CN101904418A - 绞股蓝皂甙用于减少动物瘤胃内甲烷产生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及绞股蓝皂甙用于减少动物瘤胃内甲烷产生的方法，属于添加剂的使用方法，按每公斤体重添加0.05-0.30克绞股蓝皂甙，每天分早晚两次拌料饲喂。添加绞股蓝皂甙改变了山羊瘤胃产甲烷菌区系，一些产甲烷优势菌在皂甙处理后消失，产甲烷菌数量下降50％以上。体外批次发酵试验证实，添加绞股蓝皂甙后甲烷浓度分别下降2.3％，9.4％，6.9％和20.7％。本发明结果说明，在饲料中添加绞股蓝皂甙可减少瘤胃甲烷产量，提高饲料能量利用效率，降低反刍动物养殖业中反刍动物瘤胃发酵所产甲烷对大气环境的污染。

Description

绞股蓝皂甙用于减少动物瘤胃内甲烷产生的方法

一、技术领域

本发明涉及绞股蓝皂甙用于减少动物瘤胃内甲烷产生的方法，属于添加剂的使用方法，用于反刍动物的饲养，诸如奶牛，肉牛，山羊和绵羊等，减少瘤胃甲烷生成，提高饲料能量利用，缓解反刍动物养殖中反刍动物瘤胃发酵产甲烷对环境的污染。

二、背景技术

近几个世纪，仅次于二氧化碳的甲烷有明显的提高，是人类活动产生的第二种重要温室气体。自18世纪工业革命以来，人类活动及人口的迅速增长，特别是农业、化石燃料的使用及废物的处理，使甲烷释放量呈倍数增加。目前大气层中甲烷浓度已达1774ppb，每年有5～5.5亿吨甲烷进入大气，远远超过了大气反应和土壤微生物利用所能消耗的总和，导致甲烷气体每年以0.9％的速度递增，高于二氧化碳的0.5％(IPCC，1992)。预测今后50年内甲烷可引起15～17％的温室效应(IPCC，1992)。大气甲烷浓度的逐渐升高引起研究人员对其来源和沉积的研究，近年来生物学家也开始对甲烷释放产生兴趣。

减少甲烷气体的排放量，需从各个方面采取缓解措施，如从工业，农业，能量和家庭起居生活入手。农业所产甲烷占人类活动甲烷总产量的三分之二(IPCC，1995)，其中，反刍动物瘤胃发酵所产甲烷约占人类活动总产量的22％，是全球甲烷总排放量的15％。农业甲烷排放最为重要的来源是反刍动物瘤胃及其排泄物释放的甲烷。

瘤胃内栖息着多种多样的微生物，形成一个十分复杂的微生态系统，特别是细菌，原虫及一些真菌共同降解植物聚合物成为挥发性脂肪酸(瘤胃主要的能源)，H₂和二氧化碳。其中H₂被产甲烷古菌用作能量来还原二氧化碳，形成甲烷。据估计，每头牛每天产生250～500升的甲烷(Johnson和Johnson，1995)，全球13亿头牛所产甲烷占家畜甲烷总产量的73％～80％(Johnson，1994)。对于反刍动物来说，甲烷作为饲料能量损失被释放到大气中。由于反刍家畜甲烷产量大，且动物群体数量多，因此，反刍动物甲烷产量是一个不可忽视的因素。反刍动物甲烷的排放不仅引起饲料能量的损失(甲烷可占总能的2％～12％)，且造成环境污染。调控反刍动物瘤胃活动来减少甲烷释放成为减少甲烷排放的一种途径。

瘤胃中大约有9～25％瘤胃产甲烷菌与原虫共生，并产生相应部分的甲烷。植物皂甙作为抗生素促生长剂的替代品在饲料中得到广泛应用，用于调控瘤胃微生物发酵和减少甲烷释放，提高瘤胃的饲料利用效率。原虫对皂甙的敏感性被认为是植物皂甙能够与细胞膜中的胆固醇结合，导致细胞膜完整性丧失，最终导致细胞死亡。原虫数量下降，引起与其共生的产甲烷菌及瘤胃甲烷产量的下降，这种调控反刍动物甲烷释放的机制引起人们的兴趣。

目前，国内外已对绞股蓝皂甙在中医药领域的应用有了广泛的研究，且作为饲料添加剂在单胃动物养殖中已开始应用，如猪、鸡等。作为饲料添加剂用于调控反刍动物瘤胃微生物发酵，减少反刍动物瘤胃微生物甲烷产生的作用效果尚未报道。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种简单、可靠的方法减少反刍动物瘤胃内甲烷的产生，提高饲料能量利用效率，缓解来自反刍动物瘤胃甲烷气体对环境的污染。该天然植物提取物可以在反刍动物正常饲养过程中使用，符合绿色饲料添加剂要求。

技术方案

本发明是采用体外试验和动物试验，结合PCR/DGGE和Real time PCR技术，分析绞股蓝皂甙对反刍动物瘤胃甲烷产量和微生物区系的影响，最终确定绞股蓝皂甙可以用作反刍动物瘤胃微生物发酵的调控剂，以减少甲烷产生，提高饲料能量利用率，缓解甲烷对大气环境的污染。

本发明所提供绞股蓝皂甙用于减少动物瘤胃内甲烷产生的方法为，其特征在于，使用绞股蓝皂甙，按0.05-0.30g/kg.B.W剂量即基于每公斤反刍动物体重，每天添加0.05-0.30g绞股蓝皂甙，每天分早晚两次拌料饲喂。

有益效果

绞股蓝皂甙作为反刍动物特种饲料添加剂，属于新的生物技术。绞股蓝皂甙作为抑菌、杀菌和消炎等作用。根据研究发现，绞股蓝皂甙对瘤胃原虫产生毒性作用，减少原虫数量，进而减少与其共生产甲烷菌数量，达到减少甲烷的合成，降低甲烷释放造成的能量损失，提高饲料能量利用效率，缓解甲烷对大气环境的污染。结果表明，添加低剂量绞股蓝皂甙(10mg/60mL培养液)能够提高瘤胃微生物挥发性脂肪酸产量，对甲烷产量有显著的抑制作用。耐受性试验中，利用产甲烷菌特异性引物扩增的PCR产物进行DGGE分析显示，绞股蓝皂甙改变了产甲烷菌的区系，一些优势产甲烷菌消失。与对照组比较，绞股蓝皂甙组产甲烷菌数量降低50％以上，瘤胃原虫降低27％。添加绞股蓝皂甙降低了与原虫共生产甲烷菌数量，且对瘤胃液中游离产甲烷菌产生抑制作用。同时绞股蓝皂甙组的真菌数量提高50％以上，黄化瘤胃球菌近3倍，产琥珀酸丝状杆菌32％，说明绞股蓝皂甙对几种纤维降解菌有促进作用。血液生化指标结果显示，如血糖，胆固醇，甘油三酯，血液尿素氮和血清总蛋白都没有发生显著变化，表明该皂甙可作为反刍动物添加剂使用，符合绿色饲料添加剂要求，对动物无毒副作用。

本发明中技术使用方便，使用效果好。本发明具有降低反刍动物瘤胃微生物甲烷生成，提高饲料能量利用率，降低甲烷对环境的污染，保护地球生态环境的重要意义。

四、附图说明

图1添加绞股蓝皂甙后山羊瘤胃产甲烷菌区系的DGGE图谱

图中箭头所示为皂甙处理后产甲烷菌消失条带。

图中A，B，C和D代表4只山羊；M，marker；1，2，3和4，代表对照及三个处理组。

图2添加皂甙后六次传代培养液中产甲烷菌区系的DGGE图谱

图中箭头所示为皂甙处理后产甲烷菌消失条带。

G0-G6，传代次数；C和T，对照组和处理组。

五、具体实施方式

绞股蓝皂甙来自陕西康威生物工程有限公司产品，含量≥98％。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：绞股蓝皂甙对山羊瘤胃微生物数量的影响

4只一岁、体重约为30±2kg的具有瘤胃瘘管的波尔公山羊，采用4×4拉丁方试验设计。整个试验期为64天，分4期。每期16天，11天预试期，5天采样期。处理组绞股蓝皂甙的添加量每天为0.067，0.133和0.267g/kg.B.W，对照组不添加绞股蓝皂甙，分早晚两次饲喂。早晨饲喂前采集瘤胃液，提取总DNA，利用黄化瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和真菌的特异性引物(Denman SE，et al.，2006.Development of a real-time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen.FEMS Microbiol Ecol，58，572-582)及产甲烷菌的特异性引物(Denman SE，et al.，2007.Quantitation and diversity analysis of ruminal methanogenic populations in response to the antimethanogenic compound bromochloromethane.FEMS Microbiol Ecol，62，313-322)对微生物进行定量分析，4对引物扩增的片段长度分别为132，121，120和140bp。利用血细胞计数板对原虫进行计数。利用产甲烷的特异性引物519/915(Cheng YF，et al.，2009.Molecular diversity analysis of rumen methanogenic archaea from goat in eastern China by DGGE methods using different primer pairs.Letters in Applied Microbiology，48：585-592)结合DGGE技术对山羊瘤胃产甲烷菌区系进行分析，此引物扩增片段长度为400bp左右。饲喂前和饲喂后3h颈静脉采血并析出血清，分析相关血液生化指标。

试验结果见表1，与对照组比较，其中0.067g/kg.B.W组产甲烷菌数量下降50％以上，瘤胃原虫下降27％，结果显示添加绞股蓝皂甙降低了与原虫共生产甲烷菌数量及瘤胃原虫数量。0.067g/kg.B.W组瘤胃真菌数量提高50％以上，黄化瘤胃球菌提高近3倍，产琥珀酸丝状杆菌提高32％，结果说明添加低剂量绞股蓝皂甙可促进瘤胃主要纤维降解菌的增殖，从而在一定程度上影响甲烷生成前体----氢的供应量。高剂量组(0.133g/kg.B.W和0.267g/kg.B.W)对真菌和纤维降解菌产生显著的抑制作用，说明高剂量组可抑制甲烷生成前体----氢的形成。DGGE图谱上代表不同种优势产甲烷菌的条带发生变化(扩增16S rRNA片段的碱基长度相似，但碱基存在差别，在DGGE胶上处在不同位置，代表不同的产甲烷菌)，其中5条优势产甲烷菌消失(如图1中箭头所示)。对山羊血液生化指标没有显著影响，见表2。表明低剂量绞股蓝皂甙(0.067g/kg.B.W)可抑制瘤胃原虫和产甲烷菌数量，同时促进纤维降解真菌与细菌的生长，对山羊正常的生理代谢无负面影响。

实施例2：绞股蓝皂甙对瘤胃微生物甲烷生成的影响

早晨饲喂前通过瘤胃瘘管采集波尔山羊瘤胃液，四层纱布过滤后作为接种物，瘤胃液与已预热的厌氧微生物培养基按1∶2的比例混合，成为培养液。(培养基由微量元素A液，缓冲液B，缓冲液C，D液和还原剂溶液E组成。其中A液为每100mL蒸馏水中加入CaCl₂·2H₂O 13.2g，MnCl₂·4H₂O 10.0g，CoCl₂·6H₂O1.0g，FeCl₃·6H₂O 8.0g，B液为1L蒸馏水中加入NH₄HCO₃ 4.0g，NaHCO₃ 35.0g，C液为1L蒸馏水中加入Na₂HPO₄ 5.7g，KH₂PO₄ 6.2g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，D液为0.1％的刃天青溶液，E液为每100mL蒸馏水中加入盐酸半胱氨0.625gNaOH160mg，Na₂S·9H₂O 0.625g。培养基配制过程：400mL蒸馏水中加入0.1mL溶液A，200ml溶液C，1ml刃天青溶液，用CO₂饱和保存于39℃恒温水浴箱中5-6小时，再加入40ml还原剂溶液E，混匀，用CO₂饱和，并加热至39℃)。采用厌氧体外批次培养技术(Theodorou MK，et al.，1995.Determination of growth of anaerobic fungi on soluble and cellulosic substrates using a pressure transducer.Microbiology，141，671-678)进行体外发酵，厌氧条件下将培养液60mL分装到已加入底物及绞股蓝皂甙的发酵瓶中后，密闭。底物0.6g，由粗料和精料按7∶3组成(即0.42g羊草和0.18g精料)，精料由玉米和豆粕按7∶3组成(即0.126g玉米和0.054g豆粕)，试验组绞股蓝皂甙添加量分别为5，10，20和40mg，对照组不添加绞股蓝皂甙，39℃发酵24小时，利用气相色谱仪测定发酵气体中的甲烷浓度。

试验结果，绞股蓝皂甙处理组甲烷浓度分别下降2.3％，9.4％，6.9％和20.7％。

实施例3：绞股蓝皂甙对多次传代后产甲烷菌区系的影响

利用体外批次培养技术进行发酵，培养基配制及底物的量和比例同实施例2。在厌氧条件下向已加入底物和绞股蓝皂甙的发酵瓶中分装50mL培养基，试验组绞股蓝皂甙添加量分别为5、10和20mg，对照组不添加绞股蓝皂甙，密闭121℃灭菌15min。39℃条件下6次传代培养，第一代接种物为早晨饲喂前四层纱布过滤的波尔山羊瘤胃液10ml，后5代接种物依次为上代发酵24h的无污染发酵液10ml(接种物与培养基的比例是1∶5)。每代发酵结束时，采集发酵液提取总DNA，利用产甲烷菌特异性引物519/915和DGGE技术分析对照组和20mg组产甲烷菌区系(同实施例1)。

试验结果，经过6次传代，绞股蓝皂甙处理组产甲烷菌的区系产生很大的变化，7条优势产甲烷菌条带从DGGE图上消失(如图2中箭头所示)，表明绞股蓝皂甙能够抑制产甲烷菌。以上结果表明，绞股蓝皂甙能够降低反刍动物瘤胃甲烷生成，改变瘤胃产甲烷菌区系，一些优势产甲烷菌消失。

表1 绞股蓝皂甙对山羊瘤胃微生物数量的影响

注：T，显著性；L，线性效应；Q，二次方效应。

表2 绞股蓝对山羊血液生化指标的影响

注：T，显著性；L，线性效应；Q，二次方效应

Claims (3)

1.绞股蓝皂甙作为减少反刍动物瘤胃内甲烷产生的饲用添加剂的应用。

2.根据权利要求1所述绞股蓝皂甙作为降低瘤胃内甲烷产生的饲料添加剂的应用，其特征在于：来源于各类植物提取的绞股蓝皂甙。

3.根据权利要求1或2所述的绞股蓝皂甙作为降低瘤胃发酵产甲烷的饲料添加剂的应用，其特征在于：所述的绞股蓝皂甙的用量为，按每公斤反刍动物体重每天添加0.05-0.30g绞股蓝皂甙，分两次早晚拌料饲喂。

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