CN103798523A - 一种同源性瘤胃微生态调控剂的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同源性瘤胃微生态调控剂的制备方法及应用。用55％乙醇提取荷青花、中南鱼藤根茎干粉三次，浓缩提取液至1/20，按一定比例制成复合液。用复合液连续培养瘤胃液，获得低甲烷活性瘤胃培养物。将培养物悬浮于人工唾液和复合液中，制成同源性瘤胃微生态调控剂。按体重的0.01％，将调控剂分别注入两种牛的瘤胃内，瘤胃甲烷产量分别下降了23.44％和21.45％，总挥发性脂肪酸提高了12.53％和19.47％，乙/丙下降了35.21％和37.71％，微生物蛋白提高了12.43％～25.88％和13.78％～26.4％，产甲烷菌和原虫分别下降了两个数量级，真菌和细菌分别提高了1-2个数量级。

Description

一种同源性瘤胃微生态调控剂的制备方法及应用

技术领域：

本发明涉及一种减少瘤胃甲烷生成、改善瘤胃发酵性能的同源性瘤胃微生态调控剂的制备方法及应用。

背景技术：

甲烷(CH₄)是超强温室气体，其温室效应是二氧化碳的20多倍。反刍动物是甲烷气体的主要来源之一，占到甲烷排放总量的15％，其中90％以上来自反刍动物瘤胃厌氧发酵。瘤胃产生甲烷也是反刍动物能量损失的重要原因，在反刍动物瘤胃厌氧发酵过程中约有6％～15％的饲料能量以甲烷的形式损耗。因此，降低瘤胃甲烷的产量，不仅能减少反刍动物温室气体排放，而且还可以提高瘤胃的饲料利用率，改善反刍动物的生产性能。

利用甲烷调控剂控制瘤胃甲烷生成是反刍动物甲烷减排的主要技术手段。瘤胃甲烷调控剂包括具有降甲烷作用的化学合成物、抗生素、微生物制剂和天然产物等。在各类甲烷调控剂中，化学合成和抗生素类调控剂由于生物毒性和残留问题多数已被禁止使用。微生物和天然产物甲烷调控剂是在对饲料添加剂要求越来越严格的背景下，近年开始研究的新型瘤胃甲烷调控剂，由于毒副作用小、无残留或残留极小、不易产生抗药性，较好地消除了化学合成物和抗生素类甲烷调控剂衍生的健康与环境问题，符合反刍动物健康养殖的要求，是瘤胃甲烷调控剂的发展方向。

尽管微生物和天然产物甲烷调控剂与化学合成和抗生素类甲烷调控剂相比，在安全性方面有着显著的优势，但降甲烷效果与其它甲烷调控剂一样，存在着有效时间较短、作用不够专一和稳定、调控效果不明显的问题。这种现象与反刍动物瘤胃微生物区系及其微生态系统特点密切相关。瘤胃微生物数量巨大、种群多样、群落结构复杂，建立在微生物群落基础上的瘤胃微生态系统具有抗干扰、自我修复和排斥外来生物的特点，这些特点与瘤胃特定的厌氧、高渗等环境条件共同构成了瘤胃的生态屏障。当天然产物调控剂进入瘤胃后，瘤胃中不同微生物群体相互作用，通过降解、转化等一系列生物化学过程，在较短时间内就可能削弱调控剂的影响，使调控作用减弱。而当异源性微生物甲烷调控剂进入瘤胃后，瘤胃原籍菌群则会通过竞争、排斥等一系列作用，使之难以在瘤胃内定居，更难形成能发挥作用的稳定种群。由此可见，如何克服瘤胃生态屏障，有效控制瘤胃甲烷生成，是反刍动物甲烷减排的关键问题。

发明内容：

技术问题

为了克服上述瘤胃生态屏障问题，改善瘤胃调控效果，有效减少瘤胃甲烷生成，本发明提供了一种同源性微生态调控剂的制备方法。将该方法制备的同源性微生态调控剂应用在肉牛养殖上，可显著减少瘤胃的甲烷生成量、提高瘤胃总挥发性脂肪酸产量、降低瘤胃乙酸/丙酸比值、提高瘤胃菌体蛋白产量、减少瘤胃内产甲烷菌和原虫数量、增加瘤胃细菌和真菌数量，且效果明显优于单独使用的降甲烷天然产物。

技术方案

实现本发明的技术方案是：

A、提取物复合液的制备

采集荷青花(Hylomecon japonica)和中南鱼藤(Derris fordii)成熟植株根茎，分别置50℃干燥箱内烘至恒重，粉碎过0.25mm筛，干粉用5倍量55％乙醇回流提取3次，每次2小时，分别合并提取液，回收乙醇并浓缩至原体积的1/20。按荷青花浓缩液1：中南鱼藤浓缩液1、荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1、荷青花浓缩液1：中南鱼藤浓缩液2三种体积份比，配成提取物复合液。用于本发明具体实施的提取物复合液，其优选体积份比为荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1。

B、低甲烷活性瘤胃培养物的制备

培养装置采用固液气分流式瘤胃模拟系统。开始时向两个发酵罐分别注入670mL成年永丰黄牛新鲜瘤胃液，分别向两罐加入15g配制的牛基础饲粮，向其中一个罐(培养罐)注入5mL提取物复合液(荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1)，向另一个罐(对照罐)注入5mL灭菌水，最后用人工唾液分别将两罐的发酵体积调至1000mL。设定培养条件：温度39℃、转速15r/min、液体稀释率8％/h、固体稀释率4％/h。每天9:00和21:00分别从两发酵罐的排固口抽出100mL发酵过食糜，从加料口分别向两罐中加入15g牛基础饲粮补料、95mL人工唾液补液，向培养罐注入5mL提取物复合液，向对照罐注入5mL灭菌水，分别向两罐中不断充入N₂，用以维持罐内的厌氧环境。两发酵罐分别外接一个气体采集袋，每三天一次分别收集补料后72h内的气体样本，用气相色谱测定甲烷含量。连续培养24d后，培养罐的甲烷生成量比同期对照罐减少44.3％，达到最低值，继续培养24d，甲烷生成量一直维持在最低点值附近，这表明培养罐内培养物的低甲烷活性特点已稳定，因此在第48d的19:00终止培养，静置2小时后，于21:00从培养罐中部的排液口将发酵液收集到离心管内，用纯N₂饱和后密封，于39℃和4000rpm条件下离心10min，在厌氧操作下弃除上清液，合并离心固形物，该合并的离心固形物为低甲烷活性牛瘤胃培养物。对照罐的甲烷生成量自始至终保持平稳。

C、同源性瘤胃微生态调控剂的制备

用上述低甲烷活性牛瘤胃培养物八倍量的人工唾液加上两倍量的提取物复合液(荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1)，在厌氧操作箱中分散悬浮培养物，就制成了同源性瘤胃微生态调控剂。

D、同源性瘤胃微生态调控剂的应用

选择大小相近的12月龄雄性永丰黄牛6头，以及大小相近的12月龄雄性夏洛莱牛6头，安装永久性瘤胃瘘管，在相同条件下喂养1月。14月龄时，永丰黄牛和夏洛莱牛各自随机分为同源性微生态调控剂试验组、降甲烷植物提取物试验组和对照组，每组2头。同源性微生态调控剂试验组每天按体重的0.01％，经由瘤胃瘘管一次性灌注新鲜同源性瘤胃微生态调控剂，降甲烷植物提取物试验组用同样的方法一次性灌注同样份量的前述提取物复合液(荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1)，对照组按相同比例和相同方法灌注灭菌水。与此同时，向每头牛瘤胃投放SF₆渗透管，采用SF₆示踪技术分别在第0d(灌注前)、6d、12d、18d、24d和第30d收集牛全天经口、鼻排出的气体样本，用气相色谱检测甲烷含量，计算出瘤胃24小时的甲烷产生量。在采集气体样本的同一天，经由瘤胃瘘管采集瘤胃液样本，用气相色谱法定量瘤胃样品中乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，并计算乙酸/丙酸比值；采用嘌呤法测定样品中的微生物蛋白质含量，采用比色法测定氨态氮浓度；同时提取各时间点瘤胃液样品的微生物基因组DNA，使用RT-qPCR技术检测细菌、真菌、产甲烷菌和原虫的相对数量。应用试验持续时间30d。

有益效果

A、减少瘤胃甲烷生成的效果

瘤胃甲烷排放量测试结果表明，同源性瘤胃微生态调控剂试验组的永丰黄牛和夏洛莱牛的甲烷生成量走势基本相同，前期均呈连续下降趋势，至第24d趋于稳定，试验结束时永丰黄牛和夏洛莱牛瘤胃甲烷生成量分别减少了23.44％和21.45％；降甲烷植物提取物试验组甲烷的最大降幅出现在第6d，永丰黄牛比试验前减少了16.01％，夏洛莱牛比试验前减少了15.47％，此后甲烷生成量缓慢回升，至试验结束时永丰黄牛减少了10.33％，夏洛莱牛减少了12.93％；而对照组永丰黄牛和夏洛莱牛的甲烷生成量在试验前后没有明显变化。可见，同源性瘤胃微生态调控剂可显著减少牛瘤胃的甲烷生成量，且作用优于单独使用的降甲烷植物提取物。

B、对瘤胃挥发性脂肪酸的影响

瘤胃液样本挥发性脂肪酸测试结果表明，同源性微生态调控剂可提高牛瘤胃的挥发性脂肪酸产量，永丰黄牛和夏洛莱牛分别提高了12.53％和19.47％，与此同时，同源性微生态调控剂还降低了乙酸/丙酸比值，与试验前相比，永丰黄牛和夏洛莱牛瘤胃的乙酸/丙酸比值分别降低35.21％和37.71％；降甲烷植物提取物也提高了瘤胃挥发性脂肪酸产量，其中永丰黄牛提高了3.43％～4.91％，夏洛莱牛提高了1.17％～7.26％，并降低了瘤胃乙酸/丙酸比值，其中永丰黄牛降低了11.59％～16.43％，夏洛莱牛降低了9.39％～20.31％；对照组永丰黄牛和夏洛莱牛瘤胃的挥发性脂肪酸产量和乙酸/丙酸比值试验前后均无明显变化。由此可见，两种甲烷调控剂都能提高牛瘤胃的挥发性脂肪酸产量，降低乙酸/丙酸比值，但同源性微生态调控剂的效果显著优于降甲烷植物提取物。

C、对瘤胃氨氮和菌体蛋白产量的影响

试验期间，同源性微生态调控剂分别降低了永丰黄牛和夏洛莱牛瘤胃氨氮浓度10.61％～18.17％和14.07％～24.4％，提高了瘤胃菌体蛋白产量12.43％～25.88％和13.78％～26.4％；降甲烷植物提取物降低永丰黄牛和夏洛莱牛瘤胃氨氮的幅度为4.65％～10.56％和5.62％～12.59％，同时提高菌体蛋白产量6.34％～19.97％和4.92％～18.49％。试验结果表明，两种调控剂均能提高牛瘤胃氨氮的利用率和菌体蛋白产量，但同源性微生态调控剂的作用更明显。对照组牛瘤胃的氨氮和菌体蛋白浓度在试验期间均未出现明显变化。

D、对瘤胃微生物的影响

瘤胃微生物的RT-qPCR检测结果表明，随着试验进程，同源性微生态调控剂试验组永丰黄牛瘤胃的产甲烷菌数量下降了2个数量级，在试验期间的各个时段都比对照组低2-3个数量级，原虫数量也下降了2个数量级，相反，细菌数量提高了2个数量级，真菌数量提高了约1个数量级；降甲烷植物提取物试验组永丰黄牛瘤胃的微生物数量构成介于同源性微生态调控剂试验组和对照组之间。RT-qPCR检测结果同样显示，两种调控剂对夏洛莱牛瘤胃微生物的影响与对永丰黄牛瘤胃微生物的影响相似。试验结果表明，两种调控剂对牛瘤胃的微生物数量构成均可产生显著影响，但同源性微生态调控剂的作用更为明显。

利用荷青花和中南鱼藤的提取物复合液经过体外发酵，生产出低甲烷活性瘤胃培养物，再利用荷青花和中南鱼藤的提取物复合液和低甲烷活性瘤胃培养物，制备出同源性瘤胃微生态调控剂，可有效解决瘤胃甲烷调控中的生态屏障问题，改善调控效果。应用本方法制备的瘤胃微生态调控剂，不仅能减少瘤胃甲烷生成量，还能显著改善瘤胃的发酵性能，提高瘤胃挥发性脂肪酸，降低乙酸/丙酸比值，提高瘤胃菌体蛋白产量，其作用明显优于单独使用的降甲烷天然产物。本方法制备的瘤胃微生态调控剂应用在亲缘关系较远的永丰黄牛和夏洛莱牛上，效果没有明显差异，说明该瘤胃微生态调控剂具有较广阔的应用领域和较好的开发前景。

具体实施方式：

A、提取物复合液的制备

采集荷青花(Hylomecon japonica)和中南鱼藤(Derris fordii)成熟植株根茎，分别置50℃干燥箱内烘至恒重，粉碎过0.25mm筛，干粉用5倍量55％乙醇回流提取3次，每次2小时，分别合并提取液，回收乙醇并浓缩至原体积的1/20。按荷青花浓缩液1：中南鱼藤浓缩液1、荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1、荷青花浓缩液1：中南鱼藤浓缩液2三种体积份比，配成提取物复合液。用于本发明具体实施的提取物复合液，其优选体积份比为荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1。

B、低甲烷活性瘤胃培养物的制备

培养装置采用固液气分流式瘤胃模拟系统。开始时向两个发酵罐分别注入670mL成年永丰黄牛新鲜瘤胃液，分别向两罐加入15g配制的牛基础饲粮(详见表1)，向其中一个罐(培养罐)注入5mL提取物复合液(荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1)，向另一个罐(对照罐)注入5mL灭菌水，最后用人工唾液(详见表2、表3)分别将两罐的发酵体积调至1000mL。设定培养条件：温度39℃、转速15r/min、液体稀释率8％/h、固体稀释率4％/h。每天9:00和21:00分别从两发酵罐的排固口抽出100mL发酵过食糜，从加料口分别向两罐中加入15g牛基础饲粮补料、95mL人工唾液补液，向培养罐注入5mL提取物复合液，向对照罐注入5mL灭菌水，分别向两罐中不断充入N₂，用以维持罐内的厌氧环境。两发酵罐分别外接一个气体采集袋，每三天一次分别收集补料后72h内的气体样本，用气相色谱测定甲烷含量。连续培养24d后，培养罐的甲烷生成量比同期对照罐减少44.3％，达到最低值，继续培养24d，甲烷生成量一直维持在最低点值附近(详见表4)，这表明培养罐内培养物的低甲烷活性特点已稳定，因此在第48d的19:00终止培养，静置2小时后，于21:00从培养罐中部的排液口将发酵液收集到离心管内，用纯N₂饱和后密封，于39℃和4000rpm条件下离心10min，在厌氧操作下弃除上清液，合并离心固形物，该合并的离心固形物为低甲烷活性牛瘤胃培养物。对照罐的甲烷生成量自始至终保持平稳。

C、同源性瘤胃微生态调控剂的制备

用上述低甲烷活性牛瘤胃培养物八倍量的人工唾液加上两倍量的提取物复合液(荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1)，在厌氧操作箱中分散悬浮培养物，就制成了同源性瘤胃微生态调控剂。

D、同源性瘤胃微生态调控剂的应用

选择大小相近的12月龄雄性永丰黄牛6头，以及大小相近的12月龄雄性夏洛莱牛6头，安装永久性瘤胃瘘管，在相同条件下喂养1月。14月龄时，永丰黄牛和夏洛莱牛各自随机分为同源性微生态调控剂试验组、降甲烷植物提取物试验组和对照组，每组2头。同源性微生态调控剂试验组每天按体重的0.01％，经由瘤胃瘘管一次性灌注新鲜同源性瘤胃微生态调控剂，降甲烷植物提取物试验组用同样的方法一次性灌注同样份量的前述提取物复合液(荷青花浓缩液2：中南鱼藤浓缩液1)，对照组按相同比例和相同方法灌注灭菌水。与此同时，向每头牛瘤胃投放SF₆渗透管，采用SF₆示踪技术分别在第0d(灌注前)、6d、12d、18d、24d和第30d收集牛全天经口、鼻排出的气体样本，用气相色谱检测甲烷含量，计算出瘤胃24小时的甲烷产生量，检测结果详见表5。在采集气体样本的同一天，经由瘤胃瘘管采集瘤胃液样本，用气相色谱法定量瘤胃样品中乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，并计算乙酸/丙酸比值，检测结果详见表6；采用嘌呤法测定样品中的微生物蛋白质含量，采用比色法测定氨态氮浓度，检测结果详见表7、表8；同时提取各时间点瘤胃液样品的微生物基因组DNA，使用RT-qPCR技术检测细菌、真菌、产甲烷菌和原虫的相对数量，检测结果详见表9、表10。应用试验持续时间30d。试验前后日粮配方详见表1。

表1 牛基础饲粮组成(干物质基础)

人工唾液配制：

表2 人工唾液原液配制表

表3 人工唾液配制表(1000mL)

表4 提取物复合液对牛瘤胃培养物甲烷的影响

表5 同源性微生态制剂对牛瘤胃甲烷产量的影响

表6 同源性微生态制剂对牛瘤胃挥发性脂肪酸产量及乙丙酸比例的影响

表7 同源性微生态制剂对牛瘤胃氨氮的影响

表8 同源性微生态制剂对牛瘤胃微生物蛋白质产量的影响

表9 同源性微生态制剂对永丰黄牛瘤胃微生物相对量的影响

表10 同源性微生态制剂对夏洛莱牛瘤胃微生物相对量的影响

Claims (6)

1.一种同源性瘤胃微生态调控剂的制备方法及应用，其特征在于：将植物提取物复合液和低甲烷活性瘤胃培养物按一定比例，配制成同源性瘤胃微生态调控剂。

2.根据权利要求1所述的同源性瘤胃微生态调控剂，其特征在于：采集荷青花和中南鱼藤成熟植株根茎，烘至恒重，分别粉碎过0.25mm筛，用55％乙醇提取三次，分别浓缩至原体积的1/20，按荷青花提取物浓缩液2：中南鱼藤提取物浓缩液1的体积份配成植物提取物复合液。

3.根据权利要求1所述的同源性瘤胃微生态调控剂，其特征在于：利用植物提取物复合液在体外连续培养牛瘤胃液48d，离心收集低甲烷活性瘤胃培养物。

4.根据权利要求1所述的同源性瘤胃微生态调控剂，其特征在于：用相当于培养物8倍量的人工唾液加上2倍量的植物提取物复合液，悬浮分散低甲烷活性瘤胃培养物，制成同源性瘤胃微生态调控剂。

5.根据权利要求1所述的同源性瘤胃微生态调控剂，其特征在于：按动物体重的0.01％，每日经由瘤胃瘘管，将同源性瘤胃微生态调控剂一次性注入牛瘤胃。

6.根据权利要求5所述的同源性瘤胃微生态调控剂，其特征在于：同源性瘤胃微生态调控剂不仅可显著地减少牛瘤胃的甲烷生成量，同时还能提高总挥发性脂肪酸产量，降低乙/丙酸比值，提高瘤胃菌体蛋白含量。