CN108998493B - 一种高产虾青素发酵培养基的配方技术及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产虾青素发酵培养基的配方技术及应用，高产虾青素发酵培养基的配方为：葡萄糖、酵母膏、中药膏剂、五水合柠檬酸钠、磷酸氢二钾、无水硝酸按、七水合硫酸镁、二水合氯化钙、微量元素溶液、生物素溶液、氯仿、蒸馏水，将其应用于红法夫酵母发酵操作以制备虾青素。有益效果为：在红法夫酵母繁殖对数期添加6‑苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、β‑萘氧乙酸，能有效提高红法夫酵母的细胞活性，改善糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速酵母细胞生长与繁殖，有助于提高代谢产物即菌体生物量，加快高密度发酵，提高产率，是一种高效、安全、简易的高产虾青素发酵培养基。

Description

一种高产虾青素发酵培养基的配方技术及应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵培养领域，尤其是涉及一种高产虾青素发酵培养基的配方技术及应用。

技术背景

虾青素，是从河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中发现的一种红色类胡萝卜素，在体内可与蛋白质结合而呈青、蓝色，有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病等作用，因此，在饲料、食品、化妆品及医药等领域有着广泛的应用。目前，虾青素的生产有人工合成和生物获取两种方式。人工合成虾青素不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著。目前，最有前景的一种生产方式是微生物发酵，其中研究最为广泛的是法夫酵母(Phaffia rhodozyma)和雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。雨生红球藻的虾青素含量可达细胞干重的3%，较法夫酵母产量高，但是，由于其培养条件苛刻且提取困难，限制了其生产应用。法夫酵母有生产过程易控制、发酵周期短等优点而成为研究的热点，因此，它是一种极具产业化应用前景的天然虾青素资源。为了利用法夫酵母生产天然虾青素，选用促进产物合成发酵原料是控制生产成本和提高产物产量的主要途径之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产虾青素发酵培养基的配方技术及应用，本发明方法中的高产虾青素发酵培养基，其组分简易、廉价环保，将培养基应用于发酵制备虾青素有助于改善红法夫酵母糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速酵母细胞生长与繁殖，有助于提高菌体生物量与虾青素产量，加快高密度发酵，提高产率。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种高产虾青素发酵培养基的配方技术，所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖28-30g、酵母膏5-6g、中药膏剂8-10g、五水合柠檬酸钠12-15g、磷酸氢二钾20-25g、无水硝酸按8-10g、七水合硫酸镁0.5-1g、二水合氯化钙0.2-0.5g、微量元素溶液0.4-0.5mL、生物素溶液0.2-0.25mL、氯仿0.015-0.02mL，以蒸馏水补齐1000mL；碳源是培养基的主要成分之一，是细胞各种代谢产物的主要元素，同时又是异养微生物生长的能量来源，高C/N比有利于法夫酵母细胞内虾青素的积累，较高葡萄糖质量浓度（30g/L）对法夫酵母虾青素产量更为有利，当葡萄糖含量更高时不仅会造成资源浪费，而且还会出现较为严重的Crabtree effect，减弱法夫酵母对葡萄糖的利用率，同时酵母细胞还会产生乙醇、乙酸等代谢副产物降低了酶的合成，进而抑制细胞生长，抑制生物量、虾青素的富集，对发酵不利。

进一步地，所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖29g、酵母膏5g、中药膏剂8-9g、五水合柠檬酸钠13-14g、磷酸氢二钾22-24g、无水硝酸按9-10g、七水合硫酸镁0.7-0.8g、二水合氯化钙0.3-0.5g、微量元素溶液0.4-0.5mL、生物素溶液0.22-0.25mL、氯仿0.016-0.018mL，以蒸馏水补齐1000mL。

作为对本发明的进一步优化，所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖29g、酵母膏5g、中药膏剂9g、五水合柠檬酸钠14g、磷酸氢二钾23g、无水硝酸按9g、七水合硫酸镁0.8g、二水合氯化钙0.4g、微量元素溶液0.45mL、生物素溶液0.24mL、氯仿0.016mL，以蒸馏水补齐1000mL。

作为优选，中药膏剂的制备步骤为：将防风、黄芪、大黄、杏鲍菇、连翘按照干物质质量比0.2-0.5:0.5-0.8:1-1.5:1:0.5-0.8的比例混合，粉碎并过筛，加水煎煮至膏剂密度为1.2-1.5g/mL，加入2-4倍的水，调节pH至2.8-3.4，在35-40℃温度下，加入底物5-8%的混合酶，酶解2-4小时后沸水浴10-20分钟灭酶，10000-12000r/min离心后取悬浮液与清液，低温制膏至密度为1.1-1.2g/mL即得中药膏剂；通过煎煮、酶解制得中药膏剂，其制备方法简单，没有加入任何有机试剂，对环境友好，同时可以最大程度的保留中草药中的活性成分，中药膏剂中富含糖类、小蛋白、活性多肽、苷类与萜类等活性物质，可以为红法夫酵母吸收利用，促进其高产虾青素。

作为优选，中药膏剂的制备步骤中的混合酶为质量比为1:0.5-1:0.2-0.4:0.5-0.6的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶的混合酶；混合酶具有较高的酶解活性，能够较大程度上将中草药中的活性成分解离出来，将蛋白质进行降解得活性肽等小分子物质，从而便于红法夫酵母对其进行充分的利用。

作为优选，微量元素溶液为将9-10mg无水硼酸、15-25mg硫酸锰、55-58mg五水合硫酸铜、1.95-2.00mg碘化钾、5-6mg氯酸铵、140-150mg六水合氯化铁、5-8mg钼酸铵、400-500mg七水合硫酸锌，溶解于5mL蒸馏水中配制而成的溶液；微量元素溶液富含硼、锰、铜、碘、钾、铁、钼、锌等微量元素，铁是多种酶如过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素和细胞色素氧化酶等的组成元素，一旦铁元素不足，就可导致糖酵解过程的变化，进而影响酶的生成；铜是多种酶如细胞色素氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖酶、二胺氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硫化物氧化酶、酪氨酸氧化酶等的组成元素和刺激因子，参与体内的多种代谢活动，一旦铜元素不足或过量，微生物的代谢过程就会遭到破坏，造成生物生产性能的降低；镁是细胞中某些酶的活性基团，并具有调节和控制细胞质的胶体状态、细胞质膜的通透性和细胞代谢活动的功能；锰是多种酶的激活剂，有时可以代替镁，锌是乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性基；微量元素溶液可加快酵母生长繁殖，促进其产虾青素，提高发酵效率。

作为优选，生物素溶液为将1.0-1.2mg的生物素溶解在55-60mg的乙醇中，加蒸馏水至体积100mL；生物素是合成维生素C的必要物质，可促进酵母体内脂肪和蛋白质的正常代谢，维持红法夫酵母的正常生理活动以及虾青素的正常分泌。

一种高产虾青素发酵培养基的应用，将发酵培养基置于发酵罐中，接种入3-6%种子液，控制温度为23-25℃、通气量为3-5L/min，通过调节搅拌转速控制溶氧值在40-60%之间，恒温发酵5-7天即可；发酵过程中，Idi基因编码烯焦磷酸异构酶，能催化烯焦磷酸异构化为二甲基烯丙基焦磷酸酯（DMAPP），DMAPP经过四异戊二烯焦磷酸合成酶（由crtE基因编码）、八氢番茄红素合成酶（由crtYB基因编码）、八氢番茄红素脱氢酶（由crtI基因编码）、番茄红素环化酶（由crtYB基因编码）的催化作用生成γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素，β-胡萝卜素经过由crtS基因编码的虾青素合成酶两步催化即可得到虾青素，虾青素结构中的共轭双键，可以使某些活性氧有效的灭活，从而防止蛋白质等大分子的损伤及脂质的过氧化，通过抗氧化作用发挥保护机体的功效，虾青素能有效抑制与前列腺生长有关的5α-还原酶的活性，从而可以有效的抑制癌细胞的增殖，虾青素在体内可使血液中高密度脂蛋白显著升高而低密度脂蛋白降低，可用来预防冠心病、动脉硬化和缺血性脑损伤等心血管疾病；应用本发酵培养基发酵，红法夫酵母发酵后的生物量与虾青素产量均能得到大大提高，其生物量含量可达15.8-22.2g/L，细胞虾青素含量可达100.0-120.0mg/L，是一种高效、安全、简易的高产虾青素发酵培养基。

作为优选，发酵12-18小时时依次往培养基中添加0.2-0.25mg/L t-亮氨酸叔丁酯、0.025-0.030mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.02-0.022mg/L吲哚乙酸、0.01-0.015mg/Lβ-萘氧乙酸；在红法夫酵母的发酵过程中添加植物生长调节剂如6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、β-萘氧乙酸，植物生长调节剂的添加能有效提高红法夫酵母的细胞活性，改善糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速细胞生长与繁殖，有助于提高代谢产物即菌体生物量，加快发酵，提高产率；吲哚乙酸在光下会被氧化为玫瑰红色，其生物活性会显著下降，t-亮氨酸叔丁酯在氯仿存在的条件下可以与吲哚乙酸发生络合反应，生成较稳定的水溶性络合物，从而防止吲哚乙酸遭受光降解而丧失生物学活性，该水溶性络合物可以被酵母细胞吸收从而变为吲哚乙酸的一种胞内储存形式，在适当条件下经解离即可以产生游离态吲哚乙酸供机体吸收利用并发挥生物学作用；t-亮氨酸叔丁酯也会在酶的作用下发生水解，生成亮氨酸供红法夫酵母吸收，不会对胞内环境产生影响，可以促进酵母生长繁殖，提高菌体生物量产量与产率，提高发酵效率，降低成本。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）在红法夫酵母繁殖对数期添加6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、β-萘氧乙酸，能有效提高红法夫酵母的细胞活性，改善糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速酵母细胞生长与繁殖，有助于提高代谢产物即菌体生物量，加快高密度发酵，提高产率；

2）t-亮氨酸叔丁酯在氯仿存在的条件下可以与发酵液中的吲哚乙酸发生络合反应生成较络合物，从而防止吲哚乙酸遭受光降解而丧失生物学活性，络合物被酵母细胞吸收变为吲哚乙酸的一种胞内储存形式，经解离即可以产生游离态吲哚乙酸供机体吸收利用并发挥生物学作用；

3）应用本发酵培养基发酵，红法夫酵母发酵后的生物量与虾青素产量均能得到大大提高，其生物量含量可达15.8-22.2g/L，细胞虾青素含量可达100.0-120.0mg/L，是一种高效、安全、简易的高产虾青素发酵培养基。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种高产虾青素发酵培养基的配方技术，所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖28g、酵母膏5g、中药膏剂8-10g、五水合柠檬酸钠12-15g、磷酸氢二钾20-25g、无水硝酸按8-10g、七水合硫酸镁0.5-1g、二水合氯化钙0.2g、微量元素溶液0.4mL、生物素溶液0.2mL、氯仿0.01mL，以蒸馏水补齐1000mL；碳源是培养基的主要成分之一，是细胞各种代谢产物的主要元素，同时又是异养微生物生长的能量来源，高C/N比有利于法夫酵母细胞内虾青素的积累，较高葡萄糖质量浓度（30g/L）对法夫酵母虾青素产量更为有利，太高的葡萄糖含量不仅会造成资源浪费，而且会出现较为严重的Crabtree effect，减弱法夫酵母对葡萄糖的利用率，同时酵母细胞还会产生乙醇、乙酸等代谢副产物降低了酶的合成，进而抑制了细胞生长。

将防风、黄芪、大黄、杏鲍菇、连翘按照干物质质量比0.2:0.5:1:1:0.5的比例混合，粉碎并过筛，加水煎煮至膏剂密度为1.2g/mL，加入2倍的水，调节pH至2.8，在35℃温度下，加入底物5%的混合酶，酶解2小时后沸水浴10分钟灭酶，10000r/min离心后取悬浮液与清液，低温制膏至密度为1.1g/mL即得中药膏剂；通过煎煮、酶解制得中药膏剂，其制备方法简单，没有加入任何有机试剂，对环境友好，同时可以最大程度的保留中草药中的活性成分，中药膏剂中富含糖类、小蛋白、活性多肽、苷类与萜类等活性物质，可以为红法夫酵母吸收利用，促进其高产虾青素。

中药膏剂的制备步骤中的混合酶为质量比为1:0.5:0.2:0.5的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶的混合酶；混合酶具有较高的酶解活性，能够较大程度上将中草药中的活性成分解离出来，将蛋白质进行降解得活性肽等小分子物质，从而便于红法夫酵母对其进行充分的利用。

将9mg无水硼酸、15mg硫酸锰、55mg五水合硫酸铜、1.95mg碘化钾、5mg氯酸铵、140mg六水合氯化铁、5mg钼酸铵、400mg七水合硫酸锌溶解于5mL蒸馏水中配制而成微量元素溶液；微量元素溶液富含硼、锰、铜、碘、钾、铁、钼、锌等微量元素，可加快酵母生长繁殖，促进其产虾青素，提高发酵效率。

生物素溶液为将1.0mg的生物素溶解在55mg的乙醇中，加蒸馏水至体积100mL；生物素是合成维生素C的必要物质，可促进酵母体内脂肪和蛋白质的正常代谢，维持红法夫酵母的正常生理活动以及虾青素的正常分泌。

一种高产虾青素发酵培养基的应用，将发酵培养基置于发酵罐中，接种入3%种子液，控制温度为23℃、通气量为3L/min，通过调节搅拌转速控制溶氧值在40%，恒温发酵5天即可；发酵过程可以富集得到虾青素，虾青素结构中的共轭双键，可以使某些活性氧有效的灭活，从而防止蛋白质等大分子的损伤及脂质的过氧化，通过抗氧化作用发挥保护机体的功效，虾青素能有效抑制与前列腺生长有关的5α-还原酶的活性，从而可以有效的抑制癌细胞的增殖，虾青素在体内可使血液中高密度脂蛋白显著升高而低密度脂蛋白降低，可用来预防冠心病、动脉硬化和缺血性脑损伤等心血管疾病；应用本发酵培养基发酵，红法夫酵母发酵后的生物量与虾青素产量均能得到大大提高，是一种高效、安全、简易的高产虾青素发酵培养基。

实施例2：

一种高产虾青素发酵培养基的配方技术，所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖29g、酵母膏5g、中药膏剂9g、五水合柠檬酸钠14g、磷酸氢二钾23g、无水硝酸按9g、七水合硫酸镁0.8g、二水合氯化钙0.4g、微量元素溶液0.45mL、生物素溶液0.24mL、氯仿0.016mL，以蒸馏水补齐1000mL；碳源是培养基的主要成分之一，是细胞各种代谢产物的主要元素，同时又是异养微生物生长的能量来源，高C/N比有利于法夫酵母细胞内虾青素的积累，较高葡萄糖质量浓度（30g/L）对法夫酵母虾青素产量更为有利，太高的葡萄糖含量不仅会造成资源浪费，而且会出现较为严重的Crabtree effect，减弱法夫酵母对葡萄糖的利用率，同时酵母细胞还会产生乙醇、乙酸等代谢副产物降低了酶的合成，进而抑制了细胞生长。

发酵培养基配方中的中药膏剂的制备步骤为：将防风、黄芪、大黄、杏鲍菇、连翘按照干物质质量比0.4:0.6:1.2:1:0.7的比例混合，粉碎并过筛，加水煎煮至膏剂密度为1.3g/mL，加入3倍的水，调节pH至3.2，在38℃温度下，加入底物6%的混合酶，酶解3小时后沸水浴15分钟灭酶，11500r/min离心后取悬浮液与清液，低温制膏至密度为1.1g/mL即得中药膏剂；通过煎煮、酶解制得中药膏剂，其制备方法简单，没有加入任何有机试剂，对环境友好，同时可以最大程度的保留中草药中的活性成分，中药膏剂中富含糖类、小蛋白、活性多肽、苷类与萜类等活性物质，可以为红法夫酵母吸收利用，促进其高产虾青素。

发酵培养基配方中的中药膏剂的制备步骤中的混合酶为质量比为1:0.8:0.3:0.6的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶的混合酶；混合酶具有较高的酶解活性，能够较大程度上将中草药中的活性成分解离出来，将蛋白质进行降解得活性肽等小分子物质，从而便于红法夫酵母对其进行充分的利用。

发酵培养基配方中的微量元素溶液为将9mg无水硼酸、20mg硫酸锰、56mg五水合硫酸铜、2mg碘化钾、5mg氯酸铵、140mg六水合氯化铁、6mg钼酸铵、450mg七水合硫酸锌，溶解于5mL蒸馏水中配制而成的溶液；微量元素溶液富含硼、锰、铜、碘、钾、铁、钼、锌等微量元素，铁是多种酶如过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素和细胞色素氧化酶等的组成元素，一旦铁元素不足，就可导致糖酵解过程的变化，进而影响酶的生成；铜是多种酶如细胞色素氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖酶、二胺氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硫化物氧化酶、酪氨酸氧化酶等的组成元素和刺激因子，参与体内的多种代谢活动，一旦铜元素不足或过量，微生物的代谢过程就会遭到破坏，造成生物生产性能的降低；镁是细胞中某些酶的活性基团，并具有调节和控制细胞质的胶体状态、细胞质膜的通透性和细胞代谢活动的功能；锰是多种酶的激活剂，有时可以代替镁，锌是乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性基；微量元素溶液可加快酵母生长繁殖，促进其产虾青素，提高发酵效率。

发酵培养基配方中的生物素溶液为将1.2mg的生物素溶解在60mg的乙醇中，加蒸馏水至体积100mL；生物素是合成维生素C的必要物质，可促进酵母体内脂肪和蛋白质的正常代谢，维持红法夫酵母的正常生理活动以及虾青素的正常分泌。

一种高产虾青素发酵培养基的应用，将发酵培养基置于发酵罐中，接种入5%种子液，控制温度为24℃、通气量为4L/min，通过调节搅拌转速控制溶氧值在50%，恒温发酵5天即可；发酵过程中，Idi基因编码烯焦磷酸异构酶，能催化烯焦磷酸异构化为二甲基烯丙基焦磷酸酯（DMAPP），DMAPP经过四异戊二烯焦磷酸合成酶（由crtE基因编码）、八氢番茄红素合成酶（由crtYB基因编码）、八氢番茄红素脱氢酶（由crtI基因编码）、番茄红素环化酶（由crtYB基因编码）的催化作用生成γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素，β-胡萝卜素经过由crtS基因编码的虾青素合成酶两步催化即可得到虾青素，虾青素结构中的共轭双键，可以使某些活性氧有效的灭活，从而防止蛋白质等大分子的损伤及脂质的过氧化，通过抗氧化作用发挥保护机体的功效，虾青素能有效抑制与前列腺生长有关的5α-还原酶的活性，从而可以有效的抑制癌细胞的增殖，虾青素在体内可使血液中高密度脂蛋白显著升高而低密度脂蛋白降低，可用来预防冠心病、动脉硬化和缺血性脑损伤等心血管疾病。

在发酵16小时时往发酵培养基中依次添加0.22mg/L t-亮氨酸叔丁酯、0.03mg/L6-苄基腺嘌呤、0.02mg/L吲哚乙酸、0.01mg/Lβ-萘氧乙酸；在红法夫酵母的发酵过程中添加植物生长调节剂如6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、β-萘氧乙酸，植物生长调节剂的添加能有效提高红法夫酵母的细胞活性，改善糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速细胞生长与繁殖，有助于提高代谢产物即菌体生物量，加快发酵，提高产率；吲哚乙酸在光下会被氧化为玫瑰红色，其生物活性会显著下降，t-亮氨酸叔丁酯在氯仿存在的条件下可以与吲哚乙酸发生络合反应，生成较稳定的水溶性络合物，从而防止吲哚乙酸遭受光降解而丧失生物学活性，该水溶性络合物可以被酵母细胞吸收从而变为吲哚乙酸的一种胞内储存形式，在适当条件下经解离即可以产生游离态吲哚乙酸供机体吸收利用并发挥生物学作用；t-亮氨酸叔丁酯也会在酶的作用下发生水解，生成亮氨酸供红法夫酵母吸收，不会对胞内环境产生影响，可以促进酵母生长繁殖，提高菌体生物量产量与产率，提高发酵效率，降低成本。

实施例3：

一种高产虾青素发酵培养基及其应用，包括以下步骤：

1.制备中药膏剂：将防风、黄芪、大黄、杏鲍菇、连翘按照干物质质量比0.5:0.8:1.5:1:0.8的比例混合，粉碎并过筛，加水煎煮至膏剂密度为1.5g/mL，加入4倍的水，调节pH至3.4，在40℃温度下，加入底物8%的混合酶，混合酶为质量比为1:1:0.4:0.6的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶的混合酶，酶解4小时后沸水浴20分钟灭酶，12000r/min离心后取悬浮液与清液，低温制膏至密度为1.2g/mL即得中药膏剂；通过煎煮、酶解制得中药膏剂，其制备方法简单，没有加入任何有机试剂，对环境友好，同时可以最大程度的保留中草药中的活性成分，中药膏剂中富含糖类、小蛋白、活性多肽、苷类与萜类等活性物质，可以为红法夫酵母吸收利用，促进其高产虾青素；

2.配制微量元素溶液：将10mg无水硼酸、25mg硫酸锰、58mg五水合硫酸铜、2.00mg碘化钾、6mg氯酸铵、150mg六水合氯化铁、8mg钼酸铵、500mg七水合硫酸锌，溶解于5mL蒸馏水中配制而成微量元素溶液；微量元素溶液富含硼、锰、铜、碘、钾、铁、钼、锌等微量元素，铁是多种酶如过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素和细胞色素氧化酶等的组成元素，一旦铁元素不足，就可导致糖酵解过程的变化，进而影响酶的生成；铜是多种酶如细胞色素氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖酶、二胺氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硫化物氧化酶、酪氨酸氧化酶等的组成元素和刺激因子，参与体内的多种代谢活动，一旦铜元素不足或过量，微生物的代谢过程就会遭到破坏，造成生物生产性能的降低；镁是细胞中某些酶的活性基团，并具有调节和控制细胞质的胶体状态、细胞质膜的通透性和细胞代谢活动的功能；锰是多种酶的激活剂，有时可以代替镁，锌是乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性基；微量元素溶液可加快酵母生长繁殖，促进其产虾青素，提高发酵效率；

3.配备生物素溶液：将1.2mg的生物素溶解在60mg的乙醇中，加蒸馏水至体积100mL即为生物素溶液；生物素是合成维生素C的必要物质，可促进酵母体内脂肪和蛋白质的正常代谢，维持红法夫酵母的正常生理活动以及虾青素的正常分泌。

4.发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖30g、酵母膏6g、中药膏剂10g、五水合柠檬酸钠15g、磷酸氢二钾25g、无水硝酸按10g、七水合硫酸镁1g、二水合氯化钙0.5g、微量元素溶液0.5mL、生物素溶液0.25mL、氯仿0.02mL，以蒸馏水补齐1000mL；碳源是培养基的主要成分之一，是细胞各种代谢产物的主要元素，同时又是异养微生物生长的能量来源，高C/N比有利于法夫酵母细胞内虾青素的积累，较高葡萄糖质量浓度（30g/L）对法夫酵母虾青素产量更为有利，太高的葡萄糖含量不仅会造成资源浪费，而且会出现较为严重的Crabtreeeffect，减弱法夫酵母对葡萄糖的利用率，同时酵母细胞还会产生乙醇、乙酸等代谢副产物降低了酶的合成，进而抑制了细胞生长。

5.一种高产虾青素发酵培养基的应用，将发酵培养基置于发酵罐中，接种入6%种子液，控制温度为24℃、通气量为5L/min，通过调节搅拌转速控制溶氧值在60%，恒温发酵7天即可；在红法夫酵母的发酵过程中添加植物生长调节剂如6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、β-萘氧乙酸，植物生长调节剂的添加能有效提高红法夫酵母的细胞活性，改善糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速细胞生长与繁殖，有助于提高代谢产物即菌体生物量，加快发酵，提高产率；从发酵液中可分离得到虾青素，虾青素结构中的共轭双键，可以使某些活性氧有效的灭活，从而防止蛋白质等大分子的损伤及脂质的过氧化，通过抗氧化作用发挥保护机体的功效，虾青素能有效抑制与前列腺生长有关的5α-还原酶的活性，从而可以有效的抑制癌细胞的增殖，虾青素在体内可使血液中高密度脂蛋白显著升高而低密度脂蛋白降低，可用来预防冠心病、动脉硬化和缺血性脑损伤等心血管疾病；应用本发酵培养基发酵，红法夫酵母发酵后的生物量与虾青素产量均能得到大大提高，是一种高效、安全、简易的高产虾青素发酵培养基。

作为对本实施例的改进，在发酵进行至0小时时，往发酵培养基中添加8g/L 60%的乙醇溶液，乙醇溶液中还含有3.3‰的莰烷酸，其中（1S，4R）-莰烷酸与（1R，4S）-莰烷酸的质量比为10:1；在红法夫酵母发酵过程中添加乙醇对法夫酵母产虾青素有一定的促进作用，乙醇可促进法夫酵母代谢过程中的乙醇脱氢酶和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的活性，HMG-CoA还原酶的活性提高后，将合成更多的甲羟戊酸进入虾青素合成途径，从而促进胞内虾青素的积累；此外，在乙醇的存在下，特殊配比的（1S，4R）-莰烷酸与（1R，4S）-莰烷酸具有协同刺激作用，该协同作用可以刺激红法夫酵母增强对腺苷酸环化酶的分泌，从而强化腺苷酸环化酶对三磷酸腺苷的催化作用，提高环化腺苷酸的产量，环化腺苷酸可以间接地介入对酵母血红蛋白基因的调控，增大血红蛋白的含量及活性，当酵母处于厌氧状态时，cAMP-CAP复合物（环化腺苷酸与分解代物激活剂蛋白复合体）可以通过对碳源的选择作用而使细胞的代谢适应于呼吸途径的改变，血红蛋白可结合大量胞内氧，使得细胞周质区氧的传递量大大增加，当细胞处于贫氧状态时，胞内血红蛋白大量积累，其中，周质空间中分布的接近50%的血红蛋白是以活性氧合状态的方式存在，在贫氧状态下能加速氧向胞内空间传递，通过为细胞膜的呼吸链提供更多的氧加速能量物质ATP的合成，提高了整个细胞的能量代谢水平，进而大幅提高法夫酵母发酵过程中的生物量产量与虾青素产量。

实施例4：

分别依据下述方法测定发酵液中生物量含量与虾青素含量：

生物量测定：在4000r/min的条件下，将发酵液离心5分钟，弃上清后用无菌水将得到的菌体洗涤3次，最后将菌体冷冻、干燥至恒重，并计算生物量含量（g/L）；

虾青素测定：将培养的菌悬液离心洗涤3次，沥干水分收集菌体，加入二甲基亚砜，振荡管壁，加入氯仿和乙醇混合溶液提取，直至菌体无色，然后离心取上清液；用分光光度计于480nm处测吸光值，以下列公式计算虾青素含量：虾青素总量（mg/L）=A×（Va/E）×Vb，式中：A--吸光度，Va--虾青素溶液的体积(L)，Vb--分析时所用发酵液体积(L)，E--消光系数(0.16)。

以上述方法分别定测实施例1-3中发酵液中的生物量含量与虾青素含量，如表1所示。

表1.实施例1-3中发酵液中的生物量含量与虾青素含量

项目	实施例1	实施例2	实施例3
				生物量含量（g/L）	16.0	20.8	22.1
虾青素含量（mg/L）	100.8	115.5	120.6

由表1可以看出，本发明方法的实施例1-3中，发酵液中的生物量与虾青素含量均较高，实现了虾青素的高产，尤其是实施例2、实施例3，其虾青素含量在115.5～120.6mg/L，因此本发明方法中的发酵培养基是一种高效、安全、简易的高产虾青素发酵培养基。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高产虾青素发酵培养基在红法夫酵母发酵以制备虾青素中的应用，具体为：将发酵培养基置于发酵罐中，接种入3-6%种子液，控制温度为23-25℃、通气量为3-5L/min，通过调节搅拌转速控制溶氧值在40-60%之间，恒温发酵5-7天即可；

所述发酵12-18小时时依次往培养基中添加0.2-0.25mg/L t-亮氨酸叔丁酯、0.025-0.030mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.02-0.022mg/L吲哚乙酸、0.01-0.015mg/L β-萘氧乙酸；

所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖28-30g、酵母膏5-6g、中药膏剂8-10g、五水合柠檬酸钠12-15g、磷酸氢二钾20-25g、无水硝酸按8-10g、七水合硫酸镁0.5-1g、二水合氯化钙0.2-0.5g、微量元素溶液0.4-0.5mL、生物素溶液0.2-0.25mL、氯仿0.015-0.02mL，以蒸馏水补齐1000mL；

所述中药膏剂的制备步骤为：将防风、黄芪、大黄、杏鲍菇、连翘按照干物质质量比0.2-0.5:0.5-0.8:1-1.5:1:0.5-0.8的比例混合，粉碎并过筛，加水煎煮至膏剂密度为1.2-1.5g/mL，加入2-4倍的水，调节pH至2.8-3.4，在35-40℃温度下，加入底物5-8%的混合酶，酶解2-4小时后沸水浴10-20分钟灭酶，10000-12000r/min离心后取悬浮液与清液，低温制膏至密度为1.1-1.2g/mL即得中药膏剂；所述中药膏剂的制备步骤中的混合酶为质量比为1:0.5-1:0.2-0.4:0.5-0.6的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶；

所述微量元素溶液为：将9-10mg无水硼酸、15-25mg硫酸锰、55-58mg五水合硫酸铜、1.95-2.00mg碘化钾、5-6mg氯酸铵、140-150mg六水合氯化铁、5-8mg钼酸铵、400-500mg七水合硫酸锌，溶解于5mL蒸馏水中配制而成的溶液；

所述生物素溶液为：将1.0-1.2mg的生物素溶解在55-60mg的乙醇中，加蒸馏水至体积100mL。

2.根据权利要求1所述的一种高产虾青素发酵培养基在红法夫酵母发酵以制备虾青素中的应用，其特征在于：所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖29g、酵母膏5g、中药膏剂8-9g、五水合柠檬酸钠13-14g、磷酸氢二钾22-24g、无水硝酸按9-10g、七水合硫酸镁0.7-0.8g、二水合氯化钙0.3-0.5g、微量元素溶液0.4-0.5mL、生物素溶液0.22-0.25mL、氯仿0.016-0.018mL，以蒸馏水补齐1000mL。

3.根据权利要求1所述的一种高产虾青素发酵培养基在红法夫酵母发酵以制备虾青素中的应用，其特征在于：所述发酵培养基的成分及其含量为：葡萄糖29g、酵母膏5g、中药膏剂9g、五水合柠檬酸钠14g、磷酸氢二钾23g、无水硝酸按9g、七水合硫酸镁0.8g、二水合氯化钙0.4g、微量元素溶液0.45mL、生物素溶液0.24mL、氯仿0.016mL，以蒸馏水补齐1000mL。

4.根据权利要求1所述的一种高产虾青素发酵培养基在红法夫酵母发酵以制备虾青素中的应用，其特征在于：所述红法夫酵母发酵后的生物量含量能达到15.8-22.2g/L，虾青素含量可达100.0-120.0mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种高产虾青素发酵培养基在红法夫酵母发酵以制备虾青素中的应用，其特征在于：所述在发酵进行至0小时时，往发酵培养基中添加8g/L60%的乙醇溶液，乙醇溶液中还含有3.3‰的莰烷酸。