CN103380852B - 一种减少瘤胃微生物甲烷生成量的天然产物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及瘤胃调控领域，具体涉及一种减少瘤胃微生物甲烷生成量的天然产物制剂。一种减少瘤胃微生物甲烷生成量的天然产物制剂，该天然产物制剂是由蔓荆子果实粉碎后，经质量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到的干粉。该天然产物制剂可显著减少瘤胃微生物甲烷的生成量。本发明还提供一种所述的天然产物制剂的制备工艺。本发明还提供一种所述的天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成方面的应用。本发明通过乙醇提取蔓荆子的挥发油等有效成分，通过氮吹和冷冻干燥法制备干粉。瘤胃体外发酵试验显示，该制剂在0.4g/L即每克干物质添加40mg添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷生成量达21.7%。
Description
技术领域
本发明涉及瘤胃调控领域，具体涉及一种减少瘤胃微生物甲烷生成量的天然产物制剂。
背景技术
粗饲料是反刍动物最主要的饲料来源，粗饲料中的各种纤维物质的降解毋庸置疑是瘤胃中发生的最重要的消化过程。这一过程产生大量的氢，如果氢气累积，将抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氢化，导致乳酸等还原性发酵产物蓄积（Wolin等, 1997），进而使粗饲料的消化和有益微生物的生长受阻。生成甲烷是瘤胃内最主要的排氢途径。反刍动物瘤胃代谢过程中，依饲喂水平、日粮组成及消化率不同，大约有 2%-15%的饲料能以甲烷的形式被损失掉（Johnson和Johnson, 1995）。全球反刍动物年产甲烷约 7.7×107吨，占散发到大气中的甲烷总量的 15%，而且每年还以 1%的速度递增（IPCC, 2007）。甲烷是与全球气候变化密切相关的温室气体，对全球气候变暖的影响作用占到所有影响气候变暖作用的 15%-20%，其增温潜势是二氧化碳的62倍。因此，减少反刍动物甲烷的排放对环境和动物生产具有双重意义。
离子载体（莫能菌素, Van Nevel和Demeyer 等, 1995）、有机酸（富马酸, Yuan等, 2007）、卤代化合物（溴氯甲烷, Denman等2007; 2-溴乙烷磺酸钠, Guo等, 2008）等化学物质都能减少甲烷的排放，但由于化学物质存在耐受性和残留问题，限制了它的实际应用。皂甙（Wang等, 2012）、单宁（Waghorn等, 2003）、蒽醌（Kung等, 2003）等植物提取物在抑制甲烷生成及安全性方面展示出一定优势。中草药具有与食物同源、同体、同用的特点，毒副作用小、无耐药性，且功能多样，是现代化学药物、抗生素、激素类药物所无法比拟的。
发明内容
本发明提供一种减少瘤胃微生物甲烷生成量的天然产物制剂，该天然产物制剂可显著减少瘤胃微生物甲烷的生成量。
本发明还提供一种所述的天然产物制剂的制备工艺。
本发明还提供一种所述的天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成方面的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种减少瘤胃微生物甲烷生成量的天然产物制剂，该天然产物制剂是由蔓荆子果实粉碎后，经质量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到的干粉。蔓荆子果实和叶含挥发油，主要为莰烯（Camphene）和蒎烯（Pinene），并含有微量生物碱和维生素 A；果实中尚含牡荆子黄酮（Vitexicarpin）。挥发油中含有大量的不饱和键，可以与氢发生加合反应，减少甲烷菌对氢的利用，从而减少甲烷的生成；黄酮是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基；生物碱具有一定的杀菌效果。为了在常温下高效获得蔓荆子果实中的挥发油和黄酮，及少量生物碱，减少提取物中糖分比例，并便于提取液浓缩制成干粉，醇溶液控制在60-80%，且以70%最好。介于蔓荆子果实含有上述功能性成份，蔓荆子在减少瘤胃甲烷生成中应具有一定的效果。蔓荆子具有广源性和协同性，其功能提取物制剂经科学配伍后有望进一步全面改善瘤胃功能。
一种所述的天然产物制剂的制备工艺，该工艺包括如下步骤：用中药粉碎机将蔓荆子果实粉碎为粉末状，加入适量质量百分含量60-80%的乙醇溶液混合均匀，经漩涡振荡、旋转混合器混合、离心后，吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干后，冷冻干燥得到天然产物制剂干粉。
作为优选，所述的制备工艺具体包括如下步骤：
（1）用中药粉碎机将蔓荆子果实粉碎为粉末状，放入离心管中，加入适量70%乙醇溶液；
（2）漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min→3000r离心5min；
（3）吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
（4）离心管中沉淀保留，继续添加适量70%乙醇溶液→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→3000r离心5min；
（5）吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24 - 48h，待升至室温称重，封瓶 ，-20℃保存。
一种所述的天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成方面的应用，该天然产物制剂在每克饲料中的添加量为35-45mg。另一种表述是，该天然产物制剂在瘤胃液中达到0.4g/L添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷产量。
作为优选，该天然产物制剂在使用时用DMSO稀释至35-45mg/mL。在小剂量使用时，为保证添加量的准确，该天然产物制剂可用DMSO稀释。实际生产上用可以直接加干粉。
本发明通过乙醇提取蔓荆子的挥发油等有效成分，通过氮吹和冷冻干燥法制备干粉。瘤胃体外发酵试验显示，该制剂在0.4g/L即每克干物质添加40mg添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷生成量达21.7%。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
旋转混合器，华利达WH-962。
实施例1：
（1）用中药粉碎机将蔓荆子果实粉碎为粉末状，称取0.25g于15mL离心管中，加入5mL70%乙醇溶液；
（2）漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min（两次共计1h）→3000r离心5min；
（3）吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
（4）离心管中沉淀保留，继续添加5mL 70%乙醇→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min（三次共计1.5h）→3000r离心5min；
（5）吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24 - 48h，待升至室温称重，封瓶 ，-20℃保存。
实施例2：
（1）用中药粉碎机将蔓荆子果实粉碎为粉末状，称取0.25g于15mL离心管中，加入5mL60%乙醇溶液；
（2）漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min（两次共计1h）→3000r离心5min；
（3）吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
（4）离心管中沉淀保留，继续添加5mL 60%乙醇→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min（三次共计1.5h）→3000r离心5min；
（5）吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24 - 48h，待升至室温称重，封瓶 ，-20℃保存。
实施例3：
（1）用中药粉碎机将蔓荆子果实粉碎为粉末状，称取0.25g于15mL离心管中，加入5mL80%乙醇溶液；
（2）漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min（两次共计1h）→3000r离心5min；
（3）吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
（4）离心管中沉淀保留，继续添加5mL 80%乙醇→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min（三次共计1.5h）→3000r离心5min；
（5）吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24 - 48h，待升至室温称重，封瓶 ，-20℃保存。
下面结合瘤胃体外发酵试验详细说明该制剂减少甲烷生成的幅度：
（1）蔓荆子果实提取物的制备和稀释
采用实施例1制得的蔓荆子果实提取物干粉，用DMSO稀释干粉至40mg/mL，得到蔓荆子果实提取物DMSO溶液。
（2）提取物瘤胃体外发酵试验
采用压力读取式体外产气法开展减少甲烷生成效果试验。试验分两组进行，分别为对照组、蔓荆子果实提取物组（简称：提取物组），每组三个重复。试验底物为干物质重量比为30：70的玉米和羊草。称取干物质0.5g的混合底物，置入120mL产气瓶中，再将产气瓶置于厌氧培养箱中。晨饲前，从3头瘘管奶牛瘤胃的3个不同位点共抽取大约2 L左右的瘤胃液，经4层纱布过滤后，与9倍体积的厌氧人工唾液混合后，得到人工瘤胃液。取50mL人工瘤胃液于每个产气瓶，提取物组添加500μL、浓度为40mg/mL的蔓荆子果实提取物DMSO溶液，终浓度为0.4g/L，即每克干物质添加40mg蔓荆子果实提取物。对照组添加DMSO 500μL，置于39±0.5 ℃的恒温箱中培养24h后，用气相色谱仪测量甲烷产量。
试验分三个批次，每个批次3个重复实验，数据见表1，三个批次甲烷产量对照组和提取物组为分别为0.969和0.830mmol，0.995和0.720 mmol，1.017和0.782 mmol。提取物组降低甲烷产量分别达14.3、27.6和23.1%。
表1 蔓荆子果实提取物对瘤胃体外发酵24h时甲烷生成量的影响
注肩标字母不同为差异显著（P < 0.05）
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (2)
1.一种天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成方面的应用，其特征在于：该天然产物制剂在每克饲料中的添加量为35-45mg；
所述天然产物制剂是经过下述方法制得：
（1）用中药粉碎机将蔓荆子果实粉碎为粉末状，放入离心管中，加入适量质量百分含量70%乙醇溶液；
（2）漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min→3000r离心5min；
（3）吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
（4）离心管中沉淀保留，继续添加适量质量百分含量70%乙醇溶液→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→3000r离心5min；
（5）吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机干燥24 - 48h，待升至室温称重，封瓶 ，-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：该天然产物制剂在使用时用DMSO稀释至35-45mg/mL。
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