CN102286375A - 一种产油微生物的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产油微生物的培养方法。具体地讲就是采用菌体增殖和油脂积累两阶段分别独立培养，将菌体增殖培养得到的产油微生物细胞接种到产油培养基中，接种量为0.04～1.0克干菌体/克碳源，在pH 3～8，25～37℃通气培养12～360小时，然后分离收集菌体，提取油脂。按本发明的方法进行微生物油脂生产，有利于实现高密度培养，提高菌体增殖和油脂积累的速度，节省时间，降低成本，并减少废水排放量，取得显著的经济效益。

Description

一种产油微生物的培养方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种产油微生物的培养方法，可以更有效地控制微生物油脂积累过程，提高底物利用效率和油脂生产强度。

技术背景

微生物油脂，又称单细胞油脂，是酵母、细菌及霉菌等在一定条件下，转化碳水化合物、甘油等有机物得到的脂类物质，其主要形式通常为甘油三酯。凡是可以在胞内油脂积累超过细胞干重20％的微生物，称为产油微生物。与油料植物生产相比，微生物转化碳水化合物生产油脂，不受场地、季节及气候变化的影响，可以实现油脂规模化连续生产。微生物油脂技术可为生物能源产业发展提供新原料，具有重要应用前景。

产油微生物油脂积累是一个高度依赖于生长环境，尤其是营养可得性的生物过程。早期研究表明，产油微生物在培养基中碳源过量而其它营养元素不足的条件下能将多余的碳源储存为胞内油脂，这些限制性营养元素包括氮、磷、锌、铁和镁等。文献中一般通过控制培养基的氮源含量，使产油酵母在氮缺乏(通常碳元素与氮元素的比率(C/N比)大于100)环境下产油(Ratledge C，Wynn JP.The biochemistry and molecular biologyof lipid accumulation in oleaginous microorganisms.Adv ApplMicrobiol.2002，51，1-52)。生物化学研究表明，产油酵母三羧酸循环关键酶异柠檬酸脱氢酶活性依赖胞内腺苷酸。在氮限制环境下腺苷酸被转化为肌苷酸，造成异柠檬酸脱氢酶缺少变构调节因子而活性降低。因此，三羧酸循环受抑制，菌体增殖减缓，碳代谢转向脂肪酸合成，并在胞内积累油脂。基于氮限制策略的油脂发酵研究已取得了重要进展。例如在初始C/N比为315的培养基中产油红酵母Rhodosporidium toruloides Y4细胞内油脂含量可达67％(李永红，刘波，赵宗保，白凤武.圆红冬孢酵母菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究.生物工程学报，2006，22，650-656)。在高糖低氮条件下培养产油霉菌Mortierella isabellina，当C/N比于150到340之间变化时，菌体油脂含量在50％以上(Papanikolaou S，Komaitis M，Aggelis G.Single cell oil production by Mortierellaisabellina grown on high-sugar content media.Bioresour Technol，2004，95，287-291)。早期文献表明也有通过磷限制刺激产油酵母积累油脂的报道。培养基含30g/l葡萄糖和0.05g/l KH₂PO₄(初始C/P比为2720)时，连续培养Candida 107可得到油脂含量为36wt％的菌体(Gill CO，HallMJ，Ratledge C.Lipid accumulation in an oleaginous yeast(Candida107)growing on glucose in single-stage cont inuous culture.ApplEnviron Microbiol，1977，33，231-239)。而在初始C/P比为637的培养基中Rhodotorula glutinis可积累油脂达到20wt％以上(Granger LM，PerlotP，Goma G，Pareilleux A.Effect of various nutrient limitations onfatty acid product ion by Rhodotorula glutinis.Appl MicrobiolBiotechnol，1993，38，784-789)。

大量文献表明，产油微生物的油脂积累和菌体增殖关联，即油脂生产具有部分生长耦联的特征。部分生长耦联的微生物过程通常需要有效兼顾菌体生长和产物积累，发酵过程优化难度大。目前报道的微生物油脂生产方法有批式发酵、批式补料发酵、连续发酵、部分细胞循环的连续发酵和两阶段连续发酵。以乳清滤液为原料，通过添加氯化铵调节C/N在32～40之间，进行有部分细胞循环的连续发酵，可以利用低浓度底物直接进行发酵，油脂生成速率达到0.995g/L·h，干菌体油脂含量为33wt％，油脂得率系数为0.17g油/g糖(Ykema A，Verbree EC，Kater MM，Smit H.Optimizationof lipid production in the oleaginous yeast Apiotrichum curvaturein wheypermeate.Appl Microbiol Biotechnol.1988，29，211-218)。利用甘油为底物，批式补料培养产油酵母Cryptococcus curvatus，过程底物利用度高，工艺简单，发酵密度达到118g/L，干菌体油脂含量25wt％，油脂生成速率0.59g/L·h(Meesters PAEP，Huijberts GNM，Eggink G.High-cell-density cultivation of the lipid accumulating yeastCryptococcus curvatus using glycerol as a carbon source.ApplMicrobiol Biotechnol.1996，45，575-579)。以葡萄糖为碳源，限氮培养条件下批式补料培养产油酵母R.toruloides Y4，发酵密度达到106g/L，干菌体油脂含量67wt％，油脂生成速率0.54g/L·h(Li YH，Zhao ZB，BaiFW.High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidiumtoruloides Y4 in fed-batch culture.Enzyme Microb Technol.2007，41，312-317)。

文献报道了两阶段连续培养产油酵母Candida 107的方法(Hall MJ，Ratledge C.Lipid accumulation in an oleaginous yeast Candida 107growing on glucose under various conditions in a one-and two-stagecontinuous culture.Appl Environ Microbiol.1977，33，577-584)。该过程的特征是菌体增殖阶段获得的含菌醪液直接按37.5％(v/v)的比例接种到含有30g/L葡萄糖的溶液中，进行第二阶段培养，以实现油脂积累。培养结束后菌体油脂含量为28％，油脂得率系数为0.14g油/g糖。由于菌体增殖阶段的培养物中含有较丰富的营养成份，上述操作方法将部分营养成份及发酵代谢物带入第二阶段培养体系，不利于菌体高效积累油脂。另外，菌体增殖阶段的醪液全部带入油脂积累阶段，导致发酵液体积过大，底物被稀释，最终产物浓度低。在限制氮源和铁离子条件下批式培养产油酵母Cryptococcus curvatus，菌体油脂含量为22.5％，脂肪得率系数0.12g/g；批式补料培养时油脂含量达到50％，脂肪得率系数0.15g/g(Hassan M，Blanc PJ，Granger LM，Pareilleux A，Goma G.Influence of nitrogenand iron limitations on lipid production by Cryptococcus curvatusgrown in batch and fed-batch culture.Process Biochem.1996，31，355-361)。

上述这些产油微生物培养过程的共同特点是：菌体增殖阶段和油脂积累阶段没有分离，即使在培养后期甚至终点，培养体系中仍然存在一定量的营养元素维持菌体缓慢增殖，底物代谢途径复杂。为了兼顾菌体增殖和油脂积累对培养基成份的不同要求，实际应用的培养基对菌体增殖和油脂积累都不是最优培养基。因此，产物浓度、油脂得率系数和生产强度等技术指标偏低，微生物油脂生产的技术经济性差。

因此，需要一种新的产油微生物培养方法，以进一步提高微生物油脂生产的技术指标，降低成本，改善过程的技术经济性。

发明内容

针对油脂发酵产物浓度、油脂得率系数和生产强度等技术指标偏低的问题，本发明人认真研究了现有产油微生物的培养方法，发现存在菌体增殖阶段和油脂积累阶段没有分离的共同特点。为了兼顾菌体增殖和油脂积累对培养基成份的不同要求，实际应用的培养基对菌体增殖和油脂积累都不是最优培养基，这可能是导致微生物油脂生产技术经济性差的重要原因之一。

因此，本发明人进行了大量的科学研究和创造性的工作，设计出一种新的产油微生物培养策略，即菌体增殖和油脂积累两阶段独立培养的微生物油脂生产技术。通过收集菌体增殖阶段得到的微生物细胞，接种到产油培养基中，通气培养进行油脂生产。通过调节产油培养基组成，使细胞在产油培养基增殖受阻，但可以高效合成油脂。本发明简单易行，可提高油脂生产强度和底物转化率，减少废水排放，降低原料成本，改善微生物油脂发酵的技术经济性。

本发明通过下述技术方案予以实现：

1、制备产油培养基，通过下述方法的一种或它们的必要组合方法实现：

A.控制氮源使用量，获得C/N比大于800的培养基，此方法适用于碳源中不含氮源的情况；或，

B.控制磷源使用量，获得C/P比大于3000的培养基，此方法适用于碳源中不含磷源的情况；或，

C.使用氮源清除剂，降低氮源含量，获得C/N比大于800的培养基，此方法适用于发酵原料同时含有碳源和磷源的情况；或，

D.使用磷源清除剂，降低磷源含量，获得C/P比大于3000的培养基，此方法适用于发酵原料同时含有碳源和磷源的情况。

2、菌体增殖培养及细胞收集：采用营养相对丰富的培养基，在25～37℃，pH 4.5～7.5，通气培养产油微生物，实现菌体快速增殖。培养结束后，采用离心分离或过滤的方法收集产油微生物细胞。

3、油脂积累培养：向产油培养基中按0.04～1.0克干菌体/克碳源的用量接种菌体增殖阶段获得的产油微生物细胞，在25～37℃，pH 3.0～8.0，通气培养，当培养基中碳源含量低于5g/L时，终止培养。

4、微生物油脂的提取：本发明参考文献(Li YH，Zhao ZB，Bai FW.High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidiumtoruloides Y4 in fed-batch culture.Enzyme Microb Technol.2007，41，312-317)的方法，在发酵结束后，经离心、洗涤，收集菌体沉淀。菌体在105℃干燥至恒重，即得干菌体。参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.四种真菌油脂提取方法的比较研究.微生物学通报，2001，28(6)，72-75)使用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，计算菌体油脂含量。

本发明使用产油微生物是指发酵培养后在胞内积累油脂超过其生物总量20％(w/w)的真核或原核微生物。它们包括但不限于，产油细菌，如Arthrobacter属、Rhodococcus属或Mycobacterium属等；产油酵母菌，如Candida属、Cryptococcus属、Hansenula属、Lipomyces属、Rhodosporidium属、Rhodotorula属、Endomyces属、Schwanniomye属、Trichosporon属、Sporobolomyces属，Trigonopsis属或Yarrowia属等；产油霉菌，如Mortierella属、Cunninghamella属、Mucor属或Aspergillus属等；产油微藻，如Crypthecodinium属、Botryococcus属、Chlorella属、Nannochloropsis属、Haliphthoros属或Schizochytrium属等。这些菌株可以直接从包括中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)以及中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。

本发明在菌体增殖阶段使用营养丰富、有利于菌体快速增殖的培养基。菌体增殖阶段的培养基可以是常用的酵母培养基，如YEPD培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)；可以在YEPD培养基上进一步优化，如增加碳源浓度或添加其它必要的微量元素；还可以是利用成份复杂的碳源原料制成的培养基。

本发明在菌体增殖阶段后期，采用离心或膜过滤的方法实现从发酵醪液中分离收集产油微生物细胞。发酵醪液在800g以上的离心力作用下离心，得到菌体，用于接种产油培养基；发酵醪液也可以应用孔径小于5um的膜过滤，得到菌体，用于接种产油培养基。

本发明用于制备产油培养基的碳源为单糖、寡糖、多糖、甘油以及必要的组合，它们包括但不限于，葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、糖蜜、乳清、纤维二糖、淀粉、甘油以及天然有机质或工农业副产品的水解产物，其中天然有机质或工农业副产品包括但不限于，玉米、小麦、水稻、甘薯、木薯、菊芋、土豆、蔗渣、农作物秸秆及淀粉废水。

为了利用同时含有碳源和氮源的原料生产油脂，本发明按照文献采用化学沉淀法、三氯乙酸沉淀法、鞣酸沉淀法和Sevag法等方法清除原料中的氮源，获得C/N比大于800的培养基，用于接种产油微生物细胞。具体参考文献如下：1.李柱，杜国勇，钟磊.化学沉淀法去除废水中氨氮实验研究.天然气化工.2009，(34)，24-26；2.余华.海带多糖中蛋白质去除方法的对比研究.成都大学学报(自然科学版).2005，24(4)，265-268。

为了利用同时含有碳源和磷源的原料生产油脂，本发明按照文献采用化学沉淀法清除原料中的磷源，获得C/P比大于3000的培养基，用于接种产油微生物细胞。具体参考文献如下：1.汤琪.磷酸铵镁技术中不同沉淀剂脱氮除磷效果比较.重庆交通大学学报，2008，27(1)，148-151；2.黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105；3.徐建宇，宫宇周，潘明富.几种混凝剂深度除磷性能的对比研究.广西轻工业，2009，(1)，89-91。

本发明所述的磷源为磷酸盐及经水解可释放出磷酸根的物质。

本发明所述的氮源为铵盐及经在水溶液中可释放形成铵离子的物质。

本发明的有益效果是：与现有的微生物油脂生产方法相比，本发明采用菌体增殖和油脂积累两阶段分别独立培养，并且在油脂积累阶段按底物浓度设计加入定量的产油微生物细胞。其生产工艺简单，易于规模化生产，发酵所得的微生物油脂含量和得率系数高。由于菌体增殖阶段的发酵醪液被去除，菌体增殖阶段产生的副产物很少带入到产油培养基中，有利于油脂发酵下游的菌体分离、油脂提取和废水处理等操作。本发明对底物的浓度要求低，不需要对低浓度碳源进一步浓缩，在一些含有磷和氮的有机质中可以通过简单的方法去除磷或氮，然后直接应用于生产，节约了生产成本和能耗。

附图说明

图1为菌体增殖和油脂积累两阶段独立培养的油脂生产流程简图。

具体实施方式

以下实施例选取了一些典型的制备过程(如图1所示)，说明应用菌体增殖和油脂积累两阶段分别独立培养的技术转化碳源制备微生物油脂，这将有助于了解本专利，但不以任何形式限制其它产油菌株在其它碳源上应用本发明。

实施例1

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖27，pH 4.5。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：培养基组成(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 5.5。培养基450mL于121℃灭菌15min后，接入50mL Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，30℃通气培养35小时，将培养液于6000转/分钟离心10分钟，得到湿菌体。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取2.86×10⁹个菌(干菌体0.18g)接种至50mL步骤(1)所述已灭菌的产油培养基中，在30℃下通空气培养48小时。

(4)油脂的提取：步骤(3)所得发酵液离心，收集菌体，在105℃下烘干至恒重，确定干菌体含量为10.6g/L。按文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.四种真菌油脂提取方法的比较研究.微生物学通报，2001，28(6)，72-75)使用酸热-有机溶剂法提取油脂，确定油脂含量为66.0％，残糖含量为1g/L。经计算，在油脂积累阶段油脂得率系数为0.26g油/g糖。

实施例2

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖135，pH 4.5。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：同实施例1，所用菌株为Rhodotorula glutinis AS 2.499(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取5.73×10⁹个菌(干菌体0.36g)接种至50mL步骤(1)所述的产油培养基，在25℃下通空气培养96小时。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为42.4g/L，油脂含量为81.0％，残糖含量为3g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.26g油/g糖。

实施例3

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖27，pH 4.5。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：培养基组成(g/L)：葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH 5.5。培养基450mL于121℃灭菌15min后，接入50mL Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，30℃通气培养35小时，将培养液于6000转/分钟离心10分钟，得到湿菌体。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取0.95×10¹⁰个菌(干菌体0.59g)接种至50mL步骤(1)所述的产油培养基，在37℃下通空气培养24小时。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为17.0g/L，油脂含量为30.0％，残糖含量为0.2g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.19g油/g糖。

实施例4

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖270，pH 4.4。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：培养基组成(g/L)：葡萄糖20，酵母10，蛋白胨10，七水硫酸镁0.3，pH 5.5。培养基450mL于121℃灭菌15min后，接入50mL Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自美国典型培养物保藏中心)种子液，30℃通气培养35小时，将培养液于6000转/分钟离心10分钟，得到湿菌体。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取1.15×10¹⁰个菌(干菌体0.71g)接种至50mL步骤(1)所述的产油培养基，在30℃下通空气培养240小时。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为79.0g/L，油脂含量为81.8％，残糖含量为0.8g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.24g油/g糖。

实施例5

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖270，pH 4.6。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：同实施例1，所用菌株为Lipomyces starkeyi AS 2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取1.29×10¹¹个菌(干菌体7.9g)接种至50mL步骤(1)所述的产油培养基，在37℃下通空气培养95小时。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为218.0g/L，油脂含量为27.1％，残糖含量为1.4g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.22g油/g糖。

实施例6

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖135，pH 4.4。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：同实施例1，所用菌株为Lipomyces kononenkoae CICC 1714(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取5.70×10¹⁰个菌(干菌体3.5g)接种至50mL步骤(1)所述的产油培养基，在30℃下通空气培养95小时。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为102.6g/L，油脂含量为31.4％，残糖含量为0.8g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.24g油/g糖。

实施例7

(1)淀粉的液化：将淀粉调节成质量浓度30％的淀粉乳，按文献(林松毅，邵淑娟，赵宇星，等.响应面法优化玉米淀粉液化工艺的研究.食品与机械，2009(25)，14-19)使用耐高温α-淀粉酶进行液化。

(2)淀粉的糖化：将液化后的料液按文献(衣海龙，郭德军，刘文芝，等.响应面法优化玉米淀粉糖化条件的研究.食品工业科技.2009(30)，206-208)使用真菌淀粉酶和普鲁兰梅进行糖化，所得糖化液pH 4.3，糖含量40g/L。

(3)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：同实施例1，所用菌种为Rhodotorula minuta AS 2.277(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。

(4)油脂积累阶段培养：将步骤(3)所得的菌体取4.11×10⁹个菌(干菌体0.26g)接种至50mL步骤(2)所得的产油培养基中，在30℃下通空气培养60小时。

(5)油脂的提取：将步骤(4)所得发酵液按实施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌体含量为14.4g/L，油脂含量为63.7％，残糖含量为0.2g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.23g油/g糖。

实施例8

(1)菊芋粉的制备：将秋天收获的菊芋切片干燥(含水量约8％)，然后粉碎过100目筛，得菊芋粉。

(2)将所得的菊芋粉调节成质量浓度10％的粉浆，并用2M的硫酸调节到pH 3.5，然后将其在121℃下保温30min，冷却。

(3)将所得的菊芋粉水解液按文献(余华.海带多糖中蛋白质去除方法的对比研究.成都大学学报(自然科学版).2005，24(4)，265-268)的方法去除氮源，碳元素与氮元素摩尔比率为832，然后将其调节至pH 5.5，糖含量67g/L。

(4)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：同实施例1

(5)油脂积累阶段培养：将步骤(4)所得的菌体取8.72×10⁹个菌(干菌体0.54g)接种至50mL步骤(3)所得的产油培养基中，在30℃下通空气培养96小时。

(6)油脂的提取：将步骤(5)所得发酵液按实施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌体含量为27.6g/L，油脂含量为60.6％，残糖含量为0.1g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.25g油/g糖。

实施例9

(1)油脂积累培养基：将制糖工业副产物糖蜜按文献(汤琪.磷酸铵镁技术中不同沉淀剂脱氮除磷效果比较.重庆交通大学学报，2008，27(1)，148-151)的方法去除磷源，碳元素与磷元素摩尔比率为3180。然后将其调节至pH 4.5，糖浓度在100g/L。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：同实施例1，所用菌种为Lipomyces starkeyi AS 2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取1.29×10¹⁰个菌(干菌体0.80g)接种至50mL步骤(1)所得的产油培养基中，在30℃下通空气培养144小时。

(4)油脂的提取：将步骤(3)所得发酵液按实施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌体含量为39.4g/L，油脂含量为59.4％，残糖含量为2.4g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.24g油/g糖。

实施例10

(1)油脂积累培养基：将乳酪工业的副产物乳清按文献(黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105)的方法去除磷源，碳元素与磷元素摩尔比率为3159，调节浓度至30g/L，pH 5.2

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：同实施例1，所用菌种为cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型培养物保藏中心)。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取4.43×10⁹个菌(干菌体0.27g)接种至50mL步骤(1)所得的产油培养基中，在30℃下通空气培养96小时。

(4)油脂的提取：将步骤(3)所得发酵液按实施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌体含量为13.0g/L，油脂含量为58.5％，残糖含量为3.0g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.28g油/g糖。

实施例11

步骤(2)采用膜浓缩过滤，将得到菌体接种到产油培养基中(干菌体3.5g)，接种后D₆₀₀＝110。其他条件均同实施例6，干菌体含量为102.8g/L，油脂含量为31.3％，残糖含量为0.8g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.24g油/g糖。

实施例12

步骤(1)油脂积累培养基pH值用硫酸调节到3.0。其他条件均同实施例1，培养72小时后，干菌体含量为8.6g/L，油脂含量为58.1％，残糖含量为2.0g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.20g油/g糖。

实施例13

步骤(1)油脂积累培养基pH值用NaOH调节到8.0。其他条件均同实施例1，培养84小时后，干菌体含量为8.8g/L，油脂含量为57.8％，残糖含量为1.6g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.20g油/g糖。

实施例14

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖90，pH 4.5

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：培养基组成(g/L)：葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨10，pH 5.5。培养基1800mL于121℃灭菌15min后，接入200mL Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养18h，将培养液于6000转/分钟离心10分钟，得到湿菌体。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取2.29×10¹¹个菌(干菌体14.2g)接种至1900mL步骤(1)所述的产油培养基。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养20h。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为30.9g/L，油脂含量为77.6％，残糖含量为1.2g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.27g油/g糖，生产强度为1.20g/L h。

实施例15

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖30，pH 4.5

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：培养基组成(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 5.5。培养基1800mL于121℃灭菌15min后，接入200mL Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养18h，将培养液于6000转/分钟离心10分钟，得到湿菌体。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取3.48×10¹⁰个菌(干菌体2.2g)接种至1900mL步骤(1)所述的产油培养基。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养10h。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为10.2g/L，油脂含量为88.1％，残糖含量为0.1g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.30g油/g糖，生产强度为0.90g/L h。

实施例16

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖50，pH 4.5

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：培养基组成(g/L)：葡萄糖40，酵母粉20，蛋白胨20，pH 5.5。培养基1800mL于121℃灭菌15min后，接入200mL Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养18h，将培养液于6000转/分钟离心10分钟，得到湿菌体。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取1.03×10¹³个菌(干菌体90.0g)接种至1900mL步骤(1)所述的产油培养基。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养8h。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为57.0g/L，油脂含量为25.3％，残糖含量为0.25g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.29g油/g糖，生产强度为1.80g/L h。

实施例17

(1)油脂积累培养基(g/L)：葡萄糖120，pH 4.5。

(2)菌体增殖阶段培养及菌体细胞收集：培养基组成(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，pH 5.5。培养基9000mL于121℃灭菌15min后，接入1000mL Lipomyces starkeyi AS 2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养30h，将培养液于6000转/分钟离心10分钟，得到湿菌体。

(3)油脂积累阶段培养：将步骤(2)所得的菌体取3.39×10¹¹个菌(干菌体21.1g)接种至3500mL步骤(1)所述的产油培养基中(接种后体积约4000mL)。在pH 5.6，30℃，通空气量1.0vvm，搅拌500rpm条件下培养16h，培养基中的残糖小于0.9g/L，补加480g葡萄糖(未灭菌)，45小时后终止培养。

(4)油脂的提取：同实施例1，所得干菌体含量为104.6g/L，油脂含量为64.2％，残糖含量为0.2g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.28g油/g糖，生产强度为1.49g/L h。

实施例18

步骤(3)油脂积累培养基未经过灭菌，直接利用。其他条件均同实施例1，培养18小时后，干菌体含量为11.4g/L，油脂含量为68.4％，残糖含量为0.2g/L，油脂积累阶段油脂得率系数为0.29g油/g糖。

本发明优势综合评述

本发明将菌体增殖和油脂积累两部分进行解偶联，采用两阶段的培养方法，便于实现高密度培养，油脂积累阶段的得率系数和生产强度可分别达到0.30g油/g糖和1.80g/L h，较常规培养模式可分别提高20％和80％以上，降低了生产成本，并减少废水排放量。在油脂积累阶段培养中，可对含有氮元素和磷元素的底物通过化学或物理的方法去除氮元素和磷元素，使底物中的碳流向油脂合成，提高油脂得率。采用两阶段的培养方法，菌体增殖和油脂积累可分别实现最优化，节省时间，经济效益显著。

Claims (6)

1.一种产油微生物的培养方法，其特征在于：培养过程包括菌体增殖和油脂积累两个独立的阶段，菌体增殖培养结束后，收集产油微生物细胞，将菌体增殖阶段获得的产油微生物细胞按0.04～1.0克干菌体/克碳源的用量接种到产油培养基中，进行油脂积累阶段的培养。

2.按照权利要求1所述产油微生物的培养方法，其特征在于：所述的产油培养基的碳源为单糖、寡糖、多糖以及甘油中的一种或几种的混合。

3.按照权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：所述产油培养基的碳元素与氮元素的摩尔比率大于800或碳元素与磷元素的摩尔比率大于3000。

4.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述的产油微生物细胞在菌体增殖阶段结束后，采用离心分离或过滤浓缩技术予以收集，用于接种产油培养基。

5.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述产油微生物为在胞内积累油脂超过其生物总量20％(w/w)的真核或原核微生物。

6.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：产油微生物培养条件为：通气培养，温度25～37℃，pH 3～8，转速40～800rpm。

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