CN114133348A - 一种高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度全反式β‑胡萝卜素的提取方法，属于核黄素提取技术领域。该方法包括：发酵液依次经发酵液固液分离，洗涤，皂化，皂化液固液分离，脱水和提取等处理后得到含量大于96%，全反式β‑胡萝卜素纯度大于95%的β‑胡萝卜素晶体。(1)相对于常规的提取工艺，过滤压力低，减少了β‑胡萝卜素在破壁提取过程中的损失和降解，β‑胡萝卜素的得率可提升10%左右，具有明显经济效益。(2)全反式β‑胡萝卜素的纯度高，可达95%以上，相对于常规工艺可提升5%以上，提高了β‑胡萝卜素品质。(3)工艺过程较常规的提取工艺简单。

Description

一种高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法
技术领域
本发明涉及核黄素提取技术领域，具体涉及一种高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法。
背景技术
β-胡萝卜素的分子式为C40H56,分子量为536.88，它的熔点为180℃左右，β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中最有效的维生素A全体，常见的约有20余种异构体，其中全反式β-胡萝卜素被证明能帮助人类防治某些癌症和心血管疾病，凭借其优越的生理功能和特殊的着色性质，β-胡萝卜素已成为一种十分重要的食品添加剂，目前被广泛用于食品和饮料中。但是在提取和制备β-胡萝卜素过程当中由于β-胡萝卜素的不稳定性、易氧化等，当有外界能量时，β-胡萝卜素不同异构体之间会发生异构化反应。在制备、提取β-胡萝卜素过程当中，β-胡萝卜素会不可避免的受到光照、加热和空气氧化等作用的影响，并因此产生很多顺式异构体。β-胡萝卜素顺式异构体含量的增加会降低β-胡萝卜素的VA原的活性。同时影响β-胡萝卜素对食品的着色性能。现有技术中通常采用破壁法提取β-胡萝卜素，但是其存在处理压力大（压力可达50-70Mpa）、破壁损失（与降解）量大和全反式β-胡萝卜素含量低等问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，具有更高的得率，更高的β-胡萝卜素含量和更高的全反式β-胡萝卜素的纯度。所述方案如下：
本发明实施提供了一种高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)发酵液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，将发酵液于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量4-5%和固含量50-55%的湿菌体。
(2)洗涤：将步骤(1)得到的湿菌体用50-60℃的热水洗涤至少一次。
(3)皂化：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，对步骤(2)得到的湿菌体采用碱液进行皂化处理。
(4)皂化液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，对步骤(3)得到的皂化液于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量5-7%和固含量60-65%的湿菌体。
(5)脱水、过滤：于50-60℃条件下，将步骤(4)得到的湿菌体采用脱水剂进行脱水和压滤得到β-胡萝卜素含量8-10%和固含量75-80%的湿菌体。将皂化后的菌体进行脱水处理，可促进下一步溶剂进入菌体提高β-胡萝卜素溶出的速率，在脱水过程中，菌体中多数的水溶性杂质和脂溶性杂质溶于脱水剂，达到纯化的目的。
(6)提取：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下（优选为55℃，提取时间优选为30min），采用溶剂提取步骤(5)得到的湿菌体，降温结晶得到高纯度全反式β-胡萝卜素；其中，溶剂选自乙酸乙酯或乙酸异丁酯等。
其中，本发明采用在50-60℃条件下进行处理，温度较高容易产生其他构型的β-胡萝卜素，温度较低则提取效果不好（如对脂的分离效果不好）。
其中，在步骤(1)中，发酵液指产β-胡萝卜素的微生物在特定培养基（包括无机盐、糖、氮等营养物质）中代谢生产β-胡萝卜素，本实施例具体为由三孢布拉霉的正负菌发酵得到，其β-胡萝卜素的含量为1000-3000ppm并且β-胡萝卜素被包裹，其还含有菌体及其它有机物质和一些无机物质。步骤(1)能过滤除去部分杂质。
其中，在步骤(2)中，水洗次数2-3次，采用错流洗涤。该步骤进一步除去一些水溶性杂质和带出部分油脂性物质。
其中，在步骤(3)中，碱液与步骤(2)得到的湿菌体的体积质量比为3.5-5.5L/kg，皂化时间为2-3小时，碱液选自0.05-0.1mol/L的氢氧化钠溶液或0.05-0.1mol/L的氢氧化钾溶液等，碱液优选0.1mol/L的氢氧化钾溶液。通过步骤(4)除去了大部分皂化后的杂质。在显微镜下观察，经步骤(3)和(4)处理后的菌体变得蓬松，分散。皂化有效去除包裹β-胡萝卜素的油脂类物质，有利于后续提取。
其中，在步骤(5)中，脱水剂与步骤(4)得到的湿菌体的体积质量比为2-3L/kg，脱水时间40-60min，脱水剂选自甲醇、乙醇或乙醇体积百分比含量大于60%的乙醇水溶液等，优选乙醇。
优选地，在步骤(6)中，降温速度为2-4℃/分钟，本提取液过程中适当的控制降温温度有利于后续晶体的成长（如能控制结晶晶体的大小和含水量等）和过滤。
优选地，在步骤(6)中，溶剂为乙酸乙酯，用量与常规结晶一致。
其中，在步骤(1)、(4)和(5)中，过滤时压力为0.4-0.5Mpa，压榨时压力为0.5-0.6Mpa。具体过程为：待压滤液泵入压滤机，随着进料压力的增大，进料量越来越少，当压力（进料）达到压滤设定值（压力为0.4-0.5Mpa）时，停止进料进行压滤，压滤完成后（无或只有少量滤液排出），关闭进料阀进行压榨（压力为0.5-0.6 Mpa）。
其中，在步骤(1)、(3)、(4)和(6)中，抗氧剂选自Vc和BHT（二丁基羟基甲苯）中的一种或两种（优选为Vc和BHT的组合），其用量为底物（步骤(1)中为发酵液，步骤(3)中为步骤(2)得到的湿菌体，步骤(4)中为步骤(3)得到的皂化液，步骤(6)为步骤(5)得到的湿菌体）质量的万分之2-4（优选为万分之3）。
具体地，本发明提供的提取方法包括以下步骤：
(1)发酵液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，将发酵液于0.4-0.6 Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量4-5%和固含量50-55%的湿菌体。其中，发酵液由三孢布拉霉的正负菌发酵得到，其β-胡萝卜素的含量为1000-3000ppm。
(2)洗涤：将步骤(1)得到的湿菌体用50-60℃的热水洗涤2-3次。
(3)皂化：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，使用碱液对步骤(2)得到的湿菌体进行皂化处理，碱液与步骤(2)得到的湿菌体的体积质量比为3.5-5.5L/kg，皂化时间为2-3小时，碱液选自0.05-0.1mol/L的氢氧化钠溶液或0.05-0.1mol/L的氢氧化钾溶液等。
(4)皂化液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，对步骤(3)得到的皂化液于0.4-0.6 Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量5-7%和固含量60-65%的湿菌体。
(5)脱水、过滤：于50-60℃条件下，采用脱水剂对步骤(4)得到的湿菌体进行脱水，再于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量8-10%和固含量75-80%的湿菌体，脱水剂与步骤(4)得到的湿菌体的体积质量比为2-3L/kg，脱水时间40-60min，脱水剂选自甲醇、乙醇或乙醇体积百分比含量大于60%的乙醇水溶液等。
(6)提取：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，采用乙酸乙酯提取步骤(5)得到的湿菌体，降温结晶得到高纯度全反式β-胡萝卜素。
在步骤(1)、(3)、(4)和(6)中，抗氧剂为Vc和BHT的组合（比例根据实际需求进行调整）。
本发明提供的方法具有如下优点：
(1)相对于常规的提取工艺，过滤压力低，便于压滤与清洗，减少了β-胡萝卜素在破壁提取过程中的损失和降解，β-胡萝卜素的得率可提升10%左右，具有明显经济效益。
(2)全反式β-胡萝卜素的纯度高，可达95%以上，相对于常规工艺可提升5%以上，提高了β-胡萝卜素品质。
(3)工艺过程较常规的提取工艺简单。
附图说明
图1是实施例1得到的产品的色谱图；
图2是实施例2得到的产品的色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1：
在有N2、抗氧剂保护的条件下，将2tβ-胡萝卜素发酵液采用低压过滤（0.4-0.5Mpa）与高压压榨（0.5-0.6 Mpa）得到一种β-胡萝卜素含量4.1%和固含量50%的β-胡萝卜素湿菌体。将该湿菌体用50-60℃的热水洗涤2次。在有N2、抗氧剂保护的条件下，50-60℃情况下，对该湿菌体进行皂化处理，皂化所用碱液为氢氧化钠溶液，浓度为0.08mol/L，皂化时间为2小时。在有N2、抗氧剂保护的条件下，将皂化液采用低压过滤（0.4-0.5Mpa）与高压压榨（0.5-0.6 Mpa）得到一种β-胡萝卜素含量5.9%和固含量61.2%的β-胡萝卜素湿菌体。将皂化过滤后的β-胡萝卜素湿菌体用乙醇脱水、过滤处理得到一种β-胡萝卜素含量8.4%和固含量为77.4%的β-胡萝卜素湿菌体。在有N2、抗氧剂保护的条件下，用乙酸异丁酯提取该湿菌体，后冷却结晶。得到含量大于96%，全反式β-胡萝卜素纯度大于95%的β-胡萝卜素晶体。
对得到的β-胡萝卜素晶体进行检测，检测设备：shimadzu，A通道，453nm；进液量：20μL；检测时间：2019/12/25；其结果如表1和图1所示：
表1
峰# 保留时间 面积 高度 面积% 纯度%
1 7.333 44506 2032 0.366 0.323
2 7.966 106430 5884 0.876 0.936
3 9.908 11652428 604515 95.880 96.161
4 10.936 349743 16217 2.878 2.580
总计 12153108 628648 100.000 100.000
实施例2：
在有N2、抗氧剂保护的条件下，将7tβ-胡萝卜素发酵液采用低压过滤（0.4-0.5Mpa）与高压压榨（0.5-0.6 Mpa）得到一种β-胡萝卜素含量4.7%和固含量53%的β-胡萝卜素湿菌体。将该湿菌体用50-60℃的热水洗涤3次。在有N2、抗氧剂保护的条件下，50-60℃情况下，对该湿菌体进行皂化处理，皂化所用碱液为氢氧化钾溶液，浓度为0.1mol/L,皂化时间为3小时。在有N2、抗氧剂保护的条件下，将β-胡萝卜素皂化液采用低压过滤（0.4-0.5Mpa）与高压压榨（0.5-0.6 Mpa）得到一种β-胡萝卜素含量6.3%和固含量62.9%的β-胡萝卜素湿菌体。将皂化过滤后的β-胡萝卜素湿菌体用乙醇水溶液（体积浓度为75%）脱水、过滤处理得到一种β-胡萝卜素含量9.2%和固含量为76.5%的β-胡萝卜素湿菌体。在有N2、抗氧剂保护的条件下，用乙酸乙酯提取该湿菌体，后冷却结晶。得到含量大于96%，全反式β-胡萝卜素纯度大于95%的β-胡萝卜素晶体。
对得到的β-胡萝卜素晶体进行检测，检测设备：shimadzu，A通道，453nm；进液量：20μL；检测时间：2020/1/10；其结果如表2和图2所示：
表2
峰# 保留时间 面积 高度 面积% 纯度%
1 6.720 30594 1862 0.294 0.316
2 7.281 97500 5574 0.938 0.948
3 8.964 9983268 566796 96.006 96.200
4 9.833 287199 14954 2.762 2.538
总计 10398561 589185 100.000 100.000
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)发酵液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，将发酵液于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量4-5%和固含量50-55%的湿菌体；
(2)洗涤：将步骤(1)得到的湿菌体用50-60℃的热水洗涤至少一次；
(3)皂化：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，对步骤(2)得到的湿菌体进行皂化处理；
(4)皂化液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，对步骤(3)得到的皂化液于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量5-7%和固含量60-65%的湿菌体；
(5)脱水、过滤：于50-60℃条件下，将步骤(4)得到的湿菌体进行脱水和压滤得到β-胡萝卜素含量8-10%和固含量75-80%的湿菌体；
(6)提取：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，采用溶剂提取步骤(5)得到的湿菌体，降温结晶得到高纯度全反式β-胡萝卜素，所述溶剂选自乙酸乙酯或乙酸异丁酯。
2.根据权利要求1所述的高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述发酵液由三孢布拉霉的正负菌发酵得到，其β-胡萝卜素的含量为1000-3000ppm。
3.根据权利要求1所述的高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，其特征在于，在步骤(2)中，水洗次数2-3次，采用错流洗涤。
4.根据权利要求1所述的高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，其特征在于，在步骤(3)中，碱液与步骤(2)得到的湿菌体的体积质量比为3.5-5.5L/kg，皂化时间为2-3小时，碱液选自0.05-0.1mol/L的氢氧化钠溶液或0.05-0.1mol/L的氢氧化钾溶液。
5.根据权利要求1所述的高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，其特征在于，在步骤(5)中，脱水剂与步骤(4)得到的湿菌体的体积质量比为2-3L/kg，脱水时间40-60min，脱水剂选自甲醇、乙醇或乙醇体积百分比含量大于60%的乙醇水溶液。
6.根据权利要求1所述的高纯度全反式β-胡萝卜素的提取方法，其特征在于，在步骤(6)中，降温速度为2-4℃/分钟。
7.根据权利要求1所述的核黄素酸溶精制母液的处理方法，其特征在于，在步骤(1)、(4)和(5)中，过滤时压力为0.4-0.5Mpa，压榨时压力为0.5-0.6 Mpa。
8.根据权利要求1所述的核黄素酸溶精制母液的处理方法，其特征在于，在步骤(1)、(3)、(4)和(6)中，所述抗氧剂选自Vc和BHT中的一种或两种。
9.根据权利要求1所述的核黄素酸溶精制母液的处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)发酵液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，将发酵液于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量4-5%和固含量50-55%的湿菌体；所述发酵液由三孢布拉霉的正负菌发酵得到，其β-胡萝卜素的含量为1000-3000ppm；
(2)洗涤：将步骤(1)得到的湿菌体用50-60℃的热水洗涤2-3次；
(3)皂化：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，使用碱液对步骤(2)得到的湿菌体进行皂化处理，碱液与步骤(2)得到的湿菌体的体积质量比为3.5-5.5L/kg，皂化时间为2-3小时，碱液选自0.05-0.1mol/L的氢氧化钠溶液或0.05-0.1mol/L的氢氧化钾溶液；
(4)皂化液固液分离：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，对步骤(3)得到的皂化液于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量5-7%和固含量60-65%的湿菌体；
(5)脱水、过滤：于50-60℃条件下，采用脱水剂对步骤(4)得到的湿菌体进行脱水，再于0.4-0.6Mpa压力下压滤得到β-胡萝卜素含量8-10%和固含量75-80%的湿菌体，脱水剂与步骤(4)得到的湿菌体的体积质量比为2-3L/kg，脱水时间40-60min，脱水剂选自甲醇、乙醇或乙醇体积百分比含量大于60%的乙醇水溶液；
(6)提取：在N2、抗氧剂保护下，于50-60℃条件下，采用乙酸乙酯提取步骤(5)得到的湿菌体，降温结晶得到高纯度全反式β-胡萝卜素；
在步骤(1)、(3)、(4)和(6)中，所述抗氧剂为Vc和BHT的组合。
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