CN110463838B - 一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂及其制备方法和应用，属于饲料添加剂技术领域。本发明所述制备方法中采用的肉桂油和棉籽油具有显著降甲烷和改善瘤胃功能，采用肉桂油和棉籽油的混合油对反刍动物瘤胃液进行诱导发酵，利用低甲烷活性瘤胃原籍菌群的同源属性克服瘤胃生态屏障，通过同源菌群改造瘤胃微生物群落，实现对瘤胃微生态系统的有效调控，成功选育出了低甲烷活性瘤胃培养物，能够有效减少瘤胃甲烷排放，并将低甲烷活性瘤胃培养物与混合油混合制备得到降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂。

Description

一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂及其制备方法和应用。
背景技术
甲烷(CH4)作为一种主要的温室气体，其对全球气候变暖的贡献率已超过15％。其中反刍动物是甲烷气体的主要来源之一，占到全球每年甲烷排放总量的15％，其中90％以上来自反刍动物瘤胃厌氧发酵。瘤胃产生的甲烷不仅是超强温室气体，同时也是造成瘤胃发酵能量损失的重要原因，在反刍动物瘤胃厌氧发酵过程中约有6～15％的饲料能量以甲烷的形式损耗。因此，降低瘤胃甲烷的产量，不仅能减少反刍动物温室气体排放，而且还可以提高瘤胃的饲料利用率，改善反刍动物的生产性能，增加反刍家畜养殖效益。
利用甲烷调控剂调控瘤胃甲烷生成是反刍动物甲烷减排的主要技术手段。瘤胃甲烷调控剂包括具有降甲烷作用的化学合成物、抗生素、微生物制剂和天然产物等。其中，微生物和天然产物甲烷调控剂由于毒副作用小、无残留或残留极小、不易产生抗药性，较好地消除了化学合成物和抗生素类甲烷调控剂衍生的健康与环境问题，符合反刍动物健康养殖的要求，是瘤胃甲烷调控剂的发展方向。
尽管微生物和天然产物甲烷调控剂与化学合成和抗生素类甲烷调控剂相比，在安全性方面有着显著的优势，但降甲烷效果与其它甲烷调控剂一样，存在着有效时间较短、作用不够专一和稳定、调控效果不明显的问题。这种现象与反刍动物瘤胃微生物区系及其微生态系统特点密切相关。瘤胃微生物数量巨大、种群多样、群落结构复杂，建立在微生物群落基础上的瘤胃微生态系统具有抗干扰、自我修复和排斥外来生物的特点，这些特点与瘤胃特定的厌氧、高渗等环境条件共同构成了瘤胃的生态屏障。由于瘤胃消化功能的极端重要性，对反刍动物瘤胃进行的任何调控都必须是不造成其发酵功能紊乱的“微调”，并通过谨慎选择调控剂种类和剂量加以实现。而在微调状态下，当天然产物调控剂进入瘤胃后，瘤胃中不同微生物群体相互作用，通过降解、转化等一系列生物化学过程，在较短时间内就可能大大削弱甚至消除调控剂的影响，使调控作用减弱或失效。而当异源性微生物甲烷调控剂进入瘤胃后，瘤胃原籍菌群则会通过竞争、排斥等一系列作用，使之难以在瘤胃内定居，更难形成能发挥作用的稳定种群。由此可见，如何在不影响瘤胃发酵功能和动物健康的前提下，克服瘤胃生态屏障，有效控制瘤胃甲烷产量，是反刍动物甲烷减排的关键性科学问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂及其制备方法和应用，该诱导剂能够有效降低反刍动物瘤胃甲烷产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂的制备方法，包括以下步骤:
1)将肉桂油和棉籽油按0.5～1.5:8～10的体积比混合，得到混合油；
2)在反刍动物瘤胃液中添加步骤1)所述混合油，于35～42℃的条件下厌氧发酵50～65d，得到瘤胃菌群培养物；
厌氧发酵第1～10d混合油添加的频率为1～3d/次，厌氧发酵第11～30d混合油添加的频率为4～6d/次，厌氧发酵第31～65d混合油添加的频率为9～11d/次；每次添加混合油的体积和所述反刍动物瘤胃液的体积的比例为2～4mL:0.5～1.5L；
3)将步骤2)所述瘤胃菌群培养物和步骤1)所述混合油按照8～10:0.5～1.5的体积比混合，得到诱导剂。
优选的，步骤2)中所述厌氧发酵的温度为38～40℃。
优选的，步骤2)中所述厌氧发酵的时间为55～62d。
优选的，步骤2)中所述反刍动物瘤胃液包括牛瘤胃液。
优选的，步骤3)中所述瘤胃菌群培养物和混合油的体积比为8～10:0.8～1.2。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的诱导剂。
本发明还提供了一种包含上述方案所述诱导剂的饲料。
本发明还提供了上述方案所述诱导剂或上述方案所述饲料在降低反刍动物瘤胃甲烷产量中的应用。
优选的，所述反刍动物包括黄牛。
优选的，所述应用的方式包括将诱导剂混合到饲料中进行饲喂，每只反刍动物的诱导剂饲喂量为8～105mL/d。
本发明的有益效果：本发明提供了一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂的制备方法，该制备方法中采用的肉桂油和棉籽油具有显著降甲烷和改善瘤胃功能，采用肉桂油和棉籽油的混合油对反刍动物瘤胃液进行诱导发酵，利用低甲烷活性瘤胃原籍菌群的同源属性克服瘤胃生态屏障，通过同源菌群改造瘤胃微生物群落，实现对瘤胃微生态系统的有效调控，成功选育出了低甲烷活性瘤胃培养物，能够有效减少瘤胃甲烷排放，并将低甲烷活性瘤胃培养物与混合油混合制备得到降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂。将该诱导剂应用于黄牛330d，发现黄牛瘤胃发酵性能达到稳定状态，与对照组相比，甲烷排放量显著降低了28.15％，微生物蛋白则显著增加了26.71％，瘤胃发酵由乙酸发酵型向丙酸发酵型转变。在停止使用诱导剂后60d后，其甲烷减排率仍保持在12.18％。
附图说明
图1为实施例2中甲烷日排放量及排放速率比较。
具体实施方式
本发明提供了一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂的制备方法，包括以下步骤:
1)将肉桂油和棉籽油按0.5～1.5:8～10的体积比混合，得到混合油；
2)在反刍动物瘤胃液中添加步骤1)所述混合油，于35～42℃的条件下厌氧发酵50～65d，得到瘤胃菌群培养物；
厌氧发酵第1～10d混合油添加的频率为1～3d/次，厌氧发酵第11～30d混合油添加的频率为4～6d/次，厌氧发酵第31～65d混合油添加的频率为9～11d/次；每次添加混合油的体积和所述反刍动物瘤胃液的体积的比例为2～4mL:0.5～1.5L；
3)将步骤2)所述瘤胃菌群培养物和步骤1)所述混合油按照8～10:0.5～1.5的体积比混合，得到诱导剂。
本发明首先将肉桂油和棉籽油按0.5～1.5:8～10的体积比混合，得到混合油；所述肉桂油和棉籽油的体积比优选为0.8～1.2:8～10，更优选为1:9；所述肉桂油和棉籽油来源于常规市售，本发明具体实施过程中，所述肉桂油和棉籽油均购自于吉安盛达香料油有限公司，含量高于99.0％；所述肉桂油和棉籽油具有显著降甲烷和改善瘤胃功能；本发明对所述混合的温度和时间没有特殊限制，以混合均匀为准。
得到混合油后，本发明在反刍动物瘤胃液中添加所述混合油，于35～42℃的条件下厌氧发酵50～65d，得到瘤胃菌群培养物；所述瘤胃菌群培养物具有低甲烷活性；所述厌氧发酵的温度为优选为38～40℃，更优选为39℃；所述厌氧发酵的时间优选为55～62d，更优选为58～60d；厌氧发酵第1～10d混合油添加的频率为1～3d/次，优选为2d/次，厌氧发酵第11～30d混合油添加的频率为4～6d/次，优选为5d/次，厌氧发酵第31～65d混合油添加的频率为9～11d/次，优选为10d/次；每次添加混合油的体积和所述反刍动物瘤胃液的体积的比例为2～4mL:0.5～1.5L，优选为2～4mL:0.8～1.2L，更优选为3mL:1L；所述厌氧发酵采用的设备优选为瘤胃体外连续发酵装置，简称RUSTEC。
本发明中，所述混合油能够降低产甲烷菌的多样性和丰度，减少产甲烷菌的种类，进而使得瘤胃产甲烷能力减弱，甲烷量减少。
得到瘤胃菌群培养物后，本发明将所述瘤胃菌群培养物和上述方案制备得到的混合油按照8～10:0.5～1.5的体积比混合，得到诱导剂；所述瘤胃菌群培养物和混合油的体积比优选为8～10:0.8～1.2，更优选为9:1；本发明对所述混合的温度和时间没有特殊限制，以混合均匀为准。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的诱导剂。
本发明还提供了一种包含上述方案所述诱导剂的饲料。
本发明还提供了上述方案所述诱导剂在降低反刍动物瘤胃甲烷产量中的应用；所述反刍动物优选的包括黄牛；所述应用的方式优选的是将诱导剂混合到饲料中进行饲喂，每只反刍动物的诱导剂饲喂量优选为8～105mL/d，更优选的新生牛的诱导剂饲喂量为8mL/d，1月龄牛犊的诱导剂饲喂量为20mL/d，从2月龄开始按每头牛每天增加10mL诱导剂的幅度递增，直至105mL/d。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂的制备方法
1.材料与装置
肉桂油、棉籽油、黄牛瘤胃液(肉桂油和棉籽油购买于吉安盛达香料油有限公司)；装置：瘤胃体外发酵连续培养装置。
2.制备方法
1)将100mL肉桂油和900mL棉籽油混合，得到混合油；
2)取1L黄牛瘤胃液，在黄牛瘤胃液中添加3mL混合油，于39℃的条件下进行厌氧发酵60d，发酵期间分批次加入混合油，添加频次是开始10d每2d添加1次混合油制剂，11～30d每5d添加1次，30～60d每10d添加1次；经过60d的体外连续诱导培养后，获得了甲烷产量降低44.47％的低甲烷化黄牛瘤胃菌群培养物；
3)取900mL上述低甲烷化瘤胃菌液，在其中加入混合油100mL，混合均匀得到诱导剂。
4)在每升新鲜黄牛瘤胃液中加入3mL诱导剂，进行降甲烷处理，结果表明，该诱导剂的降甲烷效果明显，与不添加混合油制剂的对照组相比，甲烷下降了52.65％。
实施例2瘤胃复合诱导剂使用效果情况
1.采用体外培养法，按每升新鲜瘤胃液加入1、3、5、7、10mL的剂量添加配比实施例1制备得到的诱导剂，39℃，120rpm连续厌氧发酵培养24h。结果参见表1，结果表明，随着瘤胃复合诱导剂添加量的增加，发酵气体种的甲烷含量逐步下降，添加量为3mL/L时，与不添加混合油制剂的对照组相比，发酵气体中的甲烷含量下降了46.28％，总产气量、总挥发性脂肪酸(TVFA)、氨氮(NH3-N)等参数变化不大，而(微生物蛋白)MCP增加了43.10％。
表1瘤胃复合诱导剂对体外发酵产气、产甲烷及主要发酵参数的影响
Figure BDA0002214514420000051
Figure BDA0002214514420000061
2.实施例1制备的诱导剂拌精料饲喂黄牛：新生牛8mL/d，1月龄牛犊20mL/d，从2月龄开始按每头牛每天增加10mL的幅度递增，直至105mL/d。如图1和表2所示，其中NY1为对照组；NY2为试验组，结果表明，使用诱导剂后甲烷排放量试验组比对照组降低28.15％，使用诱导剂后微生物蛋白试验组比对照组显著增加了26.71％，试验组瘤胃由乙酸型发酵向丙酸型转变。
表2试验组与对照组瘤胃发酵参数比较
Figure BDA0002214514420000062
Figure BDA0002214514420000071
实施例3细菌群落结构组成
将15日龄9头试验牛分成三组，NY1组为对照组，不使用诱导剂；NY2组为持续使用诱导剂组；NY3组为持续使用诱导剂330天后停止使用诱导剂60天。
门水平参见表3：
从NY1(对照组)；NY2(饲喂实施例1诱导剂试验组)；NY3(停用诱导剂试验组)的瘤胃样本中共检测到24个门分类的细菌，相对含量较高的为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、古生菌门(Euryarchaeota)、螺旋原虫门(Spirochaetes)和变形菌门(Proteobacteria)，相对丰度达到92％以上。诱导剂相对提高了拟杆菌门(Bacteroidetes)和古生菌门(Euryarchaeota)丰度，但没有达到显著性差异，降低了厚壁菌门(Firmicutes)和螺旋原虫门(Spirochaetes)丰度。显著提高了丝状杆菌门(Fibrobacteres)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和蓝细菌门(Cyanobacteria)相对丰度。
表3门水平优势菌相对丰度统计分析
Figure BDA0002214514420000072
属水平参见表4：
从属分类水平比较，在NY1、NY2和NY3的瘤胃样本共测定出289个细菌物种，占丰度的72％以上，其中优势菌为Prevotella_1、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Christensenellaceae_R-7_group，它们与瘤胃中物质代谢密切相关。诱导剂显著提高了Prevotella_1相对丰度，并且在停止饲喂45d后还有效果，保持持久作用，但是相对降低了Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Christensenellaceae_R-7_group丰度，达到显著性差异。
表4属水平优势菌相对丰度统计分析
Figure BDA0002214514420000081
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种降低反刍动物瘤胃甲烷产量的诱导剂的制备方法，由以下步骤组成:
1)将肉桂油和棉籽油按0.5～1.5:8～10的体积比混合，得到混合油；
2)在反刍动物瘤胃液中添加步骤1)所述混合油，于35～42℃的条件下厌氧发酵50～65d，得到瘤胃菌群培养物；
厌氧发酵第1～10d混合油添加的频率为1～3d/次，厌氧发酵第11～30d混合油添加的频率为4～6d/次，厌氧发酵第31～65d混合油添加的频率为9～11d/次；每次添加混合油的体积和所述反刍动物瘤胃液的体积的比例为2～4mL:0.5～1.5L；
3)将步骤2)所述瘤胃菌群培养物和步骤1)所述混合油按照8～10:0.5～1.5的体积比进行混合，得到诱导剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述厌氧发酵的温度为38～40℃。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述厌氧发酵的时间为55～62d。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述反刍动物瘤胃液包括牛瘤胃液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述瘤胃菌群培养物和混合油的体积比为8～10:0.8～1.2。
6.权利要求1～5任意一项所述制备方法制备得到的诱导剂。
7.一种包含权利要求6所述诱导剂的饲料。
8.权利要求6所述诱导剂或权利要求7所述饲料在降低反刍动物瘤胃甲烷产量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反刍动物包括黄牛。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的方式包括将诱导剂混合到饲料中进行饲喂，每只反刍动物的诱导剂饲喂量为8～105mL/d。
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