CN104206797A - 一种提高反刍动物肉奶cla含量的天然产物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，该天然产物制剂既减少了瘤胃微生物甲烷生成量，又无需过瘤胃保护潜在提高反刍动物肉和奶中共轭亚油酸（CLA）含量。该天然产物制剂是由紫苏子果实粉碎后，经质量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到的干粉。本发明通过乙醇提取紫苏子的脂肪酸等有效成分，通过氮吹和冷冻干燥法制备干粉。瘤胃体外发酵试验显示，该制剂在0.4g/L即每克干物质添加40mg添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷生成量达63.3%，同时对挥发性脂肪酸、氨态氮和总细菌数无显著影响。本发明所述的天然产物即保证了乳和肉产量，又提高了乳肉中CLA浓度，所以是真正意义上的获到高CLA功能性产品的有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及瘤胃调控领域，具体涉及一种减少瘤胃微生物甲烷生成量，并且无需过瘤胃保护提高反刍动物肉和奶中共轭亚油酸(CLA)含量的天然产物制剂。
背景技术
补充富含多不饱和脂肪酸的油，如亚油酸(C18:2，大豆和向日葵)和亚麻酸(C18:3，亚麻籽)，能减少瘤胃甲烷生产分别达4.1％和4.8％(分别来自19个和20个观测值,Martin等,2009)。但不饱和脂肪酸的添加显著抑制瘤胃消化，进而降低反刍动物生产性能(Zhang等,2008)。
共轭亚油酸(CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸的位置和几何异构体的混合物。在CLA的不同异构体中，各自的生理功能和生物活性不同。c9,t11CLA单独或与其他异构体共同在抗癌方面具有生物活性(Pariza等，1999)。同样，t10，c12CLA是影响能量代谢和降低机体脂肪沉积的活性形式。
CLA的抗癌作用是它受到众多研究者重视的主要原因，已在多种试验模型中得到证实，这些模型包括：小鼠的胃癌、小鼠的皮肤癌和大鼠的乳腺癌及兔和仓鼠的动脉粥样硬化(Cook等，1993；Ip等，1990，1996；Miller等，1994；Belury等，1996)。许多离体实验表明，CLA还对许多人类的癌细胞的生长具有抑制作用(Shultz等，1992；Visonneau等，1996；Cunningham等，1997)。另外，在最近的流行病调查中得到证实，随着乳品消费量的增长，妇女患乳腺癌的几率减少；调查人员发现该成果可能归功于牛乳脂中CLA的抗癌作用。
研究人员试图通过添加脂肪提高牛奶CLA含量，如脂肪酸钙、全脂籽实和植物油。由于富含亚油酸的植物油的凝固点过低，单独一种植物油很难合成脂肪酸钙，需要添加饱和度高、凝固点高的棕榈油或牛羊油，这样脂肪酸钙中的亚油酸含量降低。由于受疯牛病影响，已限制在奶牛饲料中应用牛油来源的脂肪酸钙，所以在欧共体国家已大规模减少脂肪酸钙用量。在德国、丹麦，受消费趋势的影响，脂肪酸钙在奶牛场已停用。另外在小肠中脂肪酸与钙重新结合，难以溶解，消化率低。全脂籽实在奶牛日粮配合方面灵活性太差，限制了其在奶牛日粮中的配合比例，另从研究的角度来讲，是否存在脂肪与蛋白甚至其他物质的互作效应也未可知。由于植物油对瘤胃细菌尤其是纤维分解菌的生长与活力有抑制作用(Jenkins，1997)，进而影响瘤胃纤维的正常发酵，降低乙酸浓度，降低乳脂率，传统上反刍动物日粮中一般不包含植物油。奶牛产奶高峰期日粮能量浓度低，而采食量是一定的，若过度增加精料饲喂量容易出现酮病、蹄叶炎、酸中毒等营养代谢性疾病。目前市售过瘤胃保护型CLA以期提高牛奶中CLA含量，不仅成本高而且工艺繁琐。
紫苏子是一种常见的中草药，为唇形科植物紫苏的干燥成熟果实，功效降气消痰、止咳平喘、润肠。早在《神农本草》中关于紫苏的记载，紫苏籽油被认为是调味精品和食疗珍品，在古时是进贡皇帝的名贵营养食用油(张洪,2006)。
发明内容
本发明提供一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，该天然产物制剂既减少了瘤胃微生物甲烷生成量，又无需过瘤胃保护潜在提高反刍动物肉和奶中共轭亚油酸(CLA)含量。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，该天然产物制剂是由紫苏子果实粉碎后，经质量百分含量60-80％的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到的干粉。紫苏子果实含有大量的不饱和脂肪酸，主要为α-亚麻酸、油酸、亚油酸、软脂酸和硬脂酸。其中a-亚麻酸对人体具有明显的保健功能和生理功效(徐章华,2002)。不饱和脂肪酸中含有大量的不饱和键，可以与氢发生加合反应，减少甲烷菌对氢的利用，从而减少甲烷的生成。为了高效获得紫苏子果实中的不饱和脂肪酸且不影响其化学性质，选择在常温下乙醇提取，便于提取液浓缩制成干粉，醇溶液控制在60-80％，且以70％最好。介于紫苏子果实含有上述功能性成份，紫苏子在减少瘤胃甲烷生成中具有一定的效果。紫苏子具有广源性和协同性，其功能提取物制剂经科学配伍后有望进一步全面改善瘤胃功能。本发明人在实验过程中意外的发现，其在具有减少瘤胃甲烷生成功能的同时竟然不影响瘤胃挥发性脂肪酸(VFA)生成量，不影响细菌的数量，这是与其他常规富含不饱和脂肪酸的天然产物具有显著区别之处。
一种所述的天然产物制剂的制备工艺，该工艺包括如下步骤：用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，加入适量质量百分含量60-80％的乙醇溶液混合均匀，经漩涡振荡、旋转混合器混合、离心后，吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干后，冷冻干燥得到天然产物制剂干粉。
作为优选，所述的制备工艺具体包括如下步骤：
(1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，放入离心管中，加入适量70％乙醇溶液；
(2)漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min→3000rpm离心5min；
(3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
(4)离心管中沉淀保留，继续添加适量70％乙醇溶液→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→3000rpm离心5min；
(5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24-48h至干粉，待升至室温称重，封瓶，-20℃保存。
所述的天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成、提高反刍动物肉奶CLA含量中的应用，其特征在于：该天然产物制剂在每克饲料中的添加量为35-45mg。另一种表述是，该天然产物制剂在瘤胃液中达到0.4g/L添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷产量，不影响瘤胃挥发性脂肪酸和氨态氮生成量，不影响瘤胃细菌总量。一些常规的用于降低瘤胃微生物甲烷产量的天然产物制剂，如植物油，由于不饱和脂肪酸含量较高，会抑制反刍动物的瘤胃消化，所以只能以损失增重和降低乳产量和乳脂率为代价来降低甲烷排放，而且这种常规植物油的添加虽在一定程度上提高了乳中CLA浓度，但却降低了总的乳脂产量，所以在生产中为了提高乳中CLA含量，必须对植物油等物质进行包被，否则无法实现真正意义上的CLA功能乳的生产。而这些植物油一旦包被在瘤胃中又无法发挥其降甲烷的功效。而本发明所述的天然产物制剂在无过瘤胃保护情况下，该天然产物制剂在每克饲料中的添加量为35-45mg并不影响瘤胃挥发性脂肪酸生成量、氨态氮浓度，且该剂量添加时并不影响细菌的数量。CLA是细菌对亚油酸氢化作用的一类中间代谢物，本发明所述的天然产物含有高浓度的亚油酸，所以在细菌含量不受到影响的同时，细菌可将此天然产物中的亚油酸氢化为CLA，进入血液循环到达乳腺，提高乳中的CLA浓度，同时由于本发明所述的天然产物对挥发性脂肪酸生成量和氨态氮浓度无影响，说明该天然产物的添加不影响瘤胃的消化和营养物质向机体的供应，所以乳和肉产量也不会发生变化。因此本发明所述的天然产物即保证了乳和肉产量，又提高了乳肉中CLA浓度，所以是真正意义上的获到高CLA功能性产品的有效途径。而且本发明所述的天然产物对瘤胃甲烷排放有很好的减排作用。所以本发明的天然产物制剂是一种即可降低甲烷排放，又可提高乳肉CLA含量有效天然产物。
作为优选，该天然产物制剂在使用时用DMSO稀释至35-45mg/mL。在小剂量使用时，为保证添加量的准确，该天然产物制剂可用DMSO稀释，实际生产上用可以直接加干粉。
本发明通过乙醇提取紫苏子的脂肪酸等有效成分，通过氮吹和冷冻干燥法制备干粉。瘤胃体外发酵试验显示，该制剂在0.4g/L即每克干物质添加40mg添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷生成量达63.3％，同时对挥发性脂肪酸、氨态氮和总细菌数无显著影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
旋转混合器，華利逹WH-962。
实施例1：
(1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，称取0.25g于15mL离心管中，加入5mL70％乙醇溶液；
(2)漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min(两次共计1h)→3000rpm离心5min；
(3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
(4)离心管中沉淀保留，继续添加5mL70％乙醇→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min(三次共计1.5h)→3000rpm离心5min；
(5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24-48h至干粉，待升至室温称重，封瓶，-20℃保存。
实施例2：
(1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，称取0.25g于15mL离心管中，加入5mL60％乙醇溶液；
(2)漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min(两次共计1h)→3000rpm离心5min；
(3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
(4)离心管中沉淀保留，继续添加5mL60％乙醇→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min(三次共计1.5h)→3000rpm离心5min；
(5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24-48h至干粉，待升至室温称重，封瓶，-20℃保存。
实施例3：
(1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，称取0.25g于15mL离心管中，加入5mL80％乙醇溶液；
(2)漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→旋转混合器混合30min(两次共计1h)→3000rpm离心5min；
(3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
(4)离心管中沉淀保留，继续添加5mL80％乙醇→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min(三次共计1.5h)→3000rpm离心5min；
(5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24-48h至干粉，待升至室温称重，封瓶，-20℃保存。
下面结合瘤胃体外发酵试验详细说明该制剂减少甲烷生成的幅度：
(1)紫苏子果实提取物的制备和稀释
采用实施例1制得的紫苏子果实提取物干粉，用DMSO稀释干粉至40mg/mL，得到紫苏子果实提取物DMSO溶液。
(2)提取物瘤胃体外发酵试验
采用压力读取式体外产气法开展减少甲烷生成效果试验。试验分两组进行，分别为对照组、紫苏子果实提取物组(简称：紫苏子组)，每组三个重复。试验底物为干物质重量比为30：70的玉米和羊草。称取干物质0.5g的混合底物，置入120mL产气瓶中，再将产气瓶置于厌氧培养箱中。晨饲前，从3头瘘管奶牛瘤胃的3个不同位点共抽取大约2L左右的瘤胃液，经4层纱布过滤后，与9倍体积的厌氧人工唾液混合后，得到人工瘤胃液。取50mL人工瘤胃液于每个产气瓶，紫苏子组添加500μL、浓度为40mg/mL的紫苏子果实提取物DMSO溶液，终浓度为0.4g/L，即每克干物质添加40mg紫苏子果实提取物。对照组添加DMSO500μL，每个处理组3个重复，随机置于39±0.5℃的恒温箱中培养。24h后，用气相色谱仪测量甲烷产量和挥发性脂肪酸。取1ml发酵液，用酶标仪比色法测定铵态氮浓度。取2ml发酵液，C-Tab法提取基因组DNA，进一步使用Real-time PCR绝对定量总细菌、原虫、真菌和甲烷菌。
紫苏子组相对对照组甲烷产量降低了63.3％，挥发性脂肪酸和氨态氮浓度两个处理组没有差异，数据见表1。紫苏子组原虫、真菌和甲烷菌的拷贝数显著低于对照组，而总细菌数则没有差异，数据见表2。
表1紫苏子果实提取物对瘤胃体外发酵甲烷生成量、挥发性脂肪酸和铵态氮的影响
*g：底物干物质；注肩标字母不同为差异显著(P<0.05)
表2紫苏子果实提取物对瘤胃体外发酵总细菌、原虫、真菌和甲烷菌的影响
*g：发酵产物混合物13000g/min离心所得沉淀；注肩标字母不同为差异显著(P<0.05)
CLA是细菌对亚油酸氢化作用的一类中间代谢物，本发明所述的天然产物含有高浓度的亚油酸，所以细菌含量不受影响，细菌可将此天然产物中的亚油酸氢化为CLA，进入血液循环到达乳腺，提高乳中的CLA浓度，同时由于本发明所述的天然产物对挥发性脂肪酸生成量和氨态氮浓度无影响，该天然产物的添加不影响瘤胃的消化和营养物质向机体的供应，所以乳和肉产量也不会发生变化。因此本发明所述的天然产物即保证了乳和肉产量，又提高了乳肉中CLA浓度，所以是真正意义上的获到高CLA功能性产品的有效途径。而且本发明所述的天然产物对瘤胃甲烷排放有很好的减排作用，所以是一种即可降低甲烷排放，又可提高乳肉CLA含量有效天然产物。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (5)
1. 一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，其特征在于：该天然产物制剂是由紫苏子果实粉碎后，经质量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到的干粉。
2. 一种权利要求1所述的天然产物制剂的制备工艺，其特征在于该工艺包括如下步骤：用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，加入适量质量百分含量60-80%的乙醇溶液混合均匀，经漩涡振荡、旋转混合器混合、离心后，吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干后，冷冻干燥得到天然产物制剂干粉。
3. 根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于该工艺具体包括如下步骤：
（1）用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，放入离心管中，加入适量70%乙醇溶液；
（2）漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→漩涡振荡→35rpm旋转混合器混合30min→3000rpm离心5min；
（3）吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
（4）离心管中沉淀保留，继续添加适量70%乙醇溶液→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→漩涡振荡器→旋转混合器30min→3000rpm离心5min；
（5）吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24 - 48h至干粉，待升至室温称重，封瓶 ，-20℃保存。
4. 一种权利要求1所述的天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成、提高反刍动物肉奶CLA含量中的应用，其特征在于：该天然产物制剂在每克饲料中的添加量为35-45mg。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：该天然产物制剂在使用时用DMSO稀释至35-45mg/mL。
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