 13.76%의 오일 수율과 함께 138시간의 발효로 얻었으며, 이어서 건조 중량을 기초로 하여 오일 추출 과정이 최적화되었음을 나타낸다.
실시예 8: 맥아 추출물 비함유의 유가식 발효
배지 비용을 감소시키기 위해, 배지 중 맥아 추출물을 배제시키고 유가식 발효를 수행하였다. 다른 모든 발효 파라미터는 일정하게 유지시켰다(실시예 7에서 기술된 바와 동일하게). 발효기를 136시간 동안 작동시키고, 글리세롤 수준이 8 g/L 미만으로 떨어지면 6%v/v 글리세롤을 공급물로서 발효기에 첨가하였다. 도 12에 도시된 결과는 30.1 g/L의 바이오매스의 건조 중량과 함께 104의 최대 O.D.을 136시간에 얻었음을 나타낸다. 오일 수율은 건조 중량을 기초로 하여 21%였다. 따라서, 맥아 추출물은 바이오매스 수율을 저하시키지 않고 배지로부터 제거될 수 있다.
실시예 9: 맥아 추출물 비함유의 27 L 수준에서의 유가식 발효 대규모화
실시예 8에 기술된 유가식 발효를 Bioflow-5000 발효기(New Brunswick)에서 27 L로 대규모화하였다. 임펠러(impeller)의 팁 속도당 350rmp에서 교반을 수행하는 것을 제외하고 다른 모든 발효 파라미터는 일정하게 유지시켰다. 발효기를 112시간 동안 작동시키고, 실시예 8에서 기술된 바와 같이 글리세롤 수준이 8 g/L 미만으로 떨어지면 6% v/v 글리세롤을 공급물로서 발효기에 첨가하였다. 도 13에 도시된 결과는 31.8 g/1의 바이오매스의 건조 중량과 함께 96.36의 최대 O.D.을 112시간에 얻었음을 나타낸다. 오일 수율은 건조 중량을 기초로 하여 22%였다.
실시예 10: 질소원으로서 오일 제거된 크립토코쿠스 효모를 사용하는 유가식 발효
보다 경제적일 수 있는 공정을 만들기 위해, 배지 중 빵효모 자가용해물을 다른 발효로부터 수거된 오일 제거된 크립토코쿠스 쿠르바투스 효모 세포로 교체하였다. 다른 모든 배지 성분 및 발효 조건은 실시예 8에서 기술된 바와 동일하였다. 발효기 배지는 미정제 글리세롤 1% w/v; CSL 2% w/v 및 크립토코쿠스 효모 자가용해물 0.5% w/v로 구성되었다. 발효를 28℃ 및 pH 5.5에서 수행하였다. 발효기를 136시간 동안 작동시키고, 실시예 8에서 기술된 바와 같이 글리세롤 수준이 8 g/L 미만으로 떨어지면 7.5% v/v 글리세롤을 공급물로서 발효기에 첨가하였다. 도 14에 도시된 결과는 40.6 g/L의 효모 세포 바이오매스의 건조 중량과 함께 144의 최대 O.D.을 112시간에 얻었음을 나타낸다. 오일 수율은 건조 중량을 기초로 하여 14.8%였다.
실시예 11: 동일한 조성을 갖는 생성 배지 및 시드를 사용하는 유가식 발효
선행하는 모든 배치에서, 시드 접종물은 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 항상 MGYP 배지에서 성장되었다. 그러나, 바이오디젤은 경쟁적 가격을 가져야 하는 일상 제품이고, 이에 따라 모든 경제화 면에서 보장된다. 따라서, 미정제 글리세롤 1 % w/v; CSL 2% w/v 및 크립토코쿠스 효모 자가융해물 0.5% w/v로 구성된, 생성에 사용되는 배지와 동일한 저가의 배지에서 시드 접종물을 성장시켰다.
유가식 발효를 위한 배지를 20% v/v 시드 접종물로 접종시키고, 28℃ 및 pH 5.5에서 발효를 수행하였다. 발효기가 114시간 동안 작동되고, 글리세롤 수준이 8 g/L 미만으로 떨어지면 공급물로서 4.5% v/v 글리세롤을 발효기에 첨가하는 것을 제외하고, 다른 모든 파라미터는 실시예 10에서 기술된 바와 동일하였다.
모든 공급 동안에 최종 농도가 1%가 되도록 농축된 글리세롤 원액으로부터 공급물을 첨가하였다. 도 15에 도시된 결과는 31.8 g/1의 효모 세포 바이오매스의 건조 중량과 함께 116.5의 최대 O.D.을 114시간에 얻었음을 나타낸다. 오일 수율은 건조 중량을 기초로 하여 20.16%였다. 글리세롤 공급물의 양은 글리세롤의 완전한 이용 및 발효 말기에서의 임의의 잔류 글리세롤의 제거를 보장하도록 감소된다.
실시예 12: 동일한 조성을 갖는 생성 배지 및 시드를 사용하는 유가식 발효의 대규모화
실시예 11에서 기술된 유가식 발효의 대규모화를 27 L 규모에서 수행하였다. 발효기 배지 및 시드 배지 둘 모두 미정제 글리세롤 1% w/v; CSL 2% w/v 및 크립토코쿠스 효모 자가융해물 0.5 % w/v로 구성되었다. 시드 접종물을 유가식 발효 배지에 20% v/v로 첨가하고, 28℃ 및 pH 5.5에서 발효를 수행하였다. 발효의 규모(5L 대 27 L)를 제외하고, 다른 파라미터는 실시예 11에서 기술된 바와 동일하였으며, 본 실시예에서는 발효기로서 Bioflow-5000 발효기(New Brunswick)를 사용하였다. 발효기를 134시간 동안 작동시키고, 글리세롤 수준이 8 g/L 미만으로 떨어지면 공급물로서 4.5% v/v 글리세롤을 발효기에 첨가하였다. 모든 공급 동안에 최종 농도가 1%가 되도록 농축된 글리세롤 원액으로부터 공급물을 첨가하였다. 도 16에 도시된 결과는 32.8 g/L의 효모 세포 바이오매스의 건조 중량과 함께 111.6의 최대 O.D.을 134시간에 얻었음을 나타낸다. 오일 수율은 건조 중량을 기초로 하여 21.5%인 것으로 산출되었다.
실시예 13: 효모 세포로부터의 오일 추출( 폴츠 오일 추출법)
상기 실시예 중 어느 하나에 기술된 바와 같은 발효 방법에 의해 생성된 효모 바이오매스를 클로로포름:메탄올(2:1) 혼합물의 20 용적비(20ml의 용매 혼합물 중에 1g)로 균질화시켰다. 분산 후, 전체 혼합물을 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 밤새 실온에서 교반하였다. 균질화물을 원심분리하여 액체 상을 회수하였다. 용매를 0.2 용적비(20ml에 대해 4 ml)의 물 또는 5 % 소듐 설페이트/NaCl 용액으로 세척하였다. 수초 동안 볼텍싱(vortexing)시킨 후, 혼합물을 저속(2000 rpm)에서 원심분리시켜 두 상을 분리시켰다. 사이포닝(siphoning)으로 상층을 제거한 후, 지질을 함유하는 하층의 클로로포름 상을 진공 하에 회전 증발기에서, 또는 용적이 2 내지 3ml 미만인 경우에는 질소 스트림 하에서 증발시켰다.
대안으로, 효모 바이오매스로부터의 오일 추출은 n-헥산-이소프로필 알코올을 사용하여 수행될 수 있다. 3:2 비의 n-헥산:IPA을 사용하였다. 전형적인 배치로, 50 그램(건조 세포 중량)의 세포를 5.4 L n-헥산 및 3.6 L IPA와 혼합하고, 실온에서 밤새 교반하였다. n-헥산 층을 완전히 분리시킨 후, 1L의 물을 혼합물에 첨가하고, 교반하였다. n-헥산 층을 회수하고, 회전증발기에서 증발시켜 오일을 회수하였다.
실시예 14: 효모로부터 추출된 오일의 에스테르교환반응(transesterification )
바이오디젤 생성을 위해, 실시예 13에서 상기 기술된 바와 같이 피치아 쿠드 리아브제비, MTCC 수탁번호 5493로부터 추출된 오일을 에스테르교환반응으로 처리하였다. 전형적으로, 0.8 ml의 메탄올을 10 g의 오일에 첨가하고, 1시간 동안 150rpm에서 철저히 혼합하였다. 혼합물을 H2S04(0.1%)로 산성화시키고, 산성화 반응을 35℃, 150rpm에서 1시간 동안 수행하였다. 메탄올 중에 용해된 NaOH(0.4%)을 일정하게 교반하면서 서서히 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 150rpm에서 일정하게 교반하면서 1시간 동안 70℃에서 유지시켰다. 이후, 반응 혼합물을 상분리를 위해 따로 두고, FAME(바이오디젤)을 함유하는 상층을 제거하고, 분석하였다.
실시예 15: 직접 에스테르교환반응에 의한 효모 세포로부터의 FAME 추출
FAME을 리(Lee) 등의 과정에 대한 직접 에스테르교환반응에 의해 추출하였다. 간략하게, 상기 실시예 중 어느 하나에서 기술된 바와 같이 발효된 냉동 건조된 세포(lg)를 10ml의 메탄올성 황산(메탄올 중의 0.1% 황산)의 혼합물에 첨가하고, 격렬하게 혼합하였다. 10ml의 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 24시간 동안 80℃로 가열하였다. 에스테르교환반응 동안에 혼합물에 인공 산화방지제(프로필 갈레이트)를 첨가한 후, 혼합물을 냉각시켰다. 이후, 20ml의 물을 첨가하고, 격렬하게 흔들어 주었다. 상분리를 위해 혼합물을 방치한 후(12시간), 클로로포름 추출물로부터 FAME를 회수하였다.
실시예 16: 발효액 및 오일 추출물의 균질화
세포 매스를 수집하기 위한 원심 분리 단계를 없애기 위해, 발효액의 직접 균질화를 수행하였다. 발효액을 균질화기에서 80bar의 압력 하에 4℃에서 균질화처리하여 세포를 파괴하였다. 1L의 세포에 대한 통과 기간은 4분이었다. 세포를 파괴하기 위해 5회 통과가 수행되었다. 균질화된 세포를 헥산(1:2 비 또는 균질화된 세포:헥산)으로 혼합하여 오일을 추출하였다. 추출 과정을 1시간 동안 950rpm에서 50L 교반기 탱크에서 수행하였다. 상 분리 후, 수성층을 제거하고, 오일을 회수하기 위해 농축된 헥산층에 이소프로필 알코올("IPA")을 첨가하였다.
실시예 17: GC 에 의한 FAME 의 분석
실시예 16에서 기술된 바와 같이 추출된 FAME 에스테르를 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)가 구비된 가스 크로마토그래피(Agilent 계열)로 분석하였다. 수펠코 오메가 왁스(Supelco omega wax) 250 융합된 모세 실리카 컬럼(capillary silica column)(30m x 0.25m)에서 분석을 수행하였다. 오븐 시간-온도 프로파일은 하기와 같다: 140℃(초기), 240℃까지 분당 4℃, 240℃(lO분), 총 작업 시간 30분. FAME의 확인 및 정량화를 각각의 FAME 관련 표준안(Sigma)을 사용하여 수행하였다.
실시예 18: 지질의 비교 분석
실시예 17에서 기술된 바와 같은 피치아 쿠드리아브제비(MTCC 5493)로부터 추출된 오일의 지방산 함량을 C. 쿠르바투스 오일 및 자트로파(Jatropha) 오일의 지방산 함량과 비교하였다.
크립토쿠스 쿠르바투스의 오일 추출은 n-헥산:IPA을 3:2의 비로 사용하여 수행하였다. 원심분리된 습윤화 세포(500 g)를 9L의 n-헥산:IPA(3:2)과 혼합하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 물(1L)을 혼합물에 첨가하여 n-헥산 층을 완전히 분리하였으며, 이는 교반 즉시 일어났다. 오일을 n-헥산 층으로부터 회전증발기에서 용매를 증발시킴으로써 회수하였다. 속슬렛 장치(Soxhlet apparatus)에서 분쇄된 자트로파 쿠르카스 시드를 석유 에테르로 추출함으로써 자트로파 오일을 얻었다. 시드 중의 오일을 용매 중에서 추출하였으며, 이후 용매를 회전증발기에서 증발시켜 오일을 얻었다.
P. 쿠드리아브제비 및 C. 쿠르바투스(표 1)의 지방산 프로파일을 자트로파 오일의 지방산 프로파일과 비교할 수 있으며, 이는 바이오디젤을 생성하기 위한 효모 오일의 적합성을 제시한다. 이는 최초로 피치아 균주가 축적 오일(유질)임을 나타내는 것이다. 일반적으로, 피치아 종은 효모에서 분자 유전 기술에 잘 사용되는 것으로 고려되어, 광범위하게 연구되어 왔다. 따라서, 개선된 오일 생성을 위한 피치아 균주의 미래의 조작은 이러한 효모 균주의 지식 및 용이한 조작으로 인해 훨씬 더 쉬운 작업이 될 것이다. 피치아의 오일 조성은 바이오디젤을 생성하기 위해 널리 공지되어 있는 자트로파 오일 중에 존재하는 모든 공지된 지방산으로 이루어졌다. 따라서, 피치아로부터의 오일은 또한 바이오디젤 생성에 적합한 것으로 간주된다.
표 1
오일 샘플의 비교 분석
Figure pct00002
따라서, 본 기재는 수탁번호: MTCC 5493로 기탁된 것과 같은 유질 효모 피치아 쿠드리아브제비에 의한 지질 생성을 위한 간단한 유가식 공정을 기술하고 있다. 상기 공정은 미정제 글리세롤 및 CSL을 함유하는 저비용 배지를 특징으로 한다. 이러한 산업 부산물들의 사용은 생산 비용을 감소시키면서 바이오매스 및 지질 생산성을 증가시킨다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명의 기본적인 신규한 특징으로 기술하였으나, 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고, 형태 및 상세사항에 있어서 다양한 누락 및 대체 및 변경이 가능할 수 있는 것으로 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 동일한 결과를 달성하는데 실질적으로 동일한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 그러한 엘리먼트 및/또는 방법 단계의 모든 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 분명하게 의도된다.

Claims (28)

  1. MTCC 수탁번호 5493으로 기탁되거나 동정된 피치아 쿠드리아브제비(pichia kudriavzevii)의 분리된 효모 세포.
  2. 수탁번호 MTCC 5493로서 기탁되거나 동정된 피치아 쿠드리아브제비 균주의 분리된 효모 세포.
  3. 제 1항에 있어서, 효모 세포가 배양 배지에 존재하는 분리된 효모 세포.
  4. 제 3항에 있어서, 배양 배지가 미정제 글리세롤, 옥수수 침지액, 및 효모 자가용해물을 포함하는 분리된 효모 세포.
  5. 제 1항의 분리된 효모 세포에 의해서 생산된 오일을 포함하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 오일이 약 10% 이상의 팔미트산, 약 8% 이상의 팔미톨레산, 약 1% 이상의 스테아르산, 약 41% 이상의 올레산, 약 15% 이상의 리놀레산, 및 약 6% 이상의 리놀렌산을 포함하는 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 추출된 오일이 에스테르교환반응에 주어지는 조성물.
  8. a) 제 1항의 분리된 효모 세포 및 b) 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 효모 자가용해물을 포함하는 배양 배지를 포함하며, pH가 약 5.5인 조성물
  9. 제 2항의 분리된 효모 세포를 배양하여 세포에 의한 오일 생산을 유도하는 방법으로서,
    a) 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 효모 자가용해물을 포함하며, 약 5.5의 pH를 지니는 배양 배지를 제공하고;
    b) 약 28℃에서 약 100 시간 이상 동안 유가식(fed batch) 발효를 이용하여 배양 배지에서 제 2항의 효모 세포를 발효시킴을 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 발효가 약 110 시간 이상 동안 수행되는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 유가식 발효가 발효 동안 글리세롤을 첨가함을 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 첨가된 글리세롤이 미정제 글리세롤을 포함하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 발효 중의 글리세롤 농도가 약 8g/L 미만인 경우에 글리세롤이 배양 배지에 첨가되는 방법.
  14. 제 9항에 있어서, 효모 세포의 O.D.이 약 110 내지 150일 때까지 발효가 계속되는 방법.
  15. 제 9항에 있어서, 발효가 건조 중량 기준으로 약 14% 이상의 오일 수율을 발생시키는 방법.
  16. 제 9항에 있어서, 발효가 건조 중량 기준으로 약 20% 이상의 오일 수율을 발생시키는 방법.
  17. 제 9항에 있어서, 발효 후의 발효된 세포 바이오매스가 건조 중량 기준으로 약 30g/L 이상인 방법.
  18. 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 오일을 생산하는 방법으로서, 방법이 a) 오일 생산 조건하에 제 1항의 분리된 효모 세포를 배양하고; b) 배양된 효모 세포로부터 오일을 추출함을 포함하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 추출된 오일을 에스테르교환반응시킴을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 오일 생산 조건 하의 배양이
    a) 약 1 w/v%의 미정제 글리세롤, 약 2 w/v%의 옥수수 침지액, 약 0.5 w/v%의 효모 자가용해물을 포함하며, 약 5.5의 pH를 지니는 배양 배지를 제공하고;
    b) 약 28℃에서 약 100 시간 이상 동안 유가식(fed batch) 발효를 이용하여 배양 배지에서 제 1항의 효모 세포를 발효시킴을 포함하는 방법.
  21. 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법으로서,
    a) 오일 생산 조건하에 제 2항의 분리된 효모 세포를 배양하고;
    b) 배양된 효모 세포로부터 오일을 추출하고;
    c) 추출된 오일을 에스테르교환반응시킴을 포함하는 방법.
  22. 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법으로서,
    a) 오일 생산 조건하에 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 수탁번호 5493을 포함하는 효모 세포를 배양하고;
    b) 직접적인 에스테르교환반응에 의해서 지방산 메틸 에스테르를 추출함을 포함하는 방법.
  23. 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법으로서,
    a) 오일 생산 조건하에 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 수탁번호 5493을 포함하는 효모 세포를 배양하고;
    b) 배양된 효모 세포로부터 지방산 메틸 에스테르를 추출함을 포함하는 방법.
  24. 지방산 메틸 에스테르를 포함하는 바이오디젤을 생산하는 방법으로서,
    a) 오일 생산 조건하에 제 1항의 분리된 효모 세포를 배양하고;
    b) 배양된 효모 세포로부터 지방산 메틸 에스테르를 추출함을 포함하는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 세포가 오일 생산 조건하에 오일로서 그 중량의 약 50%를 축적할 수 있는 분리된 효모 세포.
  26. 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 5493의 생물학적 순수 배양액.
  27. 피치아 쿠드리아브제비, MTCC 5493의 분리된 효모 세포를 포함하는 미생물 조성물.
  28. MTCC 수탁번호 5493으로 기탁되거나 동정된 피치아 쿠드리아브제비의 분리된 효모 세포, 이의 조성물 및 본원에서 실질적으로 실시예 및 도면에 예시된 상기 청구된 바이오디젤에서의 이의 적용 방법.
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