CN104293676A - 一株拟微绿球藻突变株及其应用 - Google Patents

一株拟微绿球藻突变株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株拟微绿球藻突变株及其应用，本发明的拟微绿球藻突变株分类学命名为Nannochloropsis sp.。本发明的拟微绿球藻突变株具有性能稳定、环境适应性强，且杀虫剂和高温耐受能力强的优势。

Description

一株拟微绿球藻突变株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株拟微绿球藻突变株ENN11-4及其应用。 
背景技术
近年来，全球石油资源日趋枯竭，能源短缺问题日益严重，同时环境污染、生态破坏等问题日益严重，开发绿色、清洁的生物燃料代替传统石化燃料，已成为国际研究热点。在生物燃料的众多原料中，微藻具有光合作用效率高、生长周期短、含油量高、环境适应性强、易于遗传改良等特点，被认为是最有潜力替代石油的生物质资源。微藻生物质经过生物冶炼不仅能生产出生物柴油、优质航空汽油等多种生物燃料，而且还能开发出平台化合物、高蛋白食品或饲料等产品，可广泛应用于工农业和交通领域。 
拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)是一种重要的海产经济微藻，其生长速度快，抗逆性强，脂肪酸组成简单，富含EPA，是一种非常有潜力的藻种。拟微绿球藻的最适生长温度为25℃～30℃，当温度超过35℃时，生长受抑制，如果长期处于高温将导致藻细胞逐渐死亡。我国大部分地区夏季炎热高温，拟微绿球藻难以在夏季进行大规模养殖。另外，微藻室外大规模培养中，容易滋生原生动物、细菌等污染，严重污染藻株的生长。使用杀虫剂虽然能有效抑制污染，但会伤害藻株，导致藻细胞活性下降而减产，杀虫剂浓度过高时会造成藻细胞死亡。如果能通过诱变获得耐受杀虫剂和高温的藻株，将减少因使用杀虫剂和高温带来的减产问题，对拟微绿球藻稳定、高产养殖具有重要意义。 
脯氨酸在植物逆境胁迫响应中起重要作用，Pro含量较高的植株对NaCl、 水分胁迫或冷害逆境、高温逆境有较强的抗性，通过耐羟脯氨酸(HYP)抗性系的筛选可获高脯氨酸积累的变异,该方法已在大麦、小麦、水稻、马铃薯、菜心和烟草等多种植物上进行了研究。次氯酸钠(次氯酸钙)是作为一种真正高效、广谱、安全的强氧化剂、杀藻药剂，其杀藻灭菌原理主要是通过它的水解形成次氯酸，次氯酸再进一步分解形成新生态氧，新生态氧的极强氧化性使菌体和藻细胞内的蛋白质变性，从而使菌体和藻细胞致死。同时，氯离子还能显著改变细菌和藻细胞内的渗透压使其丧失活性而死亡。使用次氯酸钠(次氯酸钙)和羟脯氨酸双重压力筛选，目标是获得耐受杀虫剂同时抗逆性增强的优势突变株。 
发明内容
针对已有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株拟微绿球藻突变株及其应用。 
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案： 
本发明提供了一株拟微绿球藻突变株ENN11-4，为Nannochloropsis sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年6月18日，保藏编号为CGMCC No.9320。 
本发明分离的拟微绿球藻突变株ENN11-4具有对环境适应能力强，且杀虫剂和高温耐受能力强，油脂含量高，对CO2的处理能力强的优势。 
本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-4的培养方法，所述方法包括：将拟微绿球藻藻株ENN11-4绿色细胞接种在海水培养基中，其中光照强度为50-500μmol/m2.s，pH值为7-9，温度为25-42℃。 
本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-4在拟微绿球藻高温养殖中的应 用。 
优选地，所述高温为35-42℃。 
本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-4在拟微绿球藻养殖中使用杀虫剂时的应用。 
优选地，所述杀虫剂的有效氯浓度为5-25ppm。 
本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-4在环境保护中的应用。 
本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-4在脂肪酸生产中的应用。 
本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-4在营养品、饲料或饵料生产中的应用。 
本发明还提供了拟微绿球藻突变株ENN11-4在生物燃料生产中的应用。 
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 
本发明分离得到的拟微绿球藻突变株具有性能稳定、环境适应性强，且杀虫剂和高温耐受能力强的优势。 
附图说明
图1是在室内3cm柱式反应器中常规培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生长曲线图。 
图2是在室内5cm柱式反应器中常规培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生长曲线图。 
图3是在室内3cm柱式杀虫剂压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生长曲线图。 
图4是在室内5cm柱式低浓度杀虫剂压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生长曲线图。 
图5是在室内5cm柱式高浓度杀虫剂压力培养本发明的拟微绿球藻 ENN11-4的生长曲线图。 
图6是在室内5cm柱式高温压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的温度变化曲线图。 
图7是在室内5cm柱式高温压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生长曲线图。 
图8是在室内板式杀虫剂压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生长曲线图。 
图9是在室外板式杀虫剂压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的光照变化曲线图。 
图10是在室外板式杀虫剂压力培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生长曲线图。 
图11是在室外扩大培养本发明的拟微绿球藻ENN11-4的生物量图。 
图12是本发明的拟微绿球藻ENN11-4进行室外板式废气养殖的OD750变化曲线图。 
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下： 
在本发明的一种典型的实施方式中，本发明分离的拟微绿球藻突变株ENN11-4，为Nannochloropsis sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年6月18日，保藏编号为CGMCC No.9320。 
本发明分离的拟微绿球藻突变株ENN11-4具有对环境适应能力强，且杀虫剂和高温耐受能力强，油脂含量高，对CO2的处理能力强的优势。 
本发明提供的拟微绿球藻ENN11-4可以在25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃下生长。 
本发明提供的拟微绿球藻ENN11-4可以在5ppm、10ppm、15ppm、20ppm或25ppm的有效氯压力下生长。 
本发明的拟微绿球藻突变株ENN11-4的培养方法，包括将拟微绿球藻藻株ENN11-4绿色细胞接种在海水培养基中进行培养，其中光照强度为50μmol/m2.s-500μmol/m2.s，pH值为7-9，温度为25℃-42℃。 
在本发明的拟微绿球藻ENN11-4的培养方法中，光照强度可以为50μmol/m2.s、100μmol/m2.s、150μmol/m2.s、200μmol/m2.s、250μmol/m2.s、300μmol/m2.s、350μmol/m2.s、400μmol/m2.s、450μmol/m2.s或500μmol/m2.s；pH值可以为7、7.2、7.5、7.8、8、8.1、8.5、8.8或9；温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。 
本发明的拟微绿球藻ENN11-4可以应用在拟微绿球藻高温养殖中，其中，所述高温可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。 
本发明的拟微绿球藻ENN11-4可以应用在拟微绿球藻养殖中使用杀虫剂的环境下，所述杀虫剂的有效氯浓度可以是5ppm、10ppm、15ppm、20ppm或25ppm。 
本发明的拟微绿球藻ENN11-4可以应用在环境保护中，所述环境保护为CO2减排。 
本发明的拟微绿球藻ENN11-4可以应用在脂肪酸的生产中，所述脂肪酸是癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸。 
本发明的拟微绿球藻ENN11-4可以应用在营养品、饲料或饵料的生产中，所述营养品、饲料或饵料是包含癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的营养品、饲料或饵料。 
本发明的拟微绿球藻ENN11-4可以应用在生物燃料的生产中，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。 
以下将结合具体实施方式和具体实施例来进一步说明本发明的有益效果。 
具体实施例1 ENN11-4藻株的筛选和获得
将Nannochloropsis sp.的无菌藻液经EMS诱变处理，加入次氯酸钠杀虫剂和羟脯氨酸反复压力处理和初筛、复筛，最终获得一种性能优良的突变株ENN11-4。该突变藻株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9320。 
具体实施例2 ENN11-4藻株的室内柱式反应器常规培养评价
1)3cm柱式反应器评价：将处在对数生长期的ENN11-4绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基中，使细胞密度达到OD750为0.8-1.2之间，以野生型ENN11为对照。 
培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，L：D＝16：8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为30mm内径、长度600mm的柱式反应器。培养8天，测定藻株生长曲线。 
如图1所示，常规条件下培养ENN11-4生长明显优于野生株ENN11，生长速度较对照株提高19.3％。 
2)5cm柱式反应器评价：将处在对数生长期的ENN11-4绿色游动细胞接 种在配制好的海水培养基中，使细胞密度达到OD750为0.8-1.2之间，以野生型ENN11为对照。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，L：D＝16：8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为50mm内径、长度600mm的柱式反应器。培养7天，测定藻株生长曲线。 
如图2所示，常规条件下培养ENN11-4生长明显优于野生株ENN11，生长速度较对照株提高12.7％。 
具体实施例3 ENN11-4藻株的室内柱式反应器杀虫剂压力培养评价
1)3cm柱式反应器杀虫剂压力评价：将处在对数生长期的ENN11-4绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基中，使细胞密度达到OD750为0.8-1.2之间，以野生型ENN11为对照。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，L：D＝16：8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为30mm内径、长度600mm的柱式反应器。接种初始加入有效氯25ppm压力，避光处理8小时，再光照培养，培养7天，测定藻株生长曲线。 
如图3所示，加入有效氯压力后，野生株ENN11受到明显抑制，基本停止生长甚至变黄死亡，而ENN11-4能恢复后继续生长，耐杀虫剂能力明显优于对照株。 
2)5cm柱式反应器杀虫剂压力评价：将处在对数生长期的ENN11-4绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基中，使细胞密度达到OD750为0.8-1.2之间，以野生型ENN11为对照。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，L：D＝16：8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为50mm 内径、长度600mm的柱式反应器。杀虫剂压力处理采取低浓度和高浓度两种方式，低浓度处理分别在接种初始和培养第4天加入5ppm有效氯压力，高浓度处理分别在接种初始和培养第4天加入10ppm有效氯压力，培养7天，测定藻株生长曲线。 
如图4、图5所示，ENN11-4耐杀虫剂能力明显优于野生株ENN11，低浓度和高浓度压力处理后生长速度较对照株分别提高19.9％和32.5％。 
具体实施例4 ENN11-4藻株的室内柱式反应器高温压力培养评价
将处在对数生长期的ENN11-4绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基中，使细胞密度达到OD750为0.8-1.2之间，以野生型ENN11为对照。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，L：D＝16：8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为50mm内径、长度600mm的柱式反应器。冷暖水机控温，第3d开始高温处理，藻液温度达到38℃，第4d至第7d，每天有2h藻液温度都达到42℃(温度变化如图6所示)。培养7天，测定藻株生长曲线。 
如图7所示，高温处理开始后，野生株ENN11生长放缓，ENN11-4藻株受温度升高的影响相对较小，高温处理后生长速度较对照株提高25.0％。 
具体实施例5 ENN11-4藻株的室内板式反应器杀虫剂压力培养评价
将处在对数生长期的ENN11-4接种在50*50*5cm板式反应器中，使用海水培养基进行养殖，养殖体积10L。以野生型ENN11作对照，每个藻株设定2个平行样。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，L：D＝16：8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。在接种初始和培养第4天分别加入5ppm有 效氯压力处理。培养6天，测定藻株生长曲线。 
如图8所示，ENN11-4耐杀虫剂能力明显优于野生株ENN11，杀虫剂压力处理条件下生长速度较对照株提高18.9％。 
具体实施例6 ENN11-4藻株的室外板式反应器杀虫剂压力培养评价
将处在对数生长期的藻种接种在50*50*5cm板式反应器中，使用海水培养基进行养殖，养殖体积10L。以野生型ENN11作对照，每个藻株设定2个平行样，置于室外自然条件进行生长培养。培养过程光照强度变化如图9所示。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，pH值控制在7-9之间。在接种初始、培养第2天和第4天分别加入5ppm、5ppm和10ppm有效氯压力处理。培养6天，测定藻株生长曲线。 
如图10所示，ENN11-4室外生长明显优于野生株ENN11，在室外自然条件下生长，加入杀虫剂压力，生长速度较对照株提高18.9％。 
具体实施例7 ENN11-4藻株的室外扩大培养
将处在对数生长期的藻种接种在30*15*100cm板式反应器中，藻液高度60cm，养殖体积27L，使用海水培养基进行半连续养殖，以野生型ENN11作对照，每个藻株设定2个平行样，置于室外自然条件下，分别进行春、夏、秋三个季节的生长培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，pH值控制在7-9之间。在培养过程中，实时镜检藻株生长状况，根据污染情况随时加入适当浓度的杀虫剂进行污染处理。夏季藻液温度均较高，大部分时间最高温度超过35℃，最高温度超过了40℃。 
经过3个季节的室外扩大半连续养殖，比较藻株每天的平均增长生物量，不同季节突变株ENN11-4生长相比野生株ENN11都有明显提高(图11)。可见突变株ENN11-4室外大规模养殖相比野生株有明显优势，抗逆性、抗污染性及 耐高温性能都有显著提高，可代替野生株作为室外规模化养殖的优质种质资源。 
具体实施例8 ENN11-4藻株高含CO 2 的废气养殖
将处在对数生长期的藻种接种在50*50*5cm板式反应器中，使用海水培养基进行养殖(不添加C源)，置于室外自然条件进行生长培养。通入一定比例的CO2(化工厂废气，纯度95％以上)，控制PH值在6.9-8.1之间。培养过程中每日取样测定生物量(图12)。 
本实施例中使用废气养殖10天，突变株ENN11-4养殖状况良好，产量平均可达15.6g/m2/d。本实施例中微藻培养时培养基中没有添加C源，藻体生长固定的CO2来自培养过程中通入的一定比例的CO2(CO2来源于化工厂，纯度95％以上)，以每吨藻约可固定2吨CO2为标准(参考“微藻能源技术开发和产业化的发展思路与策略”，黄英明等，生物工程学报，2010，26(7)：907-913)，本实施例中突变株ENN11-4可实现CO2减排31.2g/m2/d。 
具体实施例9 ENN11-4藻株的油脂积累
将处在对数生长期的ENN11-4绿色游动细胞接种在30mm内径、长度600mm的柱式反应器中，使用海水培养基进行培养。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，L：D＝16：8光暗周期培养。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养进行到第8天，将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥再进行真空冷冻干燥。 
干燥完成后，测定其油脂组分含量如下表1所示，分析方法如下： 
1)脂肪酸提取： 
取50mg或100mg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20mL的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4mL 10％DMSO-Methanol溶液，40℃ 砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟；然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟，3500转离心，转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1：1的乙醚、正己烷4-8mL，4℃下磁力搅拌抽提1小时，3500转离心，转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水使四者(水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)体积比例为1：1：1：1，震荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5mL塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重。 
表1 气相色谱测定的ENN11-4第8天收集样品的总脂组分 
“/”代表没有检测到该成分 
2)脂肪酸分析： 
按照上面的方法进行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820气相色谱 仪进行气相色谱分析(色谱条件为载气：氮气流量1mL/min、氢气流量30mL/min、空气流量300mL/min，进样口温度：280℃，检测器温度：280℃，检测器类型：FID，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，分流比：4：1。分析方法：内标法(气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相)。 
本实施例中没有采取措施以诱导脂肪酸的积累，养殖8天脂肪酸含量达到43.80％，EPA含量达到3.92％。如采取低氮高光的诱导措施，脂肪酸含量会更高。 
通过对本发明的拟微绿球藻突变株ENN11-4的脂肪酸组分进行分析显示，其油脂含量高达43.8％，其中约72.3％为C16-C18脂肪酸，62.7％为C16脂肪酸，9.55％为C18脂肪酸，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的39.9％，可以作为生物柴油的生产原料。由此可见，本发明的藻株ENN11-4可用于生物柴油生产。 
ENN11-4的不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的39.9％，多不饱和脂肪酸含量占脂肪酸总量的16.7％，其中EPA含量占脂肪酸总量的8.95％，不饱和脂肪酸含量丰富，可用于多不饱和脂肪酸的生产。 
具体实施例10 ENN11-4用于营养品、饲料、饵料的生产
本发明提供的藻株中的蛋白质含量为10～30％，脂肪含量为10～60％，其中不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸含量的35％-60％，是做营养品、饲料、饵料的最佳原料来源。 
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。 

Claims (10)

1.一株拟微绿球藻突变株ENN11-4，为Nannochloropsis sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.9320，保藏日期为2014年6月18日。
2.如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-4的培养方法，其特征在于，所述方法包括将拟微绿球藻藻株ENN11-4绿色细胞接种在海水培养基中，其中光照强度为50-500μmol/m2.s，pH值为7-9，温度为25-42℃。
3.如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-4在拟微绿球藻高温养殖中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高温为35-42℃。
5.如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-4在拟微绿球藻养殖中使用杀虫剂时的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述杀虫剂的有效氯浓度为5-25ppm。
7.如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-4在环境保护中的应用。
8.如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-4在脂肪酸生产中的应用。
9.如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-4在营养品、饲料或饵料生产中的应用。
10.如权利要求1所述的拟微绿球藻突变株ENN11-4在生物燃料生产中的应用。
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