TWI695827B - 反式藏紅花酸的製備方法 - Google Patents

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本發明之目的在於提供一種反式藏紅花酸的製備方法及其用途；反式藏紅花酸之製備方法，係包括：步驟一、梔子果實粉末加入第一醇類萃取溶劑，放置一預定時間後收集液體，將該液體濃縮得一較高極性粗萃物；步驟二、加入第二醇類萃取溶劑進行超音波萃取，收集超音波萃取液，濃縮得一較低極性粗萃物；步驟三、合併該較高極性粗萃物與該較低極性粗萃物，加入枯草桿菌於25~60℃發酵24~72小時，收集上清液；步驟四、該上清液以大孔樹脂層析管柱分離得一層析物；步驟五、該層析物經高效能離心分配層析儀以一流動系統得到一反式藏紅花酸精萃液，其中該反式藏紅花酸之純度大於90%。

Description

反式藏紅花酸的製備方法
本發明提供一種製備反式藏紅花酸的方法。
藏紅花酸(crocetin)存在於番紅花(Crocus sativus L.)與梔子(Gardenia jasminoides Ellis)等植物中，以稀有而價格昂貴之番紅花含量較多，其次是梔子。藏紅花酸化學式為C20H24O4，低分子量，且具有部分水溶性與脂溶性的雙重特性。藏紅花酸係類胡蘿蔔素(carotenoid)之衍生物，為以共軛雙烯鍵結的高度不飽和化合物。
自然界中的藏紅花酸為反式藏紅花酸(trans-crocetin)，反式藏紅花酸比順式藏紅花酸(cis-crocetin)更具生理功效，然而在生產製備藏紅花酸的過程中，反式結構會產生順式藏紅花酸。市面上大部分的藏紅花酸，反式結構含量僅在80%以上，且不易取得，每毫克價值40~100歐元(Lautenschläger等人，2014)。
反式藏紅花酸一般以糖苷鍵結方式存在，僅少量以非鍵結方式存在於自然界中，要取得反式藏紅花酸，需先將藏紅花酸糖苷化合物(crocins)水解或去醣。反式藏紅花酸較其糖苷化合物容易通過血腦屏障，能保護腦神經，具有安神、抗憂鬱、預防腦神經系統損害的作用 (Lautenschläger等人，2014)，可改善睡眠品質(Xiao等人，2017)及阿滋海默氏症(Tiribuzi等人，2017)；除此之外，反式藏紅花酸亦被指出有抗發炎、抗糖尿病及利膽作用，能降低膽固醇，也具保護眼睛、預防視網膜病變與老年黃斑病變等功效。
在先前技術中，係先使用30~90%乙醇，以1：5~20(V/W)萃取植物乾燥粉末，將乙醇萃取物濃縮乾燥後，使用大孔樹脂吸附藏紅花酸糖苷化合物，並用30~90%乙醇為沖提溶劑，收集、濃縮獲得藏紅花酸糖苷化合物；分離出的藏紅花酸糖苷化合物再使用酸鹼水解法，水解獲得順、反式藏紅花酸與雜質的混和物，其順、反式藏紅花酸純度約為40~70%，需進行進一步純化。
目前技術使用大孔樹脂管柱層析吸附藏紅花酸糖苷化合物，在經多次管柱層析後，部分藏紅花酸糖苷化合物會被吸附於樹脂上而無法全部洗脫，產生殘留，影響最終產率。另外，傳統酸鹼水解法，需操作酸鹼溶液，且無法一次步驟就得到高純度且高品質的反式藏紅花酸。因此，如何以安全簡便的流程及方式，取得具高純度與高品質的反式藏紅花酸，為本發明在此欲解決的一重要課題。
本發明之目的在於提供一種反式藏紅花酸之製備方法，其係包括以下步驟：步驟一、梔子果實粉末加入第一醇類萃取溶劑，放置一預定時間後收集液體，將該液體濃縮得一較高極性粗萃物，其中該第一醇類萃取溶劑為30%~60%乙醇；步驟二、加入第二醇類萃取溶劑進行超音波萃取，收集超音波萃取液，濃縮得一較低極性粗萃物，該超音波萃取次數 為4~8次，其中該第二醇類萃取溶劑為65~85%乙醇；步驟三、合併該較高極性粗萃物與該較低極性粗萃物，加入枯草桿菌於25~60℃發酵24~72小時，收集上清液；步驟四、該上清液以大孔樹脂層析管柱分離得一層析物；步驟五、該層析物經高效能離心分配層析儀(High Performance Centrifugal Partition Chromatography,HPCPC)以一流動系統得到一反式藏紅花酸精萃液，該流動系統由乙酸乙酯、正丁醇、0.1~0.4M碳酸鈉水溶液所組成，其中該乙酸乙酯、正丁醇、0.1~0.4M碳酸鈉水溶液的比例為1：0.8~1.2：1.5~3，其中該反式藏紅花酸之純度大於90%。
為達前述發明之目的，其中該第一醇類萃取溶劑為50%乙醇。
為達前述發明之目的，其中該第二醇類萃取溶劑為75%乙醇。
為達前述發明之目的，其中該超音波萃取的最佳次數為6次。
為達前述發明之目的，其中該乙酸乙酯、正丁醇、0.1~0.4M碳酸鈉水溶液的最佳比例為1：1：2.5。
本發明之另一目的為一種反式藏紅花酸用於製備治療脂肪肝之組合物之用途，其中該反式藏紅花酸係使用如前述發明所提供的反式藏紅花酸之製備方法所製備的反式藏紅花酸。
為達前述發明之目的，其中該組合物係透過抑制游離脂肪酸蓄積於肝中，達到治療脂肪肝之功效。
為達前述發明之目的，其中該組合物可進一步抑制游離脂 肪酸誘導的肝氧化壓力。
為達前述發明之目的，其中該組合物包含醫藥組合物、食品組合物。
為達前述發明之目的，其中該醫藥組合物可進一步包含藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
第1圖係反式藏紅花酸之製備流程圖。
第2圖係去雜質的藏紅花酸糖苷化合物水解產物之高效離心分配層析圖。
第3圖係(A)順、反式藏紅花酸之紫外光-可見光吸收光譜圖；(B)負電荷電灑離子化質譜圖(electrospray ionization-negative mode mass spectrometry)。
第4圖係反式藏紅花酸之高效液相層析串聯質譜圖(liquid chromatography/tandem mass spectrometry,LC/MS/MS)。
第5圖係反式藏紅花酸對肝細胞株(HepG2)之細胞毒性。
第6圖係反式藏紅花酸抑制游離脂肪酸蓄積於肝細胞株(HepG2)之效果。
第7圖係反式藏紅花酸抑制游離脂肪酸誘導的肝細胞株(HepG2)氧化壓力之效果。
本說明書中所述之所有技術性及科學用語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常知識者可共同瞭解的意義。
本說明書用語「收率」為反應收率之簡稱，係指在反應過程中，投入單位數量原料獲得的實際生產的產品產量百分率。
本說明書用語「醇類」係包含，但不限於甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。
本說明書用語「液態培養基」係包含，但不限於LB培養基(Luria-Bertani medium)；LB培養基的配製方式係包含，但不限於將10g胰化蛋白(tryptone)、10g氯化鈉(NaCl)、5g酵母萃取物(yeast extract)和950mL的二次水混合均勻直至溶質溶解，用至多0.2mL的5N氫氧化鈉(NaOH)將pH值調節至7.0，再用二次水將溶液的最終體積調節至1L，接著在液體循環中通過在15psi(1.05kg/cm2)下高壓滅菌20分鐘。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例1 反式藏紅花酸之製備
(1)萃取藏紅花酸糖苷化合物粗萃物：梔子果實經乾燥粉碎後，用第一醇類萃取溶劑將較高極性物質溶出，獲得較高極性物質液體與梔子果實殘渣，將該較高極性物質液體濃縮乾燥後得一較高極性粗萃物；取50克上述梔子果實殘渣，加入第二醇類萃取溶劑，殘渣與第二醇類萃取溶劑以1：3~1：7(以1：5為最佳)的比例混和均勻後，使用超音波法，萃取4~8次(以6次為最佳)；接著用真空過濾方式將超音波萃取液與原料分開，將超音波萃取液濃縮至乾，得一較低極性粗萃物，合併上述之較高極性粗萃物 與較低極性粗萃物，即為藏紅花酸糖苷化合物粗萃物，秤重，換算其收率。
如前述(1)所述，其中該第一醇類萃取溶劑可為30%~60%乙醇，以50%乙醇為最佳；其中該第二醇類萃取溶劑可為65%~85%乙醇，以75%乙醇為最佳。
(2)微生物發酵法水解藏紅花酸糖苷化合物：將前述之藏紅花酸糖苷化合物粗萃物，以0.1%、0.25%、0.5%、1.0%(w/w)的濃度比例與枯草桿菌(Bacillus subtilis BCRC 14715)及液態培養基混和成發酵液，各種濃度的發酵液於37℃中培養48小時，取得最適水解濃度條件；採用前述最適水解濃度條件，分別在25℃、37℃、50℃中培養48小時，取得最適水解溫度條件；採用前述最適水解溫度條件，分別培養24小時、48小時、72小時，取得最適水解時間條件。總合上述條件，採用各項最適水解條件完成水解，將水解產物離心去除沉澱物，取上清液濃縮至乾，算其收率，進行乙酸乙酯分配層析。
(3)去除水解產物中之雜質：將濃縮後的水解產物，以水稀釋成一定濃度後，加入大孔樹脂層析管柱；先以各10倍柱床體積(bed volume,BV)的水和40%~60%醇類(以50%乙醇為最佳)洗脫，去除極性較高的雜質；再以10倍柱床體積的80%~100%醇類(以95%乙醇為最佳)洗脫出藏紅花酸，收集藏紅花酸洗脫液濃縮至乾獲得一層析物，算其收率，該層析物即為順、反式藏紅花酸混和物。
(4)高效離心分配層析儀純化反式藏紅花酸：採用的高效離心分配層析儀之管柱總體積為250mL；配置偵測器的紫外光/可見光(UV/Vis)範圍為200~600nm；溶劑流動系統使用乙酸乙酯、正丁醇和 0.1~0.4M碳酸鈉水溶液(體積百分濃度比例為1：0.8~1.2：1.5~3，以1：1：2.5為最佳；碳酸鈉水溶液濃度以0.3M為最佳)混和溶劑，靜相為上層。於轉速1600rpm下，使用流動相沖提流速6~10mL/min(以8mL/min為最佳)，沖提60分鐘，以如第2圖所示之440nm範圍的吸收波長偵測，共收集30管，選取吸收數值高之沖提液，合併、濃縮後獲得一反式藏紅花酸精萃液，使用(liquid chromatography/tandem mass spectrometry,LC/MS/MS)進行分析。
純化結果揭示於第3、4圖中：經LC/MS/MS分析，以前述(1)~(4)之方法所得之反式藏紅花酸，其純度為90.11%，優於先前報導以鹼水解再純化所得的85%(Inoue等人，2014)。
實施例2 反式藏紅花酸對肝細胞株之細胞毒性
以濃度5μM~150μM之實施例1中所取得的反式藏紅花酸處理肝細胞株(HepG2)，24小時、48小時、72小時；接著使用MTT染色分析，確認反式藏紅花酸對肝細胞株的毒性。
細胞毒性測試結果，揭示於第5圖中：在經24小時、48小時、72小時，以不同濃度的反式藏紅花酸處理後，細胞仍保有80%以上的存活率。
實施例3 反式藏紅花酸抑制游離脂肪酸蓄積於肝細胞株之效果
以0.4mM油酸及棕櫚酸(oleic acid and palmitic acid,O-PA)處理肝細胞株(HepG2)，24小時；在經油酸及棕櫚酸處理的細胞中，分別添加5μM、10μM、25μM之實施例1中所取得的反式藏紅花酸或25μM的水飛薊素(silibinin)，孵育(incubate)6小時、12小時、24小時；使用油紅O(Oil Red O)對孵育完的細胞進行染色，以400倍顯微鏡進行觀察。
抑制游離脂肪酸蓄積結果，揭示於第6圖中：結果顯示反式藏紅花酸可抑制游離脂肪酸蓄積於肝細胞中、減少脂肪油滴形成，且其效果較已知具治療脂肪肝功效的水飛薊素好。
實施例4 反式藏紅花酸抑制游離脂肪酸誘導的肝細胞株氧化壓力之效果
以0.4mM油酸及棕櫚酸(oleic acid and palmitic acid,O-PA)處理肝細胞株(HepG2)，24小時；在經油酸及棕櫚酸處理的細胞中分別添加5μM、10μM、25μM、50μM之實施例1中所取得的反式藏紅花酸或25μM的水飛薊素(silibinin)，孵育(incubate)6小時、12小時、24小時；使用DCFH-DA對孵育完的細胞進行活性含氧物(reactive oxygen species,ROS)螢光染色，以流式細胞儀及400倍螢光顯微鏡確認染色結果。
抑制游離脂肪酸誘導的氧化壓力結果，揭示於第7圖中：結果顯示反式藏紅花酸可抑制游離脂肪酸誘導形成的肝細胞氧化壓力。
本發明不直接以大孔樹脂管柱層析吸附藏紅花酸糖苷化合物，避免了先前技術中部分藏紅花酸糖苷化合物無法被脫洗，影響產率的問題；本發明採用微生物發酵法水解藏紅花酸糖苷化合物，避免了傳統酸鹼水解法中，須使用易對人體產生危害的酸鹼溶液，安全性較高；另外，本發明採用高效離心分配層析儀搭配特殊的溶劑流動系統，純化反式藏紅花酸，該特殊的溶劑流動系統可提高極性溶劑或非極性溶劑比例，實現流動相從強極性到弱極性或相反的轉變，具有無需更換不同極性材質層析管柱的優勢，且因無固體填充物，使得管柱內空間皆為有效純化空間，具有樣品負載能力強、製備分離量大的優勢。除上述之優勢外，本發明亦改善 了純化出的反式藏紅花酸的純度，且使用本發明所提供的方法，純化出的反式藏紅花酸，具有良好的抑制游離脂肪蓄積於肝中及抑制游離脂肪酸誘導的肝氧化壓力效果。
上列詳細說明係針對本發明之可實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
上述多項優勢或功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以鼓勵發明。

Claims (5)

  1. 一種反式藏紅花酸之製備方法，其係包括以下步驟：步驟一、梔子(Gardenia jasminoides Ellis)果實粉末加入第一醇類萃取溶劑，放置一預定時間後收集液體，將該液體濃縮，得一較高極性粗萃物，其中該第一醇類萃取溶劑為30%~60%乙醇；步驟二、梔子果實殘渣加入第二醇類萃取溶劑進行超音波萃取，收集超音波萃取液濃縮，得一較低極性粗萃物，該超音波萃取次數為4~8次，其中該第二醇類萃取溶劑為65~85%乙醇；步驟三、合併該較高極性粗萃物與該較低極性粗萃物，加入枯草桿菌(Bacillus subtilis)於25~60℃發酵24~72小時，收集上清液；步驟四、該上清液以大孔樹脂層析管柱分離得一層析物；步驟五、該層析物經高效能離心分配層析儀以一流動系統得到一反式藏紅花酸精萃液，該流動系統由乙酸乙酯、正丁醇、0.1~0.4M碳酸鈉水溶液所組成，其中該乙酸乙酯、正丁醇、0.1~0.4M碳酸鈉水溶液的比例為1：0.8~1.2：1.5~3，其中該反式藏紅花酸之純度大於90%。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一醇類萃取溶劑為50%乙醇。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第二醇類萃取溶劑為75%乙醇。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該超音波萃取次數為6次。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該乙酸乙酯、正丁醇、0.1~0.4M碳酸鈉水溶液的比例為1：1：2.5。
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