WO2018028403A1 - 制备β-胡萝卜素晶体的方法 - Google Patents

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wet
carotene
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汪志明
李翔宇
陆姝欢
田勇
周强
易德伟
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嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Definitions

  • the invention relates to a method for preparing ⁇ -carotene crystals, in particular to a method for preparing microbial-derived ⁇ -carotene crystals.
  • Carotenoids are nutrients that are widely found in plants, animals, and microorganisms and are closely related to human health. They mainly include ⁇ -carotene, lycopene, and lutein. Carotenoids not only have high medicinal value such as anti-cancer and anti-oxidation, but also an important source of vitamin A in the human body. As a food additive and a nutrient enhancer, carotenoids have been recognized by international organizations such as the FDA, the European Community, and the WHO. In recent years, carotenoids have been widely used in medicine, food, health care products, and cosmetics.
  • Natural carotenoids are mainly from plants.
  • plant raw materials have shortcomings such as insufficient supply and low content, and cannot be industrially utilized on a large scale.
  • Microorganisms have the advantages of fast growth, high content, and no seasonal influence. Therefore, it is an ideal method to produce carotenoids by microbial fermentation.
  • the main processes for extracting carotenoids from B. trispora include: high-quality homogenization of wet cells mixed with water, wet and dry cells and organic solvent extraction. After the crude extract is obtained, the steps of separation and purification are carried out to obtain a high content of crystals.
  • Chinese Patent No. 01804173.6 discloses the separation of a carotenoid crystal, which is mixed with water and then homogenized by a high pressure homogenizer to extract a mixture of carotenoids, and then the mixture is washed with ethanol and brine. The method has high temperature when extracting carotenoids, and is easy to cause oxidative degradation of carotenoids, and is difficult to separate and purify, and the yield is extremely low.
  • 201210180281.4 No. discloses a method for extracting ⁇ -carotene by using high pressure steam to break the wall.
  • this method uses higher temperatures and pressures, which tends to oxidize ⁇ -carotene, resulting in low product yield and affecting product quality.
  • the existing preparation of ⁇ -carotene crystals by microbial fermentation has the following disadvantages: high temperature treatment is required in the drying or extraction process, and it is easy to cause light and oxidative degradation of carotenoids, resulting in low yield and poor product quality. . Therefore, there is a need to consider an improved way to avoid loss of carotenoids during the preparation process.
  • a method for producing a ⁇ -carotene crystal of the present invention comprises the following steps:
  • an antioxidant is added.
  • the method for preparing ⁇ -carotene crystals as described above, and in the step (1), the microbial species is B. trispora, Dunaliella salina or yeast.
  • the antioxidant is dibutylhydroxytoluene, vitamin E, vitamin C palmitate, ethyl p-hydroxybenzoate or rosemary.
  • One or more of the above antioxidants are added to each of the steps (3), (4), and (6).
  • the antioxidant is preferably one of ethyl p-hydroxybenzoate, rosemary, vitamin E, dibutylhydroxytoluene, used in the above steps (3), (4), In at least one of the steps 6), it is further preferred to use dibutylhydroxytoluene, vitamin E and ethyl p-hydroxybenzoate for use in steps (3), (4) and (6), respectively, more preferably two.
  • Butylated hydroxytoluene is used in step (3)
  • vitamin E is used in step (4)
  • ethyl p-hydroxybenzoate is used in step (6).
  • the antioxidant is preferably dibutylhydroxytoluene or vitamin E, which is used in at least one of the above steps (3), (4), and (6).
  • the antioxidant is preferably vitamin E, vitamin C palmitate, dibutylhydroxytoluene or rosemary, which is used in at least one of the above steps (3), (4), (6) in.
  • the antioxidant is added in an amount of 0.1% to 5% by weight of the dry cells.
  • the mass ratio of the dry cells to the organic solvent is 1:3-1:30.
  • the organic solvent is hexane, dichloromethane, petroleum ether, ethyl acetate or acetone.
  • the method for preparing ⁇ -carotene of the invention has the following beneficial effects: due to the oxidative degradation of ⁇ -carotene, a series of volatile aroma substances are mainly produced, such as ⁇ -ionone, dihydro kiwi lactone, isophorone, oxidized Vorketone and so on.
  • a series of volatile aroma substances are mainly produced, such as ⁇ -ionone, dihydro kiwi lactone, isophorone, oxidized Vorketone and so on.
  • the large amount of these oxidative degradation products has a great influence on the purification of ⁇ -carotene, which will affect the purity of ⁇ -carotene.
  • the antioxidants are added, which not only reduces the loss of ⁇ -carotene during the extraction process, but also increases the yield of ⁇ -carotene, the crystal of ⁇ -carotene.
  • the extraction rate is increased to 64.1%, preferably to 66.1%, further preferably to 69.1%, and further preferably to 73.3%, more preferably to 80.1%, and to obtain a higher purity and better quality ⁇ -carrot.
  • the crystals in which the purity of the obtained ⁇ -carotene is increased to 97.3%, preferably to 97.7%, further preferably to 98.1%, more preferably to 99.1%.
  • Detection method of ⁇ -carotene content of bacterial body weight accurately weigh 0.01 ⁇ 0.03g sample, accurate 0.0001g, after being broken by glass homogenizer, extract with ethyl acetate, and repeatedly extract until the sample is completely colorless. , set to 25ml. Then use a pipette to take 1ml and dilute to a certain multiple and then dilute to volume. Using ethyl acetate as a reference, the solution after constant volume was poured into a cuvette, the absorbance was measured at the maximum absorption wavelength in the range of 455 nm ⁇ 2 nm, and then ⁇ in the cells was calculated according to the ⁇ -carotene standard curve. - Carotene content.
  • m1 obtaining the crystal weight of ⁇ -carotene
  • M2 the weight of ⁇ -carotene dry cells
  • w content of ⁇ -carotene in ⁇ -carotene dry cells.
  • ⁇ -carotene crystal purity detection method refer to GB 28310-2012 national food safety standard food additive ⁇ -carotene (fermentation method).
  • the crystallization mother liquid is suction filtered to obtain coarse and wet crystals, and the coarse wet crystals are washed with 500 ml of petroleum ether, and then suction-filtered to obtain wet crystals.
  • the wet crystals are dried under vacuum at 80 ° C, -0.085 MPa for 2 hours to obtain finished carotenoid crystals. .
  • the extraction rate of the carotenoid crystal was calculated to be 73.3%, and the purity of the beta-carotene was determined to be 98.1%.
  • the yeast is inoculated and fermented, and the fermentation liquid is centrifuged to obtain a wet cell having a water content of 80.5%.
  • freeze-drying conditions vacuum 20 Pa, trap temperature is -40 ° C, and dried for 20 h.
  • the spray drying conditions are: hot air temperature 130°C, material temperature 65°C, fan frequency 45Hz, feed rate 5kg/ h.
  • the crystallization mother liquid was suction filtered to obtain coarse and wet crystals, and the crude wet crystals were further filtered with 5 L of ethanol to obtain wet crystals.
  • the wet crystals were dried under vacuum at 80 ° C, -0.085 MPa for 2 hours to obtain a finished carotenoid crystal.
  • the extraction rate of the carotenoid crystal was calculated to be 73.3%, and the purity of the beta-carotene was determined to be 98.1%.
  • freeze-drying conditions are: vacuum 20 Pa, trap temperature is -40 ° C, and dried for 20 h.
  • the spray drying conditions are: hot air temperature 130°C, material temperature 65°C, fan frequency 45Hz, feed rate 5kg/ h.
  • the method for preparing ⁇ -carotene of the invention has the following beneficial effects: in the steps of drying, solid-liquid separation and evaporative crystallization, some or all of the antioxidants are added, the loss of ⁇ -carotene during the extraction process is reduced, and ⁇ - is improved.
  • the yield of carotene and the ⁇ -carotene crystal obtained at the same time are higher in purity and better in quality.
  • antioxidants mentioned in the present invention are not limited to the types exemplified in the examples, and other products having the same effects in use are within the scope of the present invention.
  • the invention provides a method for preparing ⁇ -carotene crystals, comprising the steps of: (1) inoculating a microbial strain to ferment, (2) performing solid-liquid separation of the fermentation liquid to obtain a wet bacterial body; and (3) wet bacteria After drying, the dried cells are obtained; (4) extracting the dried cells with an organic solvent; (5) obtaining an extract after solid-liquid separation; (6) evaporating and crystallizing the extract to obtain a crystallization mother liquid; (7) crystallization mother liquid is solidified The liquid is separated to obtain coarse and wet crystals; (8) the crude wet crystals are washed with an organic solvent, and dried under vacuum to obtain ⁇ -carotene crystals; in one or more steps of steps (3), (4), and (6), There are antioxidants.
  • the invention reduces the loss of ⁇ -carotene in the extraction process, improves the yield of ⁇ -carotene, and at the same time, the obtained ⁇ -carotene crystal has higher purity and better quality.
  • the method of the invention can be applied to the field of carotenoid extraction on a large scale, and has broad market prospects.

Abstract

制备β-胡萝卜素晶体的方法，包括：（1）将微生物接种发酵，（2）发酵液固液分离得到湿菌体，（3）湿菌体干燥得到干菌体，（4）对干菌体进行有机溶剂萃取，（5）固液分离得到萃取液，（6）萃取液蒸发结晶得到结晶母液，（7）结晶母液固液分离得到粗湿晶体，（8）粗湿晶体经有机溶剂洗涤、真空干燥得到β-胡萝卜素晶体，其中在步骤（3）（4）（6）中的一个或多个步骤中添加抗氧化剂。

Description

制备β-胡萝卜素晶体的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月9日提交、申请号为201610644234.9的中国专利申请的优先权，其所公开的内容作为参考全文并入本申请。
技术领域
本发明涉及制备β-胡萝卜素晶体的方法，尤其是一种微生物来源的β-胡萝卜素晶体的制备方法。
背景技术
类胡萝卜素是一种广泛存在于植物、动物、微生物中，与人体的健康密切相关的营养物质，它主要包括β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素等。类胡萝卜素不仅具有抗癌、抗氧化等很高的药用价值，而且还是人体维生素A的重要来源。类胡萝卜素作为食品添加剂和营养增强剂，已经得到FDA、欧洲共同体、WHO等国际组织的认可，近年来更是被广泛地应用于医药、食品、保健品及化妆品等领域。
天然的类胡萝卜素主要来自于植物。但是，植物性原料存在供应不足，含量低等缺点，无法在工业上进行大规模利用。微生物具有生长繁殖快、含量高、不受季节性影响等优点，因此，利用微生物发酵生产类胡萝卜素是一种理想的方法。
目前，提取三孢布拉霉菌中的类胡萝卜素的主要工艺包括：湿菌体与水混合经高压均质提取，湿、干菌体与有机溶剂提取。得到粗提物后，分离纯化等步骤得到高含量的晶体。中国专利第01804173.6号公开了一种类胡萝卜素晶体的分离，采用湿菌体与水混合后经高压均质机均质破碎提取类胡萝卜素的混合物，再用乙醇、盐水洗涤混合物。此方法提取类胡萝卜素时的温度高，极易造成类胡萝卜素氧化降解，且分离纯化困难，收率极低。中国专利申请第201210180281.4 号公开了一种采用高压蒸汽破壁提取β-胡萝卜素的方法。但是，此方法使用的温度和压力都较高，容易使β-胡萝卜素氧化，造成产品收率低，且影响产品的品质。
现有的以微生物发酵的方式制备β-胡萝卜素晶体大都存在以下缺点：干燥或提取过程中需要经高温处理，极易造成类胡萝卜素的见光、氧化降解，造成收率低，产品品质差。因此，需要考虑一种改良的方式来避免类胡萝卜素在制备过程中的损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种能降低β-胡萝卜素氧化、提高收率和品质的制备β-胡萝卜素晶体的方法。
为实现上述目的，本发明的制备β-胡萝卜素晶体的方法，包括如下步骤：
(1)将微生物菌种接种发酵，
(2)将发酵液进行固液分离，得到湿菌体；
(3)将湿菌体干燥后得到干菌体；
(4)使用有机溶剂对干菌体进行萃取；
(5)固液分离后得到萃取液；
(6)萃取液经蒸发结晶得到结晶母液；
(7)结晶母液经过固液分离，得到粗湿晶体；
(8)粗湿晶体经有机溶剂洗涤后，真空干燥得到β-胡萝卜素晶体；
步骤(3)、(4)、(6)的至少一个步骤中，加入抗氧化剂。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，步骤(3)、(4)、(6)的一个或多个步骤中，添加有抗氧化剂。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，步骤(1)中，微生物菌种为三孢布拉霉、杜氏盐藻或酵母。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，步骤(3)中，抗氧化剂 的添加量为湿菌体重量的0.1％～5％。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，抗氧化剂为二丁基羟基甲苯、维生素E、维生素C棕榈酸酯、对羟基苯甲酸乙酯或迷迭香。
在步骤(3)、(4)和(6)中均添加上述抗氧化剂中一种或多种。
对三孢布拉霉来说，抗氧化剂优选为对羟基苯甲酸乙酯、迷迭香、维生素E、二丁基羟基甲苯中的一种，用于上述步骤(3)、(4)、(6)中的至少一个步骤中，进一步优选为选用二丁基羟基甲苯、维生素E和对羟基苯甲酸乙酯分别用于步骤(3)、(4)和(6)中，更优选为使用二丁基羟基甲苯用于步骤(3)中，使用维生素E用于步骤(4)中，使用对羟基苯甲酸乙酯用于步骤(6)中。
对杜氏盐藻来说，抗氧化剂优选为二丁基羟基甲苯或维生素E，将其用于上述步骤(3)、(4)、(6)的至少一个步骤中。
对于酵母来说，抗氧化剂优选为维生素E、维生素C棕榈酸酯、二丁基羟基甲苯或迷迭香，将其用于上述步骤(3)、(4)、(6)中的至少一个步骤中。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，步骤(4)或(6)中，抗氧化剂的添加量为干菌体重量的0.1％～5％。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，步骤(4)中，干菌体与有机溶剂质量体积比为1:3-1:30。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，步骤(4)中，萃取同时使用机械破碎的工艺，机械破碎后菌体的平均粒径不高于300μm。
如前所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，步骤(4)中，有机溶剂为己烷、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯或丙酮。
本发明制备β-胡萝卜素的方法具有以下有益效果：由于β-胡萝卜素氧化降解主要生成一系列挥发性致香物质，如β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、异佛尔酮、氧化异佛尔酮等。这些氧化降解产物的大量存在对β-胡萝卜素的纯化存在较大影响，会影响β-胡萝卜素的纯度，因 此在干燥、固液分离和蒸发结晶的过程中，部分或者全部添加抗氧化剂，既降低了提取过程中β-胡萝卜素的损失，提升了β-胡萝卜素的收率，β-胡萝卜素晶体的提取率提升至64.1％，优选提升至66.1％，进一步优选提升至69.1％，再进一步优选提升至73.3％，更优提升至80.1％，又能制得纯度更高，品质更好的β-胡萝卜素晶体，其中，得到的β-胡萝卜素纯度提升至97.3％，优选提升至97.7％，进一步优选提升至98.1％，更优选提升至99.1％。
具体实施方式
下面结合具体实例，对本发明作进一步的详细说明。
收率计算及检测纯度的标准或者方法
1、菌体重β-胡萝卜素含量的的检测方法：准确称取0.01～0.03g样品，精确0.0001g，经玻璃匀浆器破壁后，用乙酸乙酯提取，反复抽提至样品完全无色，定容到25ml。再用移液管取1ml稀释至一定的倍数后定容。以乙酸乙酯为参比，将定容后的溶液倒入比色皿中，在455nm±2nm范围内的最大吸收波长处测定吸光度，然后根据β-胡萝卜素标准曲线计算出菌体中的β-胡萝卜素含量。
2、β-胡萝卜素提取率的计算方法：
提取率(％)＝m1/(m2*w)
式中：m1：得到β-胡萝卜素晶体重量；
m2：β-胡萝卜素干菌体的重量；
w：β-胡萝卜素干菌体中β-胡萝卜素的含量。
3、β-胡萝卜素晶体纯度的检测方法：参照GB 28310-2012食品安全国家标准食品添加剂β-胡萝卜素(发酵法)。
实施例1
以杜氏盐藻为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将杜氏盐藻接种发酵，将发酵液离心得到水量为75.7％湿菌体。
2)取1kg湿菌体，向湿菌体中加入1g二丁基羟基甲苯(抗氧化剂)， 并混合均匀，真空干燥得到269.3g干菌体，真空干燥条件为：温度80℃，负压-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌体，加入到3L的四颈烧瓶中，并加入600mL二氯甲烷，用高速剪切机破碎至菌体平均粒径为181um，抽滤得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣用2L二氯甲烷进行二次萃取，抽滤得到二萃萃取液。
4)合并两次萃取液，在50℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到湿晶体，湿晶体用20ml乙酸乙酯洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经检测，β-胡萝卜素晶体的提取率为66.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.3％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为60.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为95.9％。
实施例2
以酵母为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将酵母接种发酵，将发酵液离心得到含水量为80.3％的湿菌体。
2)取上述10kg湿菌体，湿菌体重加入75g维生素E(抗氧化剂)，充分混合搅拌均匀，经冷冻干燥得到2.17kg干菌体，冷冻干燥条件为：真空20Pa，捕集器温度为-40℃，干燥18h。
3)取1kg干菌体，投入到50L的反应釜中，再加入30L正己烷，用砂磨机循环破碎至菌体平均粒径为217um，离心分离得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣继续加入30L正己烷，在55℃萃取1h，离心得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将上述结晶母液离心分离得到湿晶体，湿晶体用500ml正己烷搅拌洗涤，再次离心得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下真空干燥2h得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜晶体收率为69.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.7％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的收率为62.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.1％。
实施例3
以酵母为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将酵母接种发酵，将发酵液离心得到含水量为80.1％的湿菌体。
2)取上述50kg湿菌体，湿菌体重加入150g维生素C棕榈酸酯(抗氧化剂)，充分混合搅拌均匀，进行喷雾干燥得到20.78kg干菌体，喷雾干燥条件为：热风温度130℃，物料温度65℃，风机频率为45Hz，进料速度为5kg/h。
3)取5kg干菌体，投入到100L的反应釜中，再加入50L正己烷，用砂磨机循环破碎至菌体平均粒径为193um，离心分离得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣继续加入50L正己烷，在55℃萃取1h，离心得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将上述结晶母液离心分离得到湿晶体，湿晶体用250ml乙醇搅拌洗涤，再次离心得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下真空干燥2h得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜晶体收率为69.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.7％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的收率为61.7％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.1％。
实施例4
以三孢布拉霉菌种作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将三孢布拉霉接种发酵，将发酵液经板框压滤后得到含水量为55.1％湿菌体。
2)取500kg湿菌体用粉碎机破碎，加入25kg对羟基苯甲酸乙酯(抗氧化剂)混合均匀，再经沸腾干燥得241.1kg干菌体，沸腾干燥条件为：热风温度120℃，物料温度55℃，风机频率50Hz。
3)取5kg上述干燥的菌体，投入到200L反应釜中，并加入100L二氯甲烷，用高剪切胶体磨循环破碎至菌体平均粒径为300um，升温至55℃搅拌萃取1h，经沉降分离后，上层萃取液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到一萃萃取液，下层湿菌渣继续加入100L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并两次萃取液，在48℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到粗湿晶体，粗湿晶体用500ml石油醚洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜素晶体的提取率为73.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为98.1％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为62.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.9％。
实施例5
以杜氏盐藻为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将杜氏盐藻接种发酵，将发酵液离心得到水量为75.7％湿菌体。
2)取1kg湿菌体，真空干燥得到269.3g干菌体，真空干燥条件为：温度80℃，负压-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌体，向其中加入0.2g维生素E(抗氧化 剂)，加入到3L的四颈烧瓶中，并加入600mL乙酸乙酯，用高速剪切机破碎至菌体平均粒径为151um，抽滤得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣用2L乙酸乙酯进行二次萃取，抽滤得到二萃萃取液。
4)合并两次萃取液，在50℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到湿晶体，湿晶体用20ml乙醇洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经检测，β-胡萝卜素晶体的提取率为64.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.3％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为60.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为95.9％。
实施例6
以酵母为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将酵母接种发酵，将发酵液离心得到含水量为80.5％的湿菌体。
2)取上述10kg湿菌体，充分混合搅拌均匀，经冷冻干燥得到2.07kg干菌体，冷冻干燥条件为：真空20Pa，捕集器温度为-40℃，干燥20h。
3)取1kg干菌体，投入到30L的反应釜中，加入50g二丁基羟基甲苯(抗氧化剂)，再加入30L正己烷，用砂磨机循环破碎至菌体平均粒径为133um，离心分离得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣继续加入30L正己烷，在55℃萃取1h，离心得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将上述结晶母液离心分离得到湿晶体，湿晶体用250ml正己烷搅拌洗涤，再次离心得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下真空干燥2h得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜晶体收率为69.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.7％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的收率为63.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.1％。
实施例7
以酵母为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将酵母接种发酵，将发酵液离心得到含水量为80.1％的湿菌体。
2)取上述50kg湿菌体，充分混合搅拌均匀，进行喷雾干燥得到20.78kg干菌体，喷雾干燥条件为：热风温度130℃，物料温度65℃，风机频率为45Hz，进料速度为5kg/h。
3)取5kg干菌体，投入到100L的反应釜中，加入100g维生素C棕榈酸酯(抗氧化剂)，再加入50L正己烷，用砂磨机循环破碎至菌体平均粒径为153um，离心分离得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣继续加入50L正己烷，在55℃萃取1h，离心得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，在43℃，-0.085MPa的条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将上述结晶母液离心分离得到湿晶体，湿晶体用250ml乙酸乙酯搅拌洗涤，再次离心得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下真空干燥2h得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜晶体收率为69.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.7％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的收率为63.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.1％。
实施例8
以三孢布拉霉菌种作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将三孢布拉霉接种发酵，将发酵液经板框压滤后得到含水量为55.1％湿菌体。
2)取500kg湿菌体用粉碎机破碎，经沸腾干燥得233.1kg干菌体，沸腾干燥条件为：热风温度120℃，物料温度55℃，风机频率50Hz。
3)取50kg上述干燥的菌体，投入到1000L反应釜中，加入1kg迷迭香(抗氧化剂)，并加入500L石油醚，用高剪切胶体磨循环破碎至菌体平均粒径为231um，升温至55℃搅拌萃取1h，经沉降分离后，上层萃取液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到一萃萃取液，下层湿菌渣继续加入500L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并两次萃取液，在48℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到粗湿晶体，粗湿晶体用5L乙醇，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜素晶体的提取率为73.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为98.1％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为62.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.9％。
实施例9
以杜氏盐藻为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将杜氏盐藻接种发酵，将发酵液离心得到水量为75.9％湿菌体。
2)取1kg湿菌体，真空干燥得到267.3g干菌体，真空干燥条件为：温度80℃，负压-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌体，加入到3L的四颈烧瓶中，并加入600mL二氯甲烷，用高速剪切机破碎至菌体平均粒径为181um，抽滤得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣用2L二氯甲烷进行二次萃取，抽滤得到二萃萃取液。
4)合并两次萃取液，向其中加入0.2g维生素E(抗氧化剂)，在50℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到湿晶体，湿晶体用50ml乙醇洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经检测，β-胡萝卜素晶体的提取率为64.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.3％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为60.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为95.9％。
实施例10
以酵母为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将酵母接种发酵，将发酵液离心得到含水量为80.3％的湿菌体。
2)取上述10kg湿菌体，充分混合搅拌均匀，经冷冻干燥得到2.1kg干菌体，冷冻干燥条件为：真空20Pa，捕集器温度为-40℃，干燥20h。
3)取1kg干菌体，投入到30L的反应釜中，再加入30L正己烷，用砂磨机循环破碎至菌体平均粒径为300um，离心分离得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣继续加入30L正己烷，在55℃萃取1h，离心得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，加入50g二丁基羟基甲苯(抗氧化剂)，在43℃，-0.085MPa的条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将上述结晶母液离心分离得到湿晶体，湿晶体用250ml乙酸乙酯搅拌洗涤，再次离心得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下真空干燥2h得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜晶体收率为69.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.7％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的收率为63.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.1％。
实施例11
以酵母为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将酵母接种发酵，将发酵液离心得到含水量为80.9％的湿菌体。
2)取上述50kg湿菌体，充分混合搅拌均匀，进行喷雾干燥得到20.78kg干菌体，喷雾干燥条件为：热风温度130℃，物料温度65℃，风机频率为45Hz，进料速度为5kg/h。
3)取5kg干菌体，投入到100L的反应釜中，再加入50L正己烷，用砂磨机循环破碎至菌体平均粒径为300um，离心分离得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣继续加入50L正己烷，在55℃萃取1h，离心得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，加入100g维生素C棕榈酸酯(抗氧化剂)，在43℃，-0.085MPa的条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将上述结晶母液离心分离得到湿晶体，湿晶体用250ml正己烷搅拌洗涤，再次离心得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下真空干燥2h得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜晶体收率为69.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.7％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的收率为63.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.1％。
实施例12
以三孢布拉霉菌种作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将三孢布拉霉接种发酵，将发酵液经板框压滤后得到含水量为55.1％湿菌体。
2)取500kg湿菌体用粉碎机破碎，经沸腾干燥得233.1kg干菌体，沸腾干燥条件为：热风温度120℃，物料温度55℃，风机频率50Hz。
3)取50kg上述干燥的菌体，投入到2000L反应釜中，并加入1000L石油醚，用高剪切胶体磨循环破碎至菌体平均粒径为231um，然后升温至55℃，萃取1h，经沉降分离后，上层萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到一萃萃取液，向下层湿菌 渣中继续加入600L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并两次萃取液，加入2kg迷迭香(抗氧化剂)，在48℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到粗湿晶体，粗湿晶体用10L乙酸乙酯洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜素晶体的提取率为73.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为98.1％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为61.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.9％。
实施例13
以三孢布拉霉菌种作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将三孢布拉霉接种发酵，将发酵液经板框压滤后得到含水量为55.1％湿菌体。
2)取500kg湿菌体用粉碎机破碎，经沸腾干燥得233.1kg干菌体，沸腾干燥条件为：热风温度120℃，物料温度55℃，风机频率50Hz。
3)取200kg上述干燥的菌体，投入到5000L反应釜中，并加入2000L石油醚，用高剪切胶体磨循环破碎至菌体平均粒径为231um，然后升温至55℃，萃取1h，经沉降分离后，上层萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到一萃萃取液，向下层湿菌渣中继续加入2000L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并两次萃取液，加入5kg对羟基苯甲酸乙酯(抗氧化剂)，在48℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到粗湿晶体，粗湿晶体用500ml二氯甲烷洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜素晶体的提取 率为73.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为98.1％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为62.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.9％。
实施例14
以杜氏盐藻为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将杜氏盐藻接种发酵，将发酵液离心得到水量为75.7％湿菌体。
2)取1kg湿菌体，加入0.5g二丁基羟基甲苯(抗氧化剂)，混合均匀，真空干燥得到261.3g干菌体，真空干燥条件为：温度80℃，负压-0.085MPa。
3)取200g上述干燥的菌体，加入到3L的四颈烧瓶中，再加入0.5g维生素E(抗氧化剂)，加入600mL二氯甲烷，用高速剪切机破碎至菌体平均粒径为181um，抽滤得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣用2L二氯甲烷进行二次萃取，抽滤得到二萃萃取液。
4)合并两次萃取液，在50℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到湿晶体，湿晶体用20ml二氯甲烷洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经检测，β-胡萝卜素晶体的提取率为64.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.3％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为60.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为95.9％。
实施例15
以酵母为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将酵母接种发酵，将发酵液离心得到含水量为80.9％的湿菌体。
2)取上述10kg湿菌体，加入50gVc棕榈酸酯(抗氧化剂)，充分混 合搅拌均匀，进行喷雾干燥得到2.18kg干菌体，喷雾干燥条件为：热风温度130℃，物料温度65℃，风机频率为45Hz，进料速度为5kg/h。
3)取2kg干菌体，投入到50L的反应釜中，再加入20L正己烷，用砂磨机循环破碎至菌体平均粒径为300um，再在550搅拌萃取1h，离心分离得到一萃萃取液和湿菌渣，湿菌渣继续加入20L正己烷，在55℃萃取1h，离心得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并一萃和二萃萃取液，加入50g迷迭香(抗氧化剂)，在43℃，-0.085MPa的条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将上述结晶母液离心分离得到湿晶体，湿晶体用250ml正己烷搅拌洗涤，再次离心得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下真空干燥2h得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜晶体收率为69.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为97.7％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的收率为63.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.1％。
实施例16
以三孢布拉霉菌种作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将三孢布拉霉接种发酵，将发酵液经板框压滤后得到含水量为55.1％湿菌体。
2)取50kg湿菌体用粉碎机破碎，经沸腾干燥得23.1kg干菌体，沸腾干燥条件为：热风温度120℃，物料温度55℃，风机频率50Hz。
3)取10kg上述干燥的菌体，投入到200L反应釜中，再加入250g对羟基苯甲酸乙酯(抗氧化剂)，并加入100L石油醚，用高剪切胶体磨循环破碎至菌体平均粒径为231um，然后升温至55℃，萃取1h，经沉降分离后，上层萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到一萃萃取液，向下层湿菌渣中继续加入100L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并两次萃取液，加入250g维生素E(抗氧化剂)，在48℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到粗湿晶体，粗湿晶体用2L二氯甲烷洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜素晶体的提取率为73.3％，经检测β-胡萝卜素纯度为98.1％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为62.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.9％。
实施例17
以三孢布拉霉菌种作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：
1)将三孢布拉霉接种发酵，将发酵液经板框压滤后得到含水量为55.1％湿菌体。
2)取500kg湿菌体用粉碎机破碎，加入2.5kg二丁基羟基甲苯(抗氧化剂)，混合均匀，经沸腾干燥得233.1kg干菌体，沸腾干燥条件为：热风温度120℃，物料温度55℃，风机频率50Hz。
3)取200kg上述干燥的菌体，投入到5000L反应釜中，加入1kg维生素E(抗氧化剂)，并加入2000L石油醚，用高剪切胶体磨循环破碎至菌体平均粒径为231um，然后升温至55℃，萃取1h，经沉降分离后，上层萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到一萃萃取液，向下层湿菌渣中继续加入2000L石油醚，在55℃萃取1.5h，萃取混合液用5um袋式过滤器和0.5um滤棒过滤器过滤得到二萃萃取液和湿菌渣。
4)合并两次萃取液，加入1kg对羟基苯甲酸乙酯(抗氧化剂)，在48℃，-0.08MPa条件下蒸发结晶，得到结晶母液。
5)将结晶母液抽滤得到粗湿晶体，粗湿晶体用500ml二氯甲烷洗涤，再次抽滤得到湿晶体，湿晶体在80℃，-0.085MPa条件下，真空干燥2h，得到成品类胡萝卜素晶体。经计算类胡萝卜素晶体的提取 率为80.1％，经检测β-胡萝卜素纯度为99.1％。
6)按上述相同的工艺，不添加抗氧化剂进行对照试验，经计算β-胡萝卜素晶体的提取率为61.9％，经检测β-胡萝卜素纯度为96.9％。
本发明制备β-胡萝卜素的方法具有以下有益效果：在干燥、固液分离和蒸发结晶的步骤中，部分或者全部添加抗氧化剂，降低了提取过程中β-胡萝卜素的损失，提升了β-胡萝卜素的收率，同时制得的β-胡萝卜素晶体纯度更高，品质更好。
本发明中所提及的抗氧化剂，不局限于实施例中所列举的类型，其他在使用中具有相同效果的产品均属于本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
工业实用性
本发明提供了一种制备β-胡萝卜素晶体的方法，包括如下步骤：(1)将微生物菌种接种发酵，(2)将发酵液进行固液分离，得到湿菌体；(3)湿菌体干燥后得到干菌体；(4)使用有机溶剂对干菌体进行萃取；(5)固液分离后得到萃取液；(6)萃取液蒸发结晶得到结晶母液；(7)结晶母液经过固液分离，得到粗湿晶体；(8)粗湿晶体经有机溶剂洗涤后，真空干燥得到β-胡萝卜素晶体；步骤(3)、(4)、(6)的一个或多个步骤中，添加有抗氧化剂。本发明降低了提取过程中β-胡萝卜素的损失，提升了β-胡萝卜素的收率，同时制得的β-胡萝卜素晶体纯度更高，品质更好。本发明的方法能被大规模地应用于类胡萝卜素的提取领域，具有广阔的市场前景。

Claims (9)

  1. 制备β-胡萝卜素晶体的方法，包括如下步骤：
    (1)将微生物菌种接种发酵；
    (2)将发酵液进行固液分离，得到湿菌体；
    (3)湿菌体干燥后得到干菌体；
    (4)使用有机溶剂对干菌体进行萃取；
    (5)固液分离后得到萃取液；
    (6)萃取液蒸发结晶得到结晶母液；
    (7)结晶母液经过固液分离，得到粗湿晶体；
    (8)粗湿晶体经有机溶剂洗涤后，真空干燥得到β-胡萝卜素晶体；
    其特征在于：步骤(3)、(4)、(6)的一个或多个步骤中，添加有抗氧化剂。
  2. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征在于：步骤(1)中，微生物菌种为三孢布拉霉、杜氏盐藻或酵母。
  3. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征在于：步骤(3)中，抗氧化剂的添加量为湿菌体重量的0.1％～5％。
  4. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征在于：步骤(4)和(6)中，抗氧化剂的添加量为干菌体重量的0.1％～5％。
  5. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征在于：所述抗氧化剂为二丁基羟基甲苯、对羟基苯甲酸乙酯、维生素C棕榈酸酯、维生素E或迷迭香。
  6. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征在于：步骤(4)中，干菌体与有机溶剂质量体积比为1:3-1:30。
  7. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征在于：步骤(4)中，萃取同时使用机械破碎，机械破碎后菌体的平均粒径不高于300μm。
  8. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征 在于：步骤(4)中，有机溶剂为己烷、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯或丙酮。
  9. 根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素晶体的方法，其特征在于：步骤(5)中，将固液分离后得到的湿菌渣经重复萃取得到萃取液，将所有萃取液合并。
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