WO2021251508A1 - 주류 생산 부산물 추출물의 추출방법 및 상기 방법에 의한 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 및 항노화용 조성물 - Google Patents

주류 생산 부산물 추출물의 추출방법 및 상기 방법에 의한 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 및 항노화용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting a by-product of liquor production and a composition for whitening, wrinkle improvement and anti-aging comprising the extract by the method. Specifically, it relates to a method of extracting by-products produced after alcoholic beverage production after fermentation and a composition for whitening, wrinkle improvement and anti-aging comprising the extract extracted by the method.
  • Alcohol is divided into fermented liquor, distilled liquor, and other liquor (hybrid liquor) according to the manufacturing method.
  • Fermented liquor is an alcoholic beverage made by fermenting sugar or starch in fruits, grains, and other raw materials by the action of mold and yeast. This alcohol has a relatively low alcohol content and has a unique aroma and soft taste from the ingredients.
  • Distilled liquor is a liquor obtained by distilling fermented liquor or malt, and has a relatively high alcohol concentration, and some or most of the impurities can be removed depending on the distillation method.
  • diluted soju which is consumed a lot in Korea, is made from spirits that have almost removed impurities, and includes brandy, whiskey, vodka, rum, and tequila.
  • Other liquor (hybrid liquor) is an alcoholic beverage made by leaching or distilling brewed or distilled liquor with fruits, spices, sweeteners, and medicinal herbs.
  • Alcohol consumption in Korea is very high, and various types of alcoholic beverages are produced and sold.
  • Registration Patent Publication No. 10-0737862 functional organic fertilizer containing lees, a by-product of alcoholic beverage production, and a novel Bacillus sp. strain
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2010-0103751 Fermentation of tomato fermented wine and liquid feed manufacturing method using fermentation by-products
  • Patent Publication No. 10-1438587 Methodhod for manufacturing distilled spirits byproduct of wine
  • Patent Publication No. 10-1438587 Methodhod for manufacturing wine by-product makgeolli and manufactured accordingly) makgeolli
  • Korean Patent Publication No. 10-1763358 medium composition and manufacturing method using makgeolli or its by-products
  • the present invention is to provide a method for manufacturing a high-functional raw material using the by-product for the development of a high value-added industry using the by-product generated during the production of alcoholic beverages, and a composition prepared by the manufacturing method.
  • an object of the present invention is to provide a method for extracting an extract by fermenting a by-product of alcoholic beverages, and a composition for whitening, wrinkle improvement and anti-aging comprising the extract by the method.
  • It provides a method of extracting an extract of a by-product of alcoholic beverages comprising a.
  • composition for whitening, wrinkle improvement and anti-aging comprising the extract prepared by the extraction method.
  • the by-products generated during the production of alcoholic beverages in the present invention are concepts including seeds, stems, skins, etc. in addition to fruits, which are raw materials of the alcoholic beverage, and the form of the by-products is not limited, but may be in solid form or solid content.
  • the alcoholic beverage includes fermented liquor, distilled liquor, and other liquors (hybrid liquor), and may preferably be fermented liquor.
  • the fermented liquor refers to alcohol made by fermenting sugar or starch in fruits, grains, and other raw materials by the action of mold and yeast, and includes wine, beer, makgeolli, yakju, and Cheongju, but is limited thereto no.
  • Fruits that may be raw materials for the alcoholic beverage may include, but are not limited to, apples, grapes, strawberries, bokbunja, plums, lemons, and the like.
  • the grains may include, but are not limited to, wheat, rice, brown rice, barley, malt, and the like.
  • the drying step of (1) may be dried at 15 to 35 °C, preferably at 20 to 30 °C.
  • the drying time may be 12 to 60 hours, preferably 24 to 48 hours. If it is less than the drying time, a large amount of impurities may be included during extraction, and if the drying time is exceeded, moisture loss may increase and the active ingredient may not be extracted.
  • the particle size of the by-product may be crushed to a particle size of 0.1 to 3 mm or less, preferably 0.1 to 2 mm or less.
  • the particle size is out of the above range, there is a risk that the effective ingredient in the raw material may not be sufficiently eluted or the fine particles may not be stably filtered.
  • 0.1 to 20% by weight of the total weight of the by-products may be supplemented for smooth fermentation, and the sugar may be preferably sucrose or glucose, but is not limited thereto.
  • distilled water or purified water is added to the by-product, and fermented by stationary culture or shaking culture at 25 to 50° C. for 24 to 72 hours.
  • the fermentation strain is not limited, but preferably Weissella cibaria , Issatchenkia orientalis , Saccharomyces cerevisiae , more preferably Issatchenkia orientalis. Issatchenkia orientalis , Saccharomyces cerevisiae may be added.
  • the fermentation strain is fermented in an amount of 0.005 to 3% by weight, preferably 0.01 to 2% by weight, based on the total weight including the liquor production by-products and the extraction solvent.
  • the fermentation strain may not work properly, and when fermenting with a strain more than the above range, an off-flavor may occur.
  • the extraction solvent used in the extraction step of (4) is not limited, but preferably water or 70% (v/v) ethanol can be used for extraction.
  • Water or ethanol used in the extraction can be extracted by adding 3 to 10 times the total volume of the fermented by-product, but preferably adding 5 times, and at room temperature (10 to 50° C.) for 12 to 36 hours, preferably It is usually extracted for 24 hours.
  • the by-product remaining after extracting the extract in (4) and filtering the remaining fermentation broth is pulverized (micro beads) into particles of 100 to 500 ⁇ m, preferably 200 to 400 ⁇ m to provide a composition for scrub.
  • the present invention includes the steps of (5) filtering and then concentrating the extract in the manufacturing method and (6) pulverizing the extract concentrate.
  • It provides a method for preparing an extract of liquor production by-products additionally comprising a.
  • the filtration can be changed according to conditions such as filter paper, membrane filter, centrifugation, and the like. Concentration using a vacuum rotary concentrator, can be concentrated at 45 to 65 °C, preferably at 50 to 60 °C.
  • the solids are concentrated to 5 to 60 brix°, preferably 5 brix° to 30 brix°.
  • Powdering in step (6) is possible, but not limited to both freeze-drying and spray-drying.
  • composition for whitening, wrinkle improvement and anti-aging may be a cosmetic composition or a food composition, preferably a cosmetic composition.
  • the present invention may provide a method for producing an extract by fermenting and extracting a by-product (juice solid) produced during the production of alcoholic beverages, specifically, fermented wine, such as wine, and the alcoholic beverage by-product extract prepared according to the method is whitening and wrinkle improvement Alternatively, it can be used as a material for cosmetics and the like because of its excellent anti-aging effect.
  • a by-product juice solid
  • Figure 2 shows the MTT assay measurement process for measuring cytotoxicity.
  • Figure 4 shows the process of measuring the tyrosinase inhibitory activity.
  • Figure 5 shows the results of measuring the tyrosinase inhibitory activity of the present invention.
  • Figure 6 shows the process of measuring the inhibition of melanin production.
  • Figures 8a and 8b show the results of the evaluation of the reactive oxygen species inhibitory effect on B16F10 melanocytes and CCRF S-180II fibroblasts of the present invention.
  • 9a and 9b show the wrinkle improvement effect through the expression level of MMP1 and MMP8 of the present invention.
  • wine juice solids which are by-products of wine production, were used.
  • the by-product was dried at 15 to 35° C. for 24 to 48 hours, and the dried by-product was crushed to a particle size of 2 mm or less. Thereafter, using sucrose or glucose, 10% by weight of the total weight of the by-product was saccharified.
  • Example 1 is a Weissella cibaria strain
  • Example 2 is an Issatchenkia orientalis strain
  • Example 3 is a Saccharomyces cerevisiae ( Saccharomyces cerevisiae ) strain processed. Fermentation was carried out by adding distilled water 10 times the volume of the by-product and culturing at 25 to 40° C. for 24 to 72 hours with static or shaking.
  • the amount of strain used here was 0.02% by weight of the total weight including by-products and water.
  • Comparative Example 1 is a normal group without any treatment
  • Comparative Example 2 is a negative control group treated with a stimulant
  • Comparative Example 3 is a normal group treated with grape extract. Distilled water 5 times the volume of the by-product was added to the fermented by-product, and the extraction process was performed at room temperature for 24 hours to obtain an extract.
  • KCLB Korea Cell Line Bank
  • FBS fetal bovine serum, gibco, USA
  • sodium bicarbonate Sigma, USA
  • Penicilin. Eagle Medium, gibco, USA was used and cultured in an incubator under 37° C., 5% CO 2 conditions, and the incubation process is shown in FIG. 1 .
  • Examples 1 to 3 and Comparative Example 3 were treated at concentrations of 400, 500, and 800 ppm, respectively. Thereafter, 70% (v/v) ethanol of 5 times the volume of the fermented wine juice solids was added, extracted for 24 hours at room temperature, and measured by MTT assay, and the specific method is as follows.
  • Mouse melanoma B16F10 cells were aliquoted in a 96-well plate using DMEM medium containing 10% FBS so as to become 5 ⁇ 10 3 cells/well, and incubated in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 condition. After culturing for 24 hours for cell adhesion, 150 ⁇ L of each diluted sample with a medium supplemented with 5% FBS was treated and exchanged, and 2nM ⁇ -MSH stimulator was given after 3 hours. After 72 hours of incubation, 7.5 ⁇ L of MTT reagent of 5 mg/mL was treated in each well, the medium was removed after 3 hours, and 100 ⁇ L of DMSO was added to measure absorbance at 570/630 nm (FIG. 2). Cytotoxicity is shown in Figure 3 compared to the percentage compared to the control.
  • Comparative Examples 2, 1 to 3, and Comparative Examples 1 and 2 were treated with 400 and 800 ppm, respectively, to measure tyrosinase inhibitory activity, and the specific method is as follows.
  • mice melanoma B16F10 cells were dispensed in a 96-well plate using a medium containing 10% FBS to make 5 ⁇ 10 3 cells per well, and incubated at 37°C, 5% CO 2 in an incubator. Incubated for 24 hours.
  • Solution A (2% N,N-dimethyl formamide in 100 mM sodium phosphate), Solution B (5 mM L-DOPA in 100 mM sodium phosphate), and Solution C (20 mM MBTH in H2O) were mixed 2:1: 140 ⁇ L of mix buffer mixed at a ratio of 1 was treated and reacted per well, and absorbance was measured at 505 nm, and the results are shown in Table 2 and FIG. 5 below.
  • Comparative Example 1 Comparative Example 2
  • Example 1 Example 2
  • Example 3 fermented strain - (normal group) Negative control group (stimulant treatment) Weissella cibaria Issatchenkia orientalis Saccharomyces cerevisiae Treatment concentration (ppm) - 400 800 400 800 400 800 400 800 Tyrosinase activity (%) 100 576 638 609 640 281 225 468 399
  • Example 2 was treated at a concentration of 800 ppm
  • Comparative Example 2 was treated with the same concentration, the tyrosinase activity was inhibited and measured at about 1/3 level, it was possible to confirm the remarkable tyrosinase inhibitory activity of the present invention.
  • mouse melanoma B16F10 cells were aliquoted to 1 ⁇ 10 5 cells in a 6 well plate, and incubated at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. After removing the culture medium, 2 mL of the medium in which Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 were added at 40 ppm and 80 ppm, respectively, was added and cultured for 3 hours, then treated with a 2nM ⁇ -MSH stimulator and cultured for 3 days, The process is shown in FIG. 6 .
  • the culture medium was removed, washed with PBS, scrapped and centrifuged at 4° C., 14000 rpm for 20 minutes. 50 ⁇ L of 1N NaOH solution was added to the pellet, reacted at 60° C. for 1 hour, and absorbance was measured at 405 nm. The measurement results are shown in FIG. 7 .
  • Comparative Example 2 produced 126% of melanin compared to Comparative Example 1
  • Comparative Example 3 produced about 120% of melanin when treated with 40 ppm, about 130% compared to Comparative Example 1, and treated with 80 ppm.
  • Examples 1 to 3 showed a lower melanin production rate than Comparative Examples 1 to 3, and in particular, when Example 2 was treated with 40 ppm, it was higher than Comparative Example 1, but the melanin production rate was significantly lower than that of other Comparative Examples and Examples.
  • B16F10 melanocytes and CCRF S-180II cells were aliquoted to 1 ⁇ 10 4 cells/well in a 96 well plate, and cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. Samples diluted by concentration were treated and cultured for 12 hours, the medium was removed, washed with PBS, treated with 10 ⁇ M DCFDA solution, and incubated for 30 minutes.
  • the cells were treated with 1 mM H 2 O 2 and cultured for 3 hours, and the degree of intracellular ROS generation was measured using a fluorescence analyzer (Excitation 485 nm/Emission 530 nm).
  • Comparative Examples 1 to 3 and Examples 1 to 3 were treated at a concentration of 200, 400 ppm, or 400, 800 ppm, respectively, and the experiment was conducted.
  • Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 were treated at a concentration of 400 ppm, respectively, and the expression levels of MMP1 and MMP8 were measured to measure the synthesis inhibitory effect.
  • MMP1 and MMP8 are a kind of matrix metalloproteinase (MMP) known to act on skin aging by decomposing collagen with collagenase, and specific experimental methods for this are as follows.
  • CCRF S-180II cells Dispense CCRF S-180II cells to 1 ⁇ 10 5 cells/well in a 6- well plate, and incubate for 24 hours at 37°C, 5% CO 2 incubator. Samples diluted by concentration were treated and cultured for 12 hours, followed by treatment with 1 mM H 2 O 2 and cultured. After removing the culture medium and washing with PBS, the total RNA was isolated/extracted by treatment with 1 ml of trizol, dissolved in DEPC water, and the concentration was measured at 260 nm.
  • 10 ⁇ RT buffer, 20 mM MgCl2, 0.1MDTT, and RNaseout were added to the reaction mixture, and reacted at 42°C for 2 minutes.
  • Superscript III was added and reacted at 42°C for 50 minutes and 70°C for 15 minutes to react cDNA was synthesized.
  • RNase H was added in the same amount as superscript III to remove the remaining RNA, and the synthesized cDNA was stored at -20°C and used for PCR experiments.
  • a reaction mixture for PCR reaction was prepared by adding MQ-water, 10X PCR buffer containing 15 mM MgCl2, sense-primer, antisense-primer, 2.5 mM dNTP mixture, and Taq polymerase. After adding and mixing the reaction mixture to cDNA, it was amplified using a thermocycler. PCR products were electrophoresed on agarose gel (Mupid-2plus, Advance, Japan), and comparatively analyzed using GelDoc-It imaging system (UVP, USA) and image acquisition & analysis software (UVP, USA).
  • CCRF S-180II cells were aliquoted to 1 ⁇ 10 5 cells/well in a 6- well plate, and cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. Samples diluted by concentration were treated and cultured for 12 hours, then treated with 1 mM H 2 O 2 and incubated. After removing the culture medium, washing with PBS, scrapping, and scrapping to RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, pH 7.4, 1 mM PMSF and protease inhibitors).
  • RIPA lysis buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, pH 7.4, 1 mM PMSF and protease inhibitors.
  • the separated protein was transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane and blocked (5% skim milk in 1 ⁇ TBST) for 1 hour.
  • Primary antibody (1:1000) was added, overnight at 4°C, washed 3 times with 1 ⁇ TBST for 15 minutes, and secondary antibody (1:2000) was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • Each band was identified and confirmed by exposing the fluorescence produced by reaction with ECL solution in the dark to an X-ray film.

Abstract

주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법 및 상기 방법에 의한 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 및 항노화용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 방법에 따른 주류 생산 부산물의 추출물은 미백, 주름 개선 또는 항노화 효과가 뛰어나 화장료 등의 재료로 사용될 수 있다. {대표도} 도 7

Description

주류 생산 부산물 추출물의 추출방법 및 상기 방법에 의한 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 및 항노화용 조성물
본 발명은 주류 생산 부산물의 추출방법 및 상기 방법에 의한 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 및 항노화용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 주류 생산 후 생성되는 부산물을 발효 후 추출하는 방법 및 상기 방법에 의해 추출된 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 및 항노화용 조성물에 관한 것이다.
술은 제조방법에 따라 발효주, 증류주, 기타주(혼성주)로 나뉜다. 발효주는 과일이나 곡류 및 기타 원료에 들어 있는 당분이나 전분을 곰팡이와 효모의 작용에 의해 발효시켜 만든 술이다. 이 술은 알코올 도수가 비교적 낮고 원료성분에서 나오는 특유의 향기와 부드러운 맛이 있으며, 포도주, 맥주, 막걸리, 약주, 청주 등이 이에 해당한다. 증류주는 발효된 술 또는 술덧을 증류하여 얻는 술로, 알코올 농도가 비교적 높으며, 증류방법에 따라 불순물의 일부 또는 대부분의 제거가 가능하다. 특히 우리나라에서 많이 음용되는 희석식 소주는 불순물을 거의 제거한 주정을 원료로 제조되며 브랜디, 위스키, 보드카, 럼, 데킬라 등이 여기에 속한다. 기타주(혼성주)는 양조주나 증류주에 과실, 향료, 감미료, 약초 등을 첨가하여 침출하거나 증류하여 만든 술로 인삼주, 매실주, 오가피주, 진, 각종 칵테일주 등이 여기에 속한다.
우리나라는 주류 소비량이 매우 높은바, 여러 종류의 주류가 생산, 판매되고 있다. 그러나 주류 생산 이후 발생하는 많은 양의 부산물을 처리하기 쉽지 않은 문제가 있는 바, 주류 생산시 발생하는 부산물을 이용한 고부가가치의 산업으로의 활용 방안이 필요한 실정이다.
한편 최근 한류열풍에 의해 한국 화장품의 인기가 증가하고 있으며, 시장규모가 확대되어 가고 있는 상황이다. 그러나 화장품 기술의 선도국가인 프랑스, 미국 등의 기술장벽이 높아 이들 국가 제품의 장벽을 넘기는 쉽지 않다. 따라서 상기 국가 제품의 장벽을 뛰어넘기 위해서는 기능성 화장품 또는 이의 원료 개발 필요성이 높아지고 있다.
주류 생산 시 발생하는 부산물을 이용한 종래 기술에는 등록특허공보 제10-0737862호(주류생산부산물인 주박과 신규한 바실러스 속 균주를 함유한 기능성 유기질비료), 공개특허공보 제10-2010-0103751호(토마토 발효주의 발효 및 발효 부산물을 이용한 액상사료 제조방법), 등록특허공보 제10-1438587호(와인 부산물 증류주의 제조 방법), 등록특허공보 제10-1438587호(와인 부산물 막걸리 제조방법 및 이에 따라 제조된 막걸리) 및 등록특허공보 제10-1763358호(막걸리 또는 이의 부산물을 이용한 배지 조성물 및 제조 방법) 등이 공지되어 있으나, 주류 생산시 발생하는 부산물을 이용한 고기능성 화장품 원료로 제공할 수 있는 기술에 대한 공지는 없어 상기 기술에 대한 개발 필요성이 대두되고 있다.
{선행기술문헌}
[특허문헌]
등록특허공보 제10-0737862호
공개특허공보 제10-2010-0103751호
등록특허공보 제10-1402568호
등록특허공보 제10-1438587호
등록특허공보 제10-1763358호
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 주류 생산시 발생하는 부산물을 이용한 고부가가치 산업 발전을 위해 상기 부산물을 이용한 고기능성 원료의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 조성물을 제공하고자 한다.
따라서 본 발명은 주류 생산 부산물을 발효시켜 추출물을 추출하는 방법 및 상기 방법에 의한 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 및 항노화용 조성물을 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은
(1) 주류 생산 부산물을 건조하는 단계;
(2) 상기 (1)에서 건조된 부산물을 파쇄하는 단계;
(3) 상기 (2)에서 파쇄된 부산물의 발효 단계; 및
(4) 상기 (3)에서 발효된 부산물을 추출하는 단계;
를 포함하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 추출 방법에 의해 제조된 추출물을 포함하는 미백, 주름개선 및 항노화용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 추출 방법 중 (4)의 추출단계에서 생성되는 부산물을 마이크로 비드화시킨 스크럽용 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 주류 생산 시 발생하는 부산물은 주류의 원재료인 과실 이외에 씨, 줄기, 껍질 등을 포함하는 개념이며, 부산물의 형태는 제한되지 않으나 고체 형태 또는 고형분일 수 있다.
상기 주류는 발효주, 증류주, 기타주(혼성주)을 포함하고, 바람직하게는 발효주일 수 있다.
상기 발효주는 과일이나 곡류 및 기타 원료에 들어 있는 당분이나 전분을 곰팡이와 효모의 작용에 의해 발효시켜 만든 술을 의미하며, 포도주, 맥주, 막걸리, 약주, 청주 등을 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 주류의 원재료가 될 수 있는 과실에는 사과, 포도, 딸기, 복분자, 매실, 레몬 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 곡류는 밀, 쌀, 현미, 보리, 맥아 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (1)의 건조 단계는 15 내지 35℃에서 건조시킬 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 30℃에서 할 수 있다.
상기 온도범위보다 낮은 온도에서 건조시킬 경우, 건조 시간의 증가로 인해 원료의 산화가 발생할 우려가 있으며, 상기 온도범위보다 높은 온도에서 건조시키면 원료 내 기능성 성분인 페놀성 화합물의 열 손상을 야기할 수 있다.
또한, 건조시간은 12 내지 60시간 가능하나, 바람직하게는 24 내지 48시간 동안 할 수 있다. 상기 건조시간 미만인 경우 추출시 불순물을 다량 포함될 수 있고, 상기 건조시간을 초과하는 경우 수분 손실이 많아져 유효성분이 추출되지 않을 수 있다.
상기 (2)의 파쇄 단계에서 부산물의 입도는 0.1 내지 3mm이하로, 바람직하게는 0.1 내지 2 mm 이하의 입도로 파쇄할 수 있다.
입도가 상기 범위를 벗어나면 원료 내 효능 성분이 충분히 용출되지 못하거나 미세 입자가 안정적으로 여과되지 않을 우려가 있다.
상기 (3)의 발효 단계에서 원활한 발효 진행을 위해 부산물의 전체 중량 대비 0.1 내지 20중량%로 보당할 수 있으며, 보당은 바람직하게는 자당 또는 포도당을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 범위 미만으로 보당하는 경우 발효가 제대로 진행되지 않을 수 있고, 상기 범위를 초과하여 보당하는 경우 과발효될 위험이 있다.
보당 후, 발효 균주 투입 후 상기 부산물에 증류수(또는 정제수)를 가수하고, 25 내지 50℃에서, 24 내지 72 시간 정치 배양, 또는 진탕 배양하여 발효시킨다.
발효 균주는 제한되지 않으나, 바람직하게는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를, 더욱 바람직하게는 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 투입할 수 있다.
상기 발효 균주는 주류 생산 부산물 및 추출 용매를 포함하는 전체 중량에 대해 0.005 내지 3중량%, 바람직하게는 0.01 내지 2중량%의 양으로 발효시킨다. 상기 범위보다 적은 균주로 발효시키는 경우 발효가 제대로 되지 않을 수 있고, 상기 범위보다 많은 균주로 발효시키는 경우 이취가 발생할 수 있다.
상기 (4)의 추출 단계에서 사용되는 추출 용매는 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 물, 또는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 추출할 수 있다.
상기 추출시 사용하는 물, 또는 에탄올은 발효된 부산물의 전체 부피 대비 3 내지 10배 추가하여 추출할 수 있으나, 바람직하게는 5배 추가하며, 실온(10~50℃)에서 12 내지 36시간, 바람직하게는 24시간 동안 추출한다.
상기 (4)에서 추출물을 추출하고 남은 발효액을 여과하고 남은 부산물은 100 내지 500μm, 바람직하게는 200 내지 400μm의 입자로 분쇄(마이크로 비드(bead))화 하여 스크럽용 조성물을 제공할 수 있다
또한 본 발명은 상기 제조방법에 (5) 상기 추출물을 여과한 후 농축하는 단계 및 (6) 상기 추출 농축액을 분말화하는 단계
를 추가적으로 포함하는 주류 생산 부산물의 추출물 제조방법을 제공한다.
상기 (5)의 여과 및 농축 단계에서 상기 여과는 filter paper, membrane filter, centrifugation 등 조건에 따라 변경가능하다. 농축은 감압회전농축기를 이용하며, 45 내지 65℃에서, 바람직하게는 50 내지 60℃에서 농축할 수 있다.
고형분은 5 내지 60 brix°, 바람직하게는 5 brix° 내지 30 brix°로 농축한다.
상기 범위보다 낮은 농도로 농축하면, 내당성 균주에 의한 2차 발효가 우려되며, 상기 범위보다 고농도로 농축하면 제조과정 중 손실률이 높아지고, 불순물이 다량 포함될 우려가 있다.
상기 (6) 단계에서 분말화는 동결건조 및 분무건조 모두 가능하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 미백, 주름개선 및 항노화용 조성물은 화장료 조성물 또는 식품 조성물일 수 있고, 바람직하게는 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명은 주류, 구체적으로는 와인과 같은 발효주 제조 시 생성되는 부산물(착즙 고형물)을 발효시켜 추출하는 추출물의 제조방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법에 따라 제조된 주류 부산물 추출물은 미백, 주름 개선 또는 항노화 효과가 뛰어나 화장료 등의 재료로 사용될 수 있다.
도 1은 세포 배양 과정을 도시한 것이다.
도 2는 세포 독성을 측정하기 위한 MTT assay 측정 과정을 도시한 것이다.
도 3은 세포 독성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Tyrosinase 저해 활성 측정 과정을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 Tyrosinase 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 멜라닌 생성 저해 측정 과정을 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 멜라닌 생성 저해 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 본 발명의 B16F10 멜라닌 세포 및 CCRF S-180II 섬유아세포에 대한 활성산소 억제효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 MMP1, MMP8 발현량을 통한 주름개선 효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 3>
본 발명의 실시예에서는 와인 생산 부산물인 와인 착즙 고형물을 이용하였다. 상기 부산물을 15 내지 35℃에서 24 내지 48시간 건조시키고, 건조시킨 부산물을 2 mm 이하의 입도로 파쇄하였다. 이후 자당 또는 포도당을 이용하여 부산물의 전체 중량 대비 10중량% 보당하였다.
파쇄된 부산물에 실시예 1은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 균주, 실시예 2는 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) 균주, 실시예 3은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 처리하였다. 상기 부산물 부피의 10배 증류수를 가수하여 25 내지 40℃에서, 24 내지 72 시간 정치 배양 또는 진탕 배양하여 발효를 진행하였다.
여기서 사용된 균주의 양은 부산물과 물을 포함하는 전체 중량의 0.02중량%였다.
비교예 1은 아무런 처리하지 않은 정상군, 비교예 2는 자극제를 처리한 음성대조군, 비교예 3은 일반 포도 추출물로 처리한 것이다. 발효된 부산물에 부산물 부피 5배의 증류수를 가수하여, 실온에서 24시간 동안 추출 과정을 진행하여 추출물을 얻었다.
비교예1 비교예2 비교예 3 실시예1 실시예2 실시예3
무처리군 음성대조군(자극제 처리) 일반 포도추출물 처리 Weissella cibaria 처리 Issatchenkia orientalis 처리 Saccharomyces cerevisiae 처리
<실험예 1> 와인 발효 추출물의 세포 독성 측정
1-1. 세포 배양
세포는 mouse melanoma B16F10 cell로 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 배지는 10% FBS (fetal bovine serum, gibco, USA)와 Sodium bicarbonate(Sigma, USA), 1% Penicilin이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, gibco, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에 incubator에서 배양하였고 배양과정은 도 1에 나타내었다.
1-2. 세포 독성 측정
세포에 대한 시료의 세포 독성을 확인하기 위해 실시예 1 내지 3 및 비교예 3을 각각 400, 500, 800ppm 농도로 처리하였다. 이후 발효된 와인 착즙 고형물의 전체 부피 대비 5배 부피의 70%(v/v) 에탄올을 추가하여 실온에서 24시간 동안 추출하여 MTT assay로 측정하였고, 구체적인 방법은 다음과 같다.
Mouse melanoma B16F10 cell을 96 well plate에 5×103cells/well가 되도록 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 100μL씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에 incubator에서 배양하였다. 세포 부착을 위해 24시간 배양 후, 5% FBS가 첨가된 배지로 희석한 시료를 150μL씩 처리하여 교환해주고, 3시간 후 2nM α-MSH 자극제를 주었다. 72시간 배양 후 5 mg/mL의 MTT 시약을 각 well에 7.5μL씩 처리하고 3시간 후 배지를 제거하고 DMSO 100μL를 첨가하여 570/630nm에서 흡광도를 측정하였다(도 2). 세포 독성은 대조군에 대한 백분율로 나타내어 비교하여 도 3에 나타내었다.
실험결과, 비교예 2, 3 및 실시예　1 내지 3으로 처리한 경우 모두 정상군과 유사한 세포 독성도를 나타냈는바, 실시예 1 내지 3을 처리하여 인체에 적용할 경우, 유해하지 않을 것으로 판단된다.
<실험예 2> Tyrosinase 저해 활성 측정을 통한 미백 효과 평가
본 발명의 미백 효과를 평가하기 위해 비교예 2, 실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 2를 각각 400, 800ppm으로 처리하여 Tyrosinase 저해 활성 측정을 진행하였으며, 구체적인 방법은 하기와 같다.
Tyrosinase 저해 활성을 평가하기 위하여 Mouse melanoma B16F10 cell을 96 well plate에 각 well당 5×103 cells가 되도록 10% FBS가 포함된 배지를 사용하여 100 μL씩 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
이 후, 5% FBS가 첨가된 배지로 희석한 시료를 150 μL씩 처리하여 배지를 교환해주고, 3시간 후 2nM α-MSH 자극제 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 1% sodium deoxycholate, Triton X-100, 100 mM PMSF를 첨가한 Lysis buffer을 25 μL씩 처리하고 30분 동안 shaking 해주었다.
30분 후 Solution A (2% N,N-dimethyl formamide in 100 mM sodium phosphate)와 Solution B (5 mM L-DOPA in 100 mM sodium phosphate), Solution C (20 mM MBTH in H2O)를 2:1:1의 비율로 혼합한 mix buffer를 140μL씩 각 well당 처리하여 반응시키고, 505 nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 하기 표 2 및 도 5에 나타냈다.
비교예1 비교예2 실시예1 실시예2 실시예3
발효균주 -(정상군) 음성대조군(자극제 처리) Weissella cibaria Issatchenkia orientalis Saccharomyces cerevisiae
처리농도(ppm) - 400 800 400 800 400 800 400 800
Tyrosinase활성(%) 100 576 638 609 640 281 225 468 399
실험결과, B16F10 melanoma cell에 자극제 투여 후 본 발명의 실시예 1 내지 3을 처리한 결과, 실시예 1 내지 실시예 3에서 tyrosinase 활성이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 특히 실시예 2를 800 ppm 농도로 처리하였을 경우, 음성대조군인 비교예 2를 동일 농도로 처리하였을 때에 비해 tyrosinase 활성이 억제되어 약 1/3 수준으로 측정된 바, 본 발명의 현저한 tyrosinase 저해 활성 효과를 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 멜라닌 생성 저해 능력 측정을 통한 미백 효과 평가
Melanin 생성 저해능을 확인하기 위하여 Mouse melanoma B16F10 cell을 6well plate에 1×105 cell이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. 배양 배지를 제거하고 실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 3을 각각 40 ppm과 80 ppm으로 투입한 배지를 2mL 첨가하여 3시간 배양 후, 후 2nM α-MSH 자극제를 처리하여 3일간 배양하였고, 과정은 도 6에 나타내었다.
배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, scrapping 하여 4℃, 14000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 펠렛에 1N NaOH 용액 50 μL를 첨가하여 60℃에서 1시간 반응시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과는 도 7에 나타내었다.
실험결과, 비교예 2는 비교예 1 대비 126%의 멜라닌이 생성되었으며, 비교예 3은 40ppm으로 처리한 경우, 비교예 1 대비 약 130%, 80ppm으로 처리한 경우 약 120%의 멜라닌이 생성되었다. 실시예 1 내지 3은 비교예 1 내지 3보다 멜라닌 생성율이 낮게 나타났으며, 특히 실시예 2는 40ppm으로 처리한 경우, 비교예 1보다는 높지만 다른 비교예 및 실시예보다 멜라닌 생성율이 현저히 낮게 나타났으며, 80ppm으로 처리한 경우 비교예 1 대비 81%의 멜라닌을 생성시켜 비교예 2와 대비하여 46%, 무처리군 비교예 1과 대비하여 20% 수준으로 멜라닌 생성을 현저히 억제시키는 것으로 나타났다.
<실험예 4> 항노화 효과 평가
본 발명의 항노화 효과를 평가하기 위해 H2O2로 활성산소를 유발하고 이에 대한 생성억제효과 실험을 진행하였으며, 구체적인 실험방법은 하기와 같다.
B16F10 멜라닌 세포 및 CCRF S-180II cell을 96 well plate에 1×104 cells/well 이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 농도별로 희석한 시료를 처리하여 12시간 배양한 후, 배지를 제거하여 PBS로 세척하고 10 μM의 DCFDA 용액을 처리하여 30분간 배양하였다.
이후, 1mM H2O2를 처리하여 3시간 배양하고 형광분석기를 이용하여 세포내 ROS 생성 정도를 측정하였다(Excitation 485 nm/Emission 530 nm).
본 실험에서는 비교예 1 내지 3 및 실시예 1 내지 3을 각각 200, 400 ppm 또는, 400, 800 ppm 농도로 처리하여 실험을 실시하였다.
멜라닌 세포 및 섬유아세포에 대한 실시예의 활성산소 억제효능을 살펴본 결과, H2O2 자극에 의해 증가된 활성산소를 현저히 감소시켜 주는 것으로 나타났다(도 8a 및 도 8b).
<실험예 5> 주름개선 효과 평가
본 발명의 주름개선 효과를 평가하기 위해 실시예 1 내지 3 및 비교예 1내지 3을 각 400 ppm 농도로 처리하여 MMP1 및 MMP8의 발현량을 측정하여 합성 저해 효과를 측정하였다. MMP1와 MMP8는 collagenase로 콜라겐을 분해하여 피부 노화에 작용하는 것으로 알려진 MMP(matrix metalloproteinase)의 일종이며, 이에 대한 구체적인 실험방법은 하기와 같다.
(1) RT-PCR
CCRF S-180II cell 을 6well plate에 1×105 cells/well 이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한다. 농도별로 희석한 시료를 처리하여 12시간 배양한 후, 1mM H2O2를 처리하여 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, trizol 1ml 처리하여 total RNA를 분리/추출하고 DEPC water에 용해시켜 260nm에서 농도를 측정하였다.
추출한 total RNA는 10 mM dNTP mixture, oligo dT를 넣고 Thermo cycler(PC-320, ASTEC, Japan) 65 ℃에서 5분간 반응시켰다. 여기에 10×RT buffer, 20 mM MgCl2, 0.1MDTT, RNaseout이 첨가된 reaction mixture를 첨가하여 42℃에서 2분간 반응시키고, superscript Ⅲ를 첨가하여 42℃에서 50분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 여기에 RNase H를 superscript Ⅲ와 동량으로 첨가하여 남아있는 RNA를 제거하고, 합성된 cDNA는 -20℃에 보관하며 PCR실험에 사용하였다. PCR 반응을 위한 reaction mixture는 MQ-water, 15 mM MgCl2를 포함하는 10ⅩPCR buffer, sense-primer, antisense-primer, 2.5 mM dNTP mixture, Taq polymerase를 첨가하여 제조하였다. cDNA에 reaction mixture를 첨가하여 혼합한 후 Thermocycler 를 이용하여 증폭시켰다. PCR products는 agarose gel 상에서 전기영동(Mupid-2plus, Advance, Japan)하고, GelDoc-It imaging system(UVP, USA)와 image acquisition & analysis software(UVP, USA)를 이용해 비교 분석하였다.
(2) Western Blot
CCRF S-180II cell 을 6well plate에 1×105 cells/well 이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 농도별로 희석한 시료를 처리하여 12시간 배양한 후, 1mM H2O2를 처리하여 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, scrapping 하여 RIPA lysis buffer(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, pH 7.4, 1 mM PMSF and protease inhibitors)를 첨가한다. 세포를 lysis buffer로 용해하고 4℃, 14000 rpm에서 20분간 원심 분리하고, 이후 상등액을 BCA (bicinchoninic acid) protein assay(pierce BCA protein assay kit, Thermo)로 단백질 정량하고, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 전기영동을 통해 단백질을 분리하였다.
분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) membrane에 이전시키고, 1시간 동안 blocking(5% skim milk in 1×TBST) 하였다. Primary antibody(1:1000)를 첨가하여 4℃에서 overnight한 다음 1×TBST로 15분간 3회 washing한 후 secondary antibody(1:2000)를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 암실에서 ECL 용액으로 반응시켜 나타나는 형광을 X-ray필름에 노출시켜 각각의 band를 동정, 확인하였다.
실시예가 CCRF S-180 II 세포에서 H2O2 자극에 의한 MMP1과 MMP8 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, H2O2를 처리한 음성대조군은 물론, 시료 무처리군과 비교하여서도 MMP1와 MMP8 발현을 현저히 억제시켜 주는 것으로 나타났다(도 9a 및 도 9b).

Claims (15)

  1. (1) 주류 생산 부산물을 건조하는 단계;
    (2) 상기 (1)에서 건조된 부산물을 파쇄하는 단계;
    (3) 상기 (2)에서 파쇄된 부산물을 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 이사첸키아 오리엔탈스(Issatchenkia orientalis) 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 중 어느 하나 이상의 균주로 발효하는 단계;
    (4) 상기 (3)에서 발효된 부산물을 추출하는 단계;
    를 포함하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1)의 주류 생산 부산물은 발효주 생산 후 남은 부산물인 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (1)의 건조 단계에서 건조온도는 15 내지 35℃, 건조시간은 24 내지 48시간인 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (2)의 파쇄 단계에서 파쇄된 부산물의 입도는 0.1 내지 3mm인 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (3)의 발효 단계에서 사용되는 균주의 양은 부산물 및 추출 용매를 포함하는 전체 중량 대비 0.005 내지 3중량%인 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (3)의 발효 단계에서 부산물의 전체 중량 대비 0.1 내지 20중량% 보당하는 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (3)의 발효 단계는 25 내지 50℃에서, 24 내지 72시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (4)의 추출 단계에서 물 또는 70%(v/v) 에탄올로 추출하는 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, (4)의 단계를 거쳐 추출된 추출물을 (5) 여과한 후 농축하는 단계를 추가적으로 포함하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 여과된 추출물을 45 내지 65℃에서, 5 brix° 내지 60brix°로 농축하는 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, (6) 상기 추출 농축액을 분말화하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 주류 생산 부산물의 추출물을 추출하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 주류 생산 부산물의 추출물.
  13. 제11항의 추출물을 포함하는 미백, 주름 개선 또는 항노화용 조성물.
  14. (1) 주류 생산 부산물을 건조하는 단계;
    (2) 상기 (1)에서 건조된 부산물을 파쇄하는 단계;
    (3) 상기 (2)에서 파쇄된 부산물을 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 이사첸키아 오리엔탈스(Issatchenkia orientalis) 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 중 어느 하나 이상의 균주로 발효하는 단계;
    (4) 상기 (3)에서 발효된 부산물을 추출하는 단계;
    (5) 상기 (4) 단계에서 추출하고 남은 부산물을 100 내지 500μm의 입자로 분쇄하는 단계;
    를 포함하는 스크럽용 조성물의 제조방법.
  15. 제14항의 방법에 의해 제조된 스크럽용 조성물.
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