WO2021112299A1 - 지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스의 시간차 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물 - Google Patents

지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스의 시간차 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물 Download PDF

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WO2021112299A1
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galactomyces
time difference
culture
lichen
fermentation
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전희형
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심성보
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주식회사 네이처인랩
(주)유알지
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to fermentation by adding a complex containing at least one of lichen-derived minerals (Cu, Zn, Mg, Ca, Se, etc.) during Galactomyces fermentation.
  • a fermentation method characterized in that it has an effect on whitening by inhibiting tyrosinase activity and It relates to a cosmetic composition using the same.
  • Minerals also called minerals, are elements that make up the human body and are not decomposed unlike organic substances that are decomposed when ingested.
  • the minerals that make up the human body are potassium (K), calcium (Ca), selenium (Se), sodium (Na), iodine (I), zinc (Zn), magnesium (Mg), phosphorus (P), sulfur (S), There are chlorine (Cl), copper (Cu), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), etc., which cannot be synthesized in the body and must be consumed through food. It accounts for about 4% of the body and is involved in various functions such as bone and tooth composition, blood oxygen transport, digestion and osmotic pressure regulation.
  • the minerals are involved in various metabolic processes of the body to maintain a healthy body, but modern people often lack or excessive certain minerals and thus are unbalanced.
  • they suffer from itching of unknown causes, including atopic dermatitis, dry skin, and the like (pruritus, pruritus).
  • the atopic itch is known to be due to histamine being unnecessarily discharged from the skin due to an abnormality in the immune system, but in most cases, it is difficult to clearly identify the cause.
  • skin-related diseases occur because the skin barrier is damaged and the skin is not moisturized in time and is easily exposed to the attack of external bacteria or viruses.
  • natural minerals play a role in resolving skin troubles, and do not directly kill viruses or bacteria, but reproduce. It has a function to prevent it from doing so after a certain period of time, and it has been found to have no side effects because it is a natural method.
  • natural minerals are known to increase skin moisture by activating natural moisturizing factor (NMF) and to prevent skin irritation by activating enzymes that remove active oxygen (SOD).
  • lichens are symbiotic complexes of fungi and algae or/and cyanobacteria, and are classified into about 14,000 species worldwide. It was once proposed to use secondary metabolites of lichens as antimicrobial agents or antiherbivore agents. In addition, some lichen extracts have been used as various therapeutic agents in the folklore, and lichen metabolites have antibiotic agent, antimycobacterial, antiviral, analgesic, antipyretic properties, etc. has been shown to have a variety of biological activities. At the same time, research results show that minerals extracted from lichens have an excellent effect in preventing skin aging due to cellular ion imbalance.
  • the fermented product of the fermented strain was used to improve skin moisturizing.
  • Fermented products are known to have a function of activating natural moisturizing factor (NMF) to supply moisture to skin cells and help form a natural moisturizing barrier, so it is used as a cosmetic ingredient for moisture supply.
  • NMF natural moisturizing factor
  • galactomyces is one of the natural yeasts fermented with yeast.
  • Interest in the effectiveness and various active ingredients contained therein has increased. It started to attract attention as it was contained in the cosmetic brand SK-II products, and various vitamins such as vitamins B1, B2, pantothenic acid, B6, folic acid, carbohydrates, and various amino acids that are natural moisturizing factors that provide skin moisturizing, whitening, pores and soothing effects and rich in various minerals.
  • the anti-aging effect of nucleic acid which contains more than 7 times that of sardines, is known, and Kojic acid, known as a representative whitening ingredient, was first known in the early 1900s in the process of fermenting steamed rice (koji) with yeast.
  • various natural enzymes such as saccharification enzymes and proteases produced during the fermentation process are known to have antioxidant, anti-aging, whitening, and skin moisturizing effects by increasing the production and absorption of active substances.
  • arbutin is a natural vegetable ingredient and has a structure with hydroquinone, known as a safe whitening ingredient. It has the advantage of not having side effects because it is very similar, but the efficacy is very low, and in particular, as it changes from lipophilic to hydrophilic, it changes into a structure that is very difficult to penetrate into the skin, so it is difficult to penetrate even melanocytes located deep in the skin.
  • the present inventors have made continuous efforts to develop a method for extracting an active substance having a whitening effect of natural ingredients and a cosmetic composition using the same, and as a result, a method for fermenting galactomyces with lichen-derived minerals added with a time difference and a cosmetic composition using the same
  • a whitening effect by inhibiting the activity of Tyrosinase, an enzyme that produces melanin by various minerals and kojic acid. was completed.
  • tyrosinase an enzyme that produces melanin pigments
  • melanin pigments in particular, that causes spots and freckles in addition to moisturizing, mineral balance control, and inflammation relief effects on skin cells
  • the present invention provides a method for time-difference fermentation of galactomyces containing lichen-derived minerals.
  • step of culturing the inoculum in the medium S210; Inoculating the galactomyces (galactomuces) in the culture medium of the inoculum to the primary culture step (S220); adding lichen-derived minerals to the primary cultured medium (S230); a primary time difference fermentation and separation step (S240) of secondary culturing the medium to which the lichen-derived minerals are added for 12 to 24 hours, and separating 1/3 of the secondary culture; 2 of tertiary culturing for an additional 6 to 12 hours (cumulative 18 to 36 hours) of the medium containing the culture remaining after the separation of the secondary culture, and isolating 1/2 of the tertiary culture Tea time difference fermentation and separation step (S250); A third time difference fermentation in which the culture medium containing the culture remaining separated from the tertiary culture is cultured for an additional 12 hours to 24 hours (accumulated 30 hours to 60 hours) and the fourth cultured culture is separated; and Separation step (S260); mixing and stirring the
  • the inoculum is yeast (Saccharomyces), lactic acid bacteria (Lactobacillus), Bacillus subtilis (Bacillus), yeast (Aspergillus) or photosynthetic bacteria (Rhodobacter) galactomyces (galactomyces) containing any one or more selected from the group comprising ) of the time difference fermentation method is provided.
  • the step of inoculating and culturing galactomyces (galactomuces) in the culture medium in which the inoculum is inoculated with the galactomyces (galactomuces) at a specific gravity of 5% to 10% relative to the total proportion occupied by the inoculum of the medium It provides a method for time-difference fermentation of galactomyces.
  • the first time difference fermentation and separation step is a step of separating 1/3 of the secondary culture (S241); crushing the separated culture (S242); and centrifuging and filtering the crushed culture (S243); provides a time difference fermentation method of galactomyces comprising a.
  • the second time difference fermentation and separation step is a step of separating 1/2 of the tertiary culture (S251); crushing the separated culture (S252); and centrifuging and filtering the crushed culture (S253); provides a time difference fermentation method of galactomyces comprising a.
  • the tertiary time difference fermentation and separation step is a step of separating the quaternary culture (S261); crushing the separated culture (S262); and centrifuging and filtering the crushed culture (S263); provides a method for fermenting galactomyces with a time difference comprising a.
  • the step of inoculating and culturing galactomyces (galactomuces) in the culture medium in which the inoculum is inoculated with the galactomyces (galactomuces) at a specific gravity of 5% to 10% relative to the total proportion occupied by the inoculum of the medium It provides a method for time-difference fermentation of galactomyces.
  • the lichen-derived mineral is selected from the lichen (S110); washing and drying the selected lichen (S120); grinding the washed and dried lichens (S130); extracting a mineral complex from the pulverized product (S140); Desalting and filtering the mineral complex (S150); and lyophilizing after the desalting and filtration (S160). It provides a method for fermenting galactomyces with a time difference comprising a.
  • the lichen-derived minerals are Umbilicaria antarctica, Peltigera canina (Peltigera canina), Peltigera praetextata (Peltigera praetextata), Lamarina conduprikans (Ramalina, conduplicans), Ramalina intermedia, Xanthoparmelia farinose, Diplocia canescens, Cetraria aculeate, Cladonia furcata, sudepe Pseudephebe pubescens, Sphaerophorus globosus, Stereocaulon alpinum, Umbilicaria antarctica, Usnea antarctica Any one or more selected from the group comprising , Usnea longissima, Usnea barbata and Usnea aurantiacoatra or Stictanylanderiana Provided is a method for staggered fermentation of galactomyces containing minerals derived from lichens.
  • the lichen-derived minerals are from the group comprising Na, Fe, K, Mg, Al, Mn, Si, Ca, Zn, I, S, P, Se, Mg or pharmaceutically or cosmetically acceptable minerals thereof.
  • a method for differential fermentation of galactomyces comprising one or more selected minerals.
  • 0.01 wt% to 0.5 wt% of the lichen-derived mineral is added in an amount of 0.01 wt% to 0.5 wt% compared to the medium in which the inoculum and galactomuces are mixed and cultured galactomyces (galactomyces) ) of the time difference fermentation method is provided.
  • the step of culturing the second to fourth provides a method for the time difference fermentation of galactomyces, characterized in that culturing at 25°C to 36°C.
  • the lichen is washed with purified water and then dried to a moisture content of 10% or less.
  • the pulverizing provides a method for fermenting with a time difference of galactomyces (galactomyces), characterized in that pulverized to a size of 350um to 2,000um.
  • the step of extracting the mineral complex from the pulverized product is a step of dispersing the pulverized product at 0.05 wt% to 0.5 wt% relative to purified water, and stirring at 60 ° C to 120 ° C for 1 h to 6 h at 5 rpm to 30 rpm. It provides a time difference fermentation method of galactomyces comprising.
  • the step of extracting with stirring includes adding any one or more organic acids selected from the group including malic acid (malic acid), citric acid (citric acid), fumaric acid, tartaric acid, oxalic acid, propionic acid or lactic acid.
  • malic acid malic acid
  • citric acid citric acid
  • fumaric acid fumaric acid
  • tartaric acid tartaric acid
  • oxalic acid propionic acid or lactic acid.
  • lactactomyces provides a time-stamped fermentation method.
  • the organic acid provides a time difference fermentation method of galactomyces (galactomyces), characterized in that 0.01% to 2.0% by weight compared to the mixture consisting of the purified water and the pulverized product.
  • the fermented Galactomyces complex with the addition of a mineral complex derived from lichens of the present invention contains various minerals and kojic acid to inhibit the activity of tyrosinase, an enzyme for producing melanin pigment. Provides skin cell blemishes, freckle prevention and whitening effects.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for fermenting galactomyces with a time difference including minerals derived from lichens according to an embodiment of the present invention.
  • a method for fermenting galactomyces containing lichen-derived minerals with a time difference and a cosmetic composition using the same are a method for extracting minerals from lichens and galactomyces containing lichen-derived minerals. It is composed of a cosmetic composition using a complex fermented material produced through a method of obtaining a complex fermented material by culturing with a time difference, and the complex fermented material is effective in alleviating mineral imbalance, moisturizing, and inflammation.
  • various kojic acid (Kojic acid) acid) to provide a whitening effect by inhibiting the activity of tyrosinase, an enzyme that produces melanin.
  • the method of extracting minerals from lichens may be preceded, and minerals from the lichens
  • the extraction method may start from the step of selecting the lichen (S110).
  • the time difference fermentation method of galactomyces of the present invention and the minerals added to the cosmetic composition using the same are derived from lichens, and the lichens are fungi and algae or / and cyanobacteria. It is defined as a symbiotic complex of
  • Lichens of the present invention are lichens that are native to the polar or alpine regions, and are Umbilicaria antarctica, Peltigera canina, Peltigera praetextata, Lamarina condu. Freecans (Ramalina, conduplicans), Ramalina intermedia, Xanthoparmelia farinose, Diplocia canescens, Cetraria aculeate, Cladonia pur Cata (Cladonia furcata), Pseudephebe pubescens, Sphaerophorus globosus, Stereocaulon alpinum, Umbilicaria antarctica, Us Includes Usnea antarctica, Usnea longissima, Usnea barbata and Usnea aurantiacotra or Stictanylanderiana, etc. Any one or more lichens selected from the group
  • the Umbilicaria antarctica is a lichen collected from King George Island in Antarctica by researchers, Usnea longissima is a lichen native to Mt. It is a lichen collected from the alpine region of Yunnan, China. These lichens are a kind of lichen that live in an environment unsuitable for normal living things, such as strong and dry winds, irregular fluctuations in moisture and nutrients, and strong ultraviolet rays throughout the year.
  • the lichen-derived minerals added to the Galactomyces culture of the present invention refer to minerals, and calcium (Ca), phosphorus (P), potassium (K), iron (Fe), zinc (Zn), copper ( Cu), manganese (Mn), selenium (Se), etc. are contained. Minerals are essential for maintaining healthy cells and the human body, such as improving the skin health of modern people, especially atopic symptoms, and delaying skin aging.
  • zinc plays a very important function in maintaining and regenerating the skin
  • selenium acts as an antioxidant and an essential component of glutathione peroxidase, a type of antioxidant enzyme. It has been reported that it inhibits the production of caine and causes anti-inflammatory action.
  • phosphorus (P) is involved in acid-alkali balance within the skin cells and buffers the skin cell fluid. It contributes to the equilibrium, maintains the osmotic pressure inside and outside the skin cells, and resolves the ion imbalance.
  • Another mineral, iron (Fe) binds to oxygen and maintains the metabolism of all tissue cells, and when it is deficient, it causes glossitis, cheilitis, spoon-type nail of the nail and hair loss, and copper (Cu) It activates the melanin-forming enzyme, and when it is deficient, it causes torsion hair, thermophilia nodosa, and bead hair.
  • mineral refers to a mineral extracted from or separated from lichens by a conventional method.
  • mineral refers to a material produced through the extraction process, desalination and filtration process or drying process, and the calcium (Ca), phosphorus (P), potassium (K), iron (Fe),
  • general minerals such as zinc (Zn), copper (Cu), manganese (Mn), and selenium (Se)
  • vitamins, organic substances, etc. may be included in the extraction process.
  • Mineral may be used interchangeably with “mineral complex”.
  • a step of washing and drying the selected lichen (S120) may be included, and the washing and drying step (S120) of the selected lichen is washed with purified water and then the moisture content is about 10 % or less may be dried.
  • the moisture content is less than 10%, it is easy to grind the lichen in the subsequent grinding step (S130), but when the moisture content is more than 10%, agglomeration occurs between the lichen grinding materials, which is inefficient in terms of productivity because a lot of power is required for grinding. to be.
  • the pulverizing step (S130) is a step of pulverizing the pulverized lichen material to a predetermined size, and may be pulverized to a size of 350 ⁇ m to 2,000 ⁇ m with a grinder such as a stainless mixer.
  • the pulverization step (S130) may include a step (S140) of extracting the mineral complex from the pulverized product.
  • the step of extracting the mineral complex the pulverized material pulverized to a size of 350um to 2,000um is dispersed in purified water to be 0.05% to 0.5% by weight compared to purified water, and 5rpm to 30rpm at 60°C to 120°C for 1h to 6h. It may consist of a step of extracting by stirring.
  • the reason for dispersing the pulverized product in purified water so as to be 0.05 wt% to 0.5 wt% compared to purified water is to optimize the extraction of minerals contained in the pulverized product, and when it is 0.05 wt% or less, the content of extracted minerals is too low There is a problem in that the efficiency is not good because there is a large amount lost in the post-treatment process, and when it is 0.5 wt% or more, a significant portion of the minerals contained in the pulverized product cannot be extracted.
  • it may consist of a step of extracting by stirring at 5 rpm to 30 rpm at 60° C. to 120° C. for 1 h to 6 h.
  • the temperature is 60° C. or less, the efficiency of the extracted minerals decreases, and when it is 120° C. or more, pulverization Water is denatured due to high temperature, and unnecessary components other than the expected components are extracted, complicating the post-treatment process and increasing the cost.
  • the extraction step (S140) may be composed of a step of extracting the mineral complex by further adding one or more organic acids.
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid
  • the extraction efficiency of the mineral complex can be increased, but since there is a problem that the inorganic acid remains in the extract after mineral extraction, an organic acid can be used instead of the inorganic acid to solve the residual accumulation problem and ensure stability. have.
  • the organic acid may include any one or more organic acids selected from the group consisting of malic acid (malic acid), citric acid (citric acid), fumaric acid, tartaric acid, oxalic acid, propionic acid or lactic acid.
  • the organic acid Since the organic acid has a lower mineral extraction efficiency than that of a strong acid, it is important to find an appropriate extraction condition.
  • the organic acid is preferably added in an amount of 0.01 wt% to 2 wt% based on the total of the mixture of the pulverized product and purified water.
  • the organic acid concentration is 0.01% to 2% by weight, the yield reaches the highest value, but when it is 2% by weight or more, it is not economical because a constant yield is shown without increasing the yield, and when it is 0.01% by weight or less, the extraction time is long. have. Therefore, it is preferable to appropriately adjust the organic acid concentration within the range of 0.01 wt% to 2 wt% in consideration of the pH conditions according to the use.
  • the extraction step (S140) may include a step (S150) of desalting and filtering the extracted mineral complex.
  • the desalting step is a step of removing salts from the mineral complex that has undergone the extraction step (S14) to produce mineral water, which is to remove salts corresponding to impurities.
  • the desalting step may be performed by methods such as a desalting treatment method by an electric extraction method and a desalting treatment method by an electrodialysis method, and is not limited to a specific method.
  • the filtration step is a process of removing suspended solid particles from the extract, and can be separated using the size of the particles passing through the membrane.
  • nanofiltration and microfiltration are used.
  • ultrafiltration and reverse osmosis.
  • an ultrafiltration device that usually has a separation target in the range of 1 nm to 0.1 ⁇ m.
  • a freeze-drying step (S16) may be included.
  • the drying step there are drying methods such as hot air drying or freeze drying, spray drying, and reduced pressure drying, but considering the efficacy of the dried mineral complex, the freeze-dried product is advantageous in terms of efficacy compared to other drying methods, so the drying method in the present invention is A lichen-derived mineral complex can be obtained by using a freeze-drying method.
  • the method for producing a complex fermented material by culturing galactomyces to which a lichen-derived mineral is added may be constituted from the step of culturing the inoculum (S210).
  • the inoculum is any one or more selected from the group comprising yeast (Saccharomyces), lactic acid bacteria (Lactobacillus), Bacillus subtilis (Bacillus), yeast (Aspergillus) or photosynthetic bacteria (Rhodobacter) can be composed of
  • yeast Sacharomyces
  • lactobacillus promotes the production of 'loricrin' protein, which occupies more than 70% of the stratum corneum of the skin, and has a function to strengthen the skin barrier by increasing healthy keratinocytes. It protects the skin from harmful bacteria, inhibits the growth of harmful bacteria, and has excellent anti-inflammatory effects.
  • Bacillus Bacillus produces a large amount of butanediol and has the ability to hold moisture, thereby improving skin moisture.
  • the kojic acid of Aspergillus is used as a functional cosmetic composition because it has a blemish-repellent effect and contains a large amount of various vitamins, amino acids, minerals, organic acids, and the like.
  • Photosynthetic bacteria (Rhodobacter) is used as a cosmetic composition for the treatment of skin diseases by producing an anti-inflammatory substance.
  • Galactomyces (Galctomyces) may be inoculated with a specific gravity of 5% to 10% of the total weight of the culture medium in this fermenter. If Galctomyces is inoculated at less than 5%, there is a possibility that the fermentation may not proceed sufficiently due to insufficient amount of inoculation bacteria. If it is added in excess of 10%, the amount of inoculation bacteria is too large and oxygen is lost. Insufficient fermentation does not occur, and there is a problem that the culture medium itself is corrupted or overfermented, so it is preferable to inoculate it with a specific gravity of 5% to 10%.
  • the fermented Galactomyces complex is a natural material containing a large amount of organic substances and can be obtained by fermenting lichen-derived minerals with a Galactomyces strain.
  • the fermented product of Galactomyces can improve skin moisture by promoting the conversion of profilagrin, a precursor of natural moisturizing factor (NMF), to natural moisturizing factor in water.
  • profilagrin a precursor of natural moisturizing factor (NMF)
  • NMF natural moisturizing factor
  • the abundant polysaccharide component contained in the fermented product of Galactomyces prevents moisture evaporation within the skin surface, and is rich in various vitamins such as vitamins B1, B2, pantothenic acid, B6, and folic acid.
  • Various natural enzymes such as protease, a glycosylation enzyme, increase the production and absorption of active substances, and thus have antioxidant, anti-aging, whitening, and skin moisturizing effects.
  • kojic acid to show a skin whitening effect.
  • it refers to 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4-pyrone, and the molecular structure can be confirmed through Formula 1 below.
  • Kojic acid is used as a whitening functional cosmetic composition because it has the effect of preventing and treating pigmentation by inhibiting the activity of tyrosinase through copper chelate.
  • step (S220) of inoculating and culturing Galactomyces in the culture medium in which the inoculum is cultured it is preferable to incubate at 34°C to 36°C for 24 hours to 36 hours. If the incubation time is less than 24 hours, Galctomyces cannot be sufficiently cultured, and if it exceeds 36 hours, Galctomyces is overcultured. There is a problem in that fermentation efficiency is lowered due to an increase in the ratio of Galactomyces having low activity.
  • it may include the step (S230) of adding the lichen-derived mineral complex obtained through the freeze-drying step (S160) after inoculating and culturing the Galactomyces (S220). It is preferable to add 0.01 wt% to 0.5 wt% of the lichen-derived mineral complex compared to the medium in which the inoculum and galactomyces are mixed and cultured. If it is less than 0.01% by weight, the effect of the active ingredient of the lichen mineral complex is insignificant, and if it exceeds 0.5% by weight, the excess mineral affects the physiological activity of Galactomyces, and the fermentation efficiency is lowered. to be.
  • the medium to which the lichen-derived mineral is added is secondarily cultured for 12 to 24 hours, and 1/3 of the secondary culture is separated from the primary time difference fermentation and a separation step (S240).
  • the first time difference fermentation and separation step (S240) is a step of separating 1/3 of the secondary culture (S241), crushing the separated culture (S242) and centrifuging the crushed culture It may consist of a series of steps of separation and filtering (S243).
  • the medium containing the culture remaining separated from the secondary culture is tertiarily cultured for an additional 6 hours to 12 hours (cumulative 18 hours to 36 hours), and 1/2 of the tertiary culture is separated It may include a secondary time difference fermentation and separation step (S250).
  • the secondary time difference fermentation and separation step (S250) is a step of separating 1/2 of the tertiary culture (S251), crushing the separated culture (S252) and centrifuging the crushed culture And it may be composed of a series of processes of the filtering step (S253).
  • the tertiary culture medium containing the culture remaining separated from the tertiary culture is cultured for an additional 12 hours to 24 hours (accumulated 30 hours to 60 hours), and the third time difference for separating the quaternary culture It may include a fermentation and separation step (S260).
  • the tertiary time difference fermentation and separation step (S260) is a step of separating the quaternary culture (S261), crushing the separated culture (S262) and centrifuging and filtering the crushed culture. It may be composed of a series of processes of (S263).
  • the mixing ratio between each time difference fermented product is not limited to a specific ratio.
  • the mixed fermented material to be obtained in the present invention may include a filtering and discharging step (S280) after the mixing and stirring step (S270).
  • S280 a filtering and discharging step
  • S270 mixing and stirring step
  • the complex fermented material obtained therefrom is separated between the complex fermented materials obtained in each time difference fermentation. Since there is a difference in components and content, it is possible to obtain additional efficacy, such as tyrosinase inhibitory activity, compared to the continuous fermentation and separation steps.
  • a cosmetic composition using the complex fermented product obtained by the manufacturing method of the present invention, wherein the cosmetic composition has an osmotic balance control, inflammation relief, moisturizing effect, and particularly a whitening effect.
  • the cosmetic composition has an osmotic balance control, inflammation relief, moisturizing effect, and particularly a whitening effect.
  • Usnea barbata species native to Yunnan, China was selected (S110). Thereafter, the selected lichens were washed with purified water and dried to a moisture content of about 10% or less (S120). Thereafter, lichens were pulverized to a size of 350 ⁇ m to 2,000 ⁇ m with a stainless mixer (S130). Thereafter, purified water is dispersed so that the pulverized product pulverized with a mixer becomes 0.3% by weight relative to purified water, malic acid, one of the organic acids, is added so as to be 1% by weight relative to the pulverized product and purified water mixture, and 3 hours at 100° C. The mineral complex was extracted by stirring at 15 rpm during (S140). Thereafter, after desalting by an electric extraction method, it was filtered with an ultrafiltration device (Pall, SLP-3053) (S150). Then, lyophilized to obtain a mineral complex derived from lichens (S160)
  • S230 weight % specific gravity
  • the medium containing the culture remaining separated from the tertiary culture is cultured for an additional 12 hours (cumulative 30 hours) at 25° C., and then the total amount of the quaternary culture is separated (S261), and separated
  • the crushed culture was crushed (S262), and the crushed culture was centrifuged and filtered (S263) to obtain a complex fermented product by the third time difference fermentation and separation (S250) step.
  • the complex fermented product obtained through the 1st to 3rd time difference fermentation and separation process is mixed and stirred in a 1:1:1 ratio (S270), filtered and discharged, and the mineral galactomyces time difference complex fermentation of the present invention water was obtained.
  • Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the secondary culture time was changed to 24 hours, the third culture time to 12 hours (cumulative 36 hours), and the fourth culture time to 24 hours (60 hours). .
  • Example 2 It was prepared in the same manner as in Example 1, except that in Example 1, the lichen-derived mineral extraction process (S110 to S160) and the step (S230) of adding the lichen-derived mineral complex to the fermentation medium were omitted.
  • Example 1 after adding the lichen-derived mineral complex to the primary culture medium without the first to third time difference fermentation and separation steps (S240 to S260), continuous fermentation at 35° C. for 36 hours, the fermented product was 1-3 ⁇ m Crushed to size, centrifuged and filtered to obtain a mineral Galactomyces complex fermented product
  • Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the secondary culture time was changed to 28 hours, the third culture time to 16 hours (cumulative 44 hours), and the fourth culture time to 28 hours (72 hours). .
  • Formulation Examples 1 and 2 are complex fermented products by time difference fermentation of Galactomyces containing the lichen-derived minerals prepared in Examples 1 and 2, and Formulation Examples In Examples 3 to 5, cosmetic standard samples were prepared using the lichen-derived minerals prepared in Comparative Examples 1 to 3, respectively.
  • Human Dermal fibroblast (HDFa) of a cosmetic standard sample prepared from a galactomyces complex fermented by adding a lichen-derived mineral of the present invention was mixed with Medium 106 with Low Serum Growth Supplement, followed by penicillin (100IU/ml). ), in a medium containing streptomycin (100 ⁇ g/ml) at 37° C., and cultured in an incubator containing 5% CO 2 .
  • a cosmetic standard sample cells were aliquoted in a 96 well plate and then cultured for 18 hours in cell culture conditions. After removing the medium and washing with PBS, a new medium and a cosmetic standard sample were added, respectively, and incubated for 18 hours. After 18 hours, in order to measure the viability of the cells, the mitochondria activity of the living cells was measured to confirm the cell viability by performing the MTT ASSAY to check the viability of the cells, and the results are shown in Table 3 below.
  • the moisturizing power of the cosmetic standard sample prepared from the Galactomyces complex fermented product added with the lichen-derived mineral of the present invention was confirmed for Preparation Examples 1 to 5 of the cosmetic standard sample prepared in Table 4 above. This was measured using a Corneometer® CM825 (Courage and Khazaka electronic GmbH, Germany).
  • the skin moisture content was measured, and after use, the skin moisture content over time was re-measured.
  • the moisture content increase rate of the skin moisture content and the moisture content before use was measured when 10 minutes elapsed after using the cosmetic standard sample, and the measurement results are shown in Table 4 below.
  • ⁇ -MSH a melanin-inducing substance
  • the complex fermentation products of Examples 1 and 2 were treated with 0.1 and 0.5%, respectively, and the cells were collected after culturing for 3 days. After adding 1 mL of 1N NaOH to the collected cells to completely dissolve the cells by heating, absorbance was measured at 475 nm. As a control, 0.005% of Arbutin, which is well-known as a material with whitening activity, was used, and the measurement results are as shown in Table 5 below.
  • Example 1 0.1 92.43 0.5 82.34
  • Example 2 0.1 91.67 0.5 80.17 Comparative Example 1 0.1 156.45 0.5 123.03 Comparative Example 2 0.1 132.24 0.5 107.47 Comparative Example 3 0.1 92.01 0.5 81.63 arbutin 0.005 57.24
  • mouse skin cancer cells (B16F10) were treated with penicillin (100IU/ml), It was cultured in DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) medium containing streptomycin (100 ⁇ g/ml) and 10% FBS at 37° C. in an incubator containing 5% CO2.
  • DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Medium
  • Example 1 0.1 94.38 0.5 83.23
  • Example 2 0.1 93.47 0.5 81.25 Comparative Example 1 0.1 178.45 0.5 173.03 Comparative Example 2 0.1 158.33 0.5 128.97 Comparative Example 3 0.1 93.86 0.5 81.93 arbutin 0.005 62.24
  • the Galactomyces complex fermented material cultured with lichen-derived minerals was found to be tyrosina compared to the Galactomyces complex fermented material cultured without containing lichen-derived minerals. It was found that tyrosinase mRNA was extracted in a small amount, and when cultured by the time difference fermentation method, tyrosinase mRNA was extracted in a smaller amount than when cultured by the continuous fermentation method instead of the time difference fermentation method. extraction was confirmed. It can be seen that the inhibition of melanin by the Galactomyces complex fermented product of the present invention is due to inhibition of tyrosinase enzyme activity, which is a key protein in the melanogenesis reaction.
  • a spectrophotometer CR-2600D Konica Minolta, Inc. ., Japan
  • the spectrophotometer measurement consists of three factors: L*, a*, and b*, and L* value is brightness, The a* value represents redness, and the b* value represents yellowness. Therefore, as a value for measuring skin brightness, the results of applying the L* value to the analysis are shown in Table 7 below.
  • Example 1 55.47 58.75 59.46
  • Example 2 55.35 58.72 59.63 Comparative Example 1 55.45 57.27 58.40 Comparative Example 2 55.46 58.12 58.97 Comparative Example 3 55.42 58.77 59.49

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Abstract

본 발명은 갈락토미세스 발효를 진행하는 과정에서 지의류에서 유래한 미네랄(Cu, Zn, Mg, Ca, Se 등) 중 1종 이상을 포함하는 복합물을 첨가하여 발효하는 것으로서, 지의류 유래 미네랄을 첨가한 갈락토미세스 복합 발효를 진행하는 과정에서 시간차 발효를 통해 발효 대사산물의 효능을 다양화 하여 기존의 효능 외에 특히 타이로시나아제 활성 억제를 통해 미백에 효능을 주는 것을 특징으로 하는 시간차 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스의 시간차 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물
본 발명은 갈락토미세스 발효를 진행하는 과정에서 지의류에서 유래한 미네랄(Cu, Zn, Mg, Ca, Se 등) 중 1종 이상을 포함하는 복합물을 첨가하여 발효하는 것에 관한 것으로서, 지의류 유래 미네랄을 첨가한 갈락토미세스 복합 발효를 진행하는 과정에서 시간차 발효를 통해 발효 대사산물의 효능을 다양화 하여 기존의 효능 외에 특히 타이로시나아제 활성 억제를 통해 미백에 효능을 주는 것을 특징으로 하는 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.
미네랄은 무기질이라고도 하며, 인체를 구성하는 원소로 섭취했을 때 분해되는 유기질과 달리 분해되지 않는 것을 말한다. 인체를 구성하는 미네랄은 칼륨(K), 칼슘(Ca), 셀레늄(Se), 나트륨(Na), 요오드(I), 아연(Zn), 마그네슘(Mg), 인(P) 황(S), 염소(Cl), 구리(Cu), 망간(Mn), 철(Fe), 코발트(Co) 등이 있고, 이는 체내 합성이 되지 않아 식품으로 섭취해야 한다. 몸의 약 4%를 차지하며, 뼈·치아 구성, 혈액의 산소 운반, 소화·삼투압 조절 등 다양한 작용에 관여한다.
상기 미네랄은 신체의 각종 대사 작용에 관여하여 몸을 건강하게 유지하는 역할을 하는데 현대인은 특정 미네랄이 부족하거나 과도해 불균형한 경우가 많다. 특히 피부와 관련되어 아토피, 피부건조증 등에서 비롯한 가려움증(소양증, 소양감)의 원인 모를 가려움에 시달리고 있다. 상기 아토피성 가려움은 면역체계의 이상으로 히스타민이 불필요하게 피부 속에서 배출되기 때문인 것으로 알려져 있지만 대부분의 경우 그 원일을 명확하게 밝혀내기 어려운 실정이나, 최근까지 알려진 바로 의하면 세포의 미네랄 이온의 불균형에 의한 피부 장벽이 손상되어 피부보습이 제때 이루어지지 않아 외부의 박테리아나 바이러스의 공격에 의해 쉽게 노출되기 때문에 피부와 관련된 질환이 생기는 것으로 알려져 있다.
위와 같이 외부 박테리아나 바이러스로부터 피부 세포를 보호하기 위해 피부 장벽을 강화하기 위한 방법이 연구되어 왔으며, 연구 결과에 따르면 천연 미네랄은 피부트러블을 해소하는 역할을 하고, 바이러스나 균들을 직접 죽이지는 못하지만 번식하는 것을 막아 일정시간이 지나면 소멸하게 하는 기능이 있으며, 이는 자연스러운 방법이기 때문에 부작용이 없는 것으로 밝혀졌다. 또한 천연 미네랄은 천연보습인자(NMF)를 활성화하여 피부 보습력을 높이고, 활성산소를 제거하는 효소(SOD)를 활성화하여 피부보화를 방지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
피부 세포에 미네랄을 대표적으로 해양심층수, 해조류, 천연광물 등으로부터 미네랄을 용출시켜 기능성 화장료의 성분으로 활용하는 방법이 이루어지고 있다.
한편, 지의류(linchen)는 균류(fungi)와 조류(algae) 또는/및 시아노박테리아(cyanobacteria)의 공생 복합체로서, 전세계적으로 약 14,000 종으로 분류된다. 한때 지의류의 2차 대사물(secondary metabolites)을 항균제(antimicrobial agent) 또는 항초식동물제(antiherbivore agent)로 사용하는 것이 제안된 바 있다. 또한, 몇몇 지의류 추출물은 민간에서 다양한 치료제로 이용되어 왔으며, 지의류 대사물이 항생(antibiotic agent), 항마이코박테리아 (antimycobacterial), 항바이러스(antiviral), 진통(analgesic), 해열능(antipyretic properties) 등의 다양한 생물학적 활성을 갖는다는 사실이 밝혀지고 있다. 이와 함께, 지의류에서 추출한 미네랄은 세포 이온 불균형에 따른 피부 노화 방지에 탁월한 효능이 있다는 연구결과가 나오고 있다.
한편, 피부 보습을 향상시키기 위하여 발효 균주의 발효물을 이용하였다. 발효물은 천연보습인자(NMF)를 활성화시켜 피부 세포에 수분을 공급하고 천연 보습 방어막을 형성할 수 있도록 도와주는 기능을 하는 것으로 알려져 있어 수분 공급용 화장료 성분으로 이용되고 있다.
구체적인 예로써 발효 균주 중 갈락토미세스(galactomyces)는 누룩으로 발효시키는 천연효모 중 하나로써, 양조장에서 누룩을 빚는 장인의 피부결이 곱고 맑으며 탄력이 있는 것을 발견하면서 천연효모인 갈락토미세스 발효물의 유효성과 그 속에 함유된 여러 가지 유효성분 대한 관심이 높아지게 되었다. 화장품 브랜드 SK-II 제품에 함유되면서 주목받기 시작하였으며, 피부보습, 미백, 모공, 진정효과를 주는 비타민 B1, B2, 판토텐산, B6, 엽산과 같은 각종 비타민들과 탄수화물, 그리고 천연보습인자인 각종 아미노산과 각종 미네랄이 풍부하다. 정어리의 7배가 넘게 함유되어있는 핵산의 항노화 작용이 알려져 있고 대표적인 미백효능성분으로 알려진 코직산(Kojic acid)의 경우도 1900년 초 찐쌀(koji)을 누룩으로 발효시키는 연구과정에서 최초로 알려졌다. 한편 발효과정 중에 만들어지는 당화효소, 프로테아제 등과 같은 각종 천연효소는 유효물질 생성 및 흡수를 높여주어 항산화, 항노화, 미백, 피부보습 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
종래 피부의 미백 및 주름 개선용도로서 알부틴(Arbutin)을 이용한 기능성 화장품 및 제조방법(한국등록특허, KR10-038983)이 게시되어 있지만, 알부틴은 천연 식물성분으로 안전한 미백성분으로 알려진 하이드로퀴논과 구조가 매우 흡사하여 부작용이 없는 장점이 있으나 효능이 많이 떨어지고, 특히 친유성 성질에서 친수성으로 바뀌면서 피부 침투가 매우 어려운 구조로 변하여 피부 깊숙이 위치한 멜라닌 세포까지 침투하기 어려운 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명자들은 천연 성분의 미백효과를 지니는 유효 물질의 추출방법과 이를 이용한 화장료 조성물을 개발하고자 지속적인 노력을 하였으며, 그 결과 지의류 유래 미네랄을 첨가한 갈락토미세스의 시간차 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물이 피부 장벽 개선, 미네랄 불균형 해소, 보습 효과 이외에 특히, 다양한 미네랄 및 코직산(Kojic acid)에 의한 멜라닌 색소 생성 효소인 타이로시나아제(Tyrosinase)의 활성을 억제하여 미백효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 피부 세포에 보습, 미네랄 발란스 조절, 염증완화 효과이외에 특히, 기미나 주근깨를 유발하는 멜라닌 색소 생성 효소인 티아로시나아제(Tyrosinase)의 활성을 억제하여 피부 세포의 미백 효과를 제공하기 위한 것으로서, 구체적으로 지의류로부터 유래한 미네랄을 첨가한 갈락토미세스의 시간차 복합 발효방법 및 이를 이용한 화장품 조성물을 제공하는데 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 수단으로서,
본 발명은 지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 배지에 접종균을 배양하는 단계(S210); 상기 접종균을 배양한 배지에 갈락토미세스(galactomuces)를 접종하여 1차 배양하는 단계(S220); 상기 1차 배양한 배지에 지의류 유래 미네랄을 첨가하는 단계(S230); 상기 지의류 유래 미네랄을 첨가한 배지를 12시간 내지 24시간 동안 2차 배양하고, 2차 배양물 중 1/3은 분리하는 1차 시간차 발효 및 분리단계(S240); 상기 2차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 추가로 6시간 내지 12시간(누적 18시간 내지 36시간) 동안 3차 배양하고, 상기 3차 배양물 중 1/2를 분리하는 2차 시간차 발효 및 분리단계(S250); 상기 3차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 추가로 12시간 내지 24시간(누적 30시간 내지 60시간) 동안 4차 배양하고 4차 배양한 배양물을 분리하는 3차 시간차 발효 및 분리단계(S260); 상기 1차 내지 3차 시간차 발효 및 분리단계에서 분리한 1 내지 3차 시간차 발효물을 혼합 교반하는 단계(S270); 및 상기 혼합 교반물을 여과 및 배출하는 단계(S280);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 접종균은 효모균(Saccharomyces), 유산균(Lactobacillus), 고초균(Bacillus), 누룩균(Aspergillus) 또는 광합성균(Rhodobacter)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 접종균을 배양한 배지에 갈락토미세스(galactomuces)를 접종하여 배양하는 단계는 상기 배지의 접종균이 차지하는 전체 비중 대비 상기 갈락토미세스(galactomuces)를 5% 내지 10% 비중으로 접종하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 1차 시간차 발효 및 분리단계는 상기 2차 배양물 중 1/3을 분리하는 단계(S241); 상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S242); 및 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S243);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 2차 시간차 발효 및 분리단계는 상기 3차 배양물 중 1/2을 분리하는 단계(S251); 상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S252); 및 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S253);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 3차 시간차 발효 및 분리단계는 상기 4차 배양물을 분리하는 단계(S261); 상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S262); 및 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S263);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 접종균을 배양한 배지에 갈락토미세스(galactomuces)를 접종하여 배양하는 단계는 상기 배지의 접종균이 차지하는 전체 비중 대비 상기 갈락토미세스(galactomuces)를 5% 내지 10% 비중으로 접종하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 지의류 유래 미네랄은 지의류 선정하는 단계(S110); 상기 선정된 지의류를 세척 및 건조하는 단계(S120); 상기 세척 및 건조된 지의류를 분쇄하는 단계(S130); 상기 분쇄물로부터 미네랄 복합물을 추출하는 단계(S140); 상기 미네랄 복합물을 탈염 및 여과하는 단계(S150); 및 상기 탈염 및 여과 후 동결건조하는 단계(S160);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 지의류 유래 미네랄은 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina, conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia), 잔토파르멜리아 파리노스( Xanthoparmelia farinose), 디플로시아 카네센스(Diplocia canescens), 세트라리아 아큘레아테(Cetraria aculeate), 클라도니아 푸르카타(Cladonia furcata), 슈데페베 푸베센스(Pseudephebe pubescens), 스파에로 글로보서스(Sphaerophorus globosus), 스테레오카우론 알피눔(Stereocaulon alpinum), 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 우스네아 안타르티카(Usnea antarctica), 우스네아 롱기시마(Usnea longissima), 우스네아 바르바타(Usnea barbata) 및 우스네아 아우란티아코아트라(Usnea aurantiacoatra) 또는 스틱타 니란데리아나(Stictanylanderiana)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상의 지의류로부터 유래한 미네랄을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 지의류 유래 미네랄은 Na, Fe, K, Mg, Al, Mn, Si, Ca, Zn, I, S, P, Se, Mg 또는 이들의 약학적 또는 화장품학적 허용 가능한 미네랄을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 미네랄을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 지의류 유래 미네랄을 첨가하는 단계는 상기 지의류 유래 미네랄을 상기 접종균 및 갈락토미세스(galactomuces)를 혼합 배양한 배지 대비 0.01 중량% 내지 0.5 중량% 첨가하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 2 내지 4차 배양하는 단계는 25℃ 내지 36℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 세척 및 건조하는 단계는 상기 지의류를 정제수로 세척한 후 수분 함량이 10% 이하가 되도록 건조하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 분쇄하는 단계는 350um 내지 2,000um 크기로 분쇄하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 분쇄물로부터 미네랄 복합물을 추출하는 단계는 상기 분쇄물을 정제수 대비 0.05중량% 내지 0.5중량%로 분산하고, 60℃ 내지 120℃에서 1h 내지 6h 동안 5rpm 내지 30 rpm으로 교반하여 추출하는 단계를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 교반하여 추출하는 단계는 사과산(말산), 구연산(시트르산), 푸마르산, 주석산, 옥살산, 프로피온산 또는 젖산 등을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상의 유기산을 첨가하는 단계를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 유기산은 상기 정제수 및 상기 분쇄물로 이루어진 혼합물 대비 0.01중량% 내지 2.0중량%인 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법을 제공한다.
또한, 상기 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법에 의해 생산된 물질을 이용한 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 지의류로부터 유래한 미네랄 복합물을 첨가하여 시간차 배양한 갈락토미세스 복합 발효물은 다양한 미네랄과 코직산(Kojic acid)을 함유하여 멜라닌 색소 생성 효소인 티아로시나아제(Tyrosinase)의 활성을 억제함으로서 피부세포의 기미, 주근깨 방지 및 미백 효과를 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스의 시간차 발효방법의 흐름도에 관한 것이다.
이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.
한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물은 지의류로부터 미네랄을 추출하는 방법 및 지의류 유래 미네랄을 첨가한 갈락토미세스(galactomyces)를 시간차 배양하여 복합 발효물질을 수득하는 방법을 거쳐 생산된 복합 발효물질을 이용한 화장료 조성물로 구성되며, 상기 복합 발효물질은 미네랄 불균형 완화, 보습, 염증 완화에 효과가 있고, 특히, 다양한 코직산(Kojic acid)를 함유하고 있어 멜라닌 색소 생성효소인 타이로시나아제(Tyrosinase)의 활성을 억제하여 미백효과를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따른 지의류로부터 유래한 미네랄을 첨가한 갈락토미세스의 시간차 복합 발효 방법 및 이를 이용한 화장품 조성물에 있어서, 지의류로부터 미네랄을 추출하는 방법이 선행될 수 있고, 상기 지의류로부터 미네랄을 추출하는 방법은 지의류를 선정하는 단계(S110)부터 시작될 수 있다.
본 발명의 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법 및 이를 이용한 화장료 조성물에 첨가되는 미네랄은 지의류로부터 유래한 것으로서, 상기 지의류는 균류(fungi)와 조류(algae) 또는/및 시아노박테리아(cyanobacteria)의 공생 복합체로 정의된다.
본 발명의 지의류는 극지 또는 고산지대에서 자생하는 지의류로서, 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina, conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia), 잔토파르멜리아 파리노스(Xanthoparmelia farinose), 디플로시아 카네센스(Diplocia canescens), 세트라리아 아큘레아테(Cetraria aculeate), 클라도니아 푸르카타(Cladonia furcata), 슈데페베 푸베센스(Pseudephebe pubescens), 스파에로 글로보서스(Sphaerophorus globosus), 스테레오카우론 알피눔(Stereocaulon alpinum), 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 우스네아 안타르티카(Usnea antarctica), 우스네아 롱기시마(Usnea longissima), 우스네아 바르바타(Usnea barbata) 및 우스네아 아우란티아코아트라(Usnea aurantiacoatra) 또는 스틱타 니란데리아나(Stictanylanderiana) 등을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상의 지의류이다.
상기 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica)는 연구자들에 의해 남극의 킹조지섬으로부터 수집된 지의류이며, 우스네아 롱기시마(Usnea longissima)는 지리산에 자생하는 지의류이며, 그 외 지의류는 연구자들에 의해 중국 운남성(Yunnan)의 고산 지대로부터 수집된 지의류이다. 이들 지의류들은 강하고 건조한 바람, 수분과 영양분의 불규칙한 변동, 연중 강한 자외선 등의 일반 생물이 살아가기에는 부적합한 환경에서 서식하는 지의류 중의 일종이다.
또한, 본 발명의 갈락토미세스(Galactomyces) 배양에 첨가되는 지의류 유래 미네랄은 무기질을 말하며, 칼슘(Ca), 인(P), 칼륨(K), 철분(Fe), 아연(Zn), 구리(Cu), 망간(Mn), 셀레늄(Se) 등이 함유되는 것을 말한다. 미네랄은 현대인의 피부건강 특히 아토피 증상을 개선하고 피부노화를 지연시키는 등 건강한 세포 및 인체를 유지하기 위한 필수요소이다.
질병의 90%는 활성산소에 의하여 발생하며, 체내의 활성산소는 질병과 피부노화를 촉진하고, 세포막 형성 주성분인 지질을 과산화지질로 만들어 세포를 파괴한다. 중장년층은 미네랄의 섭취 및 흡수량의 저하로 인해 미네랄 밸런스가 붕괴, 결핍되어 피부생리활성 저해와 체내에 발생한 활성상소를 제거하는 효소(SOD)의 작용을 방해한다. 이러한 활성 산소를 제거하는 효소의 필수 성분으로 지의류에 함유되어있는 철, 동, 아연, 셀렌, 망간 등이 있다.
각질층의 보호기능이 데미지를 받은 경우에도 이것을 회복하려고 하는 항상성유지기능이 작용하는데, 이 경우에는 지의류의 풍부한 칼슘(Ca)과 마그네슘(Mg)이 효과적으로 개선시킬 수 있다는 연구결과가 있다. 또한, 칼슘(Ca)은 세포간지방질의 생성을 촉진하고 각질세포를 튼튼하게 하고, 마그네슘(Mg)은 세포간물질을 각질층에 운반하는 것을 도와주고 각질층의 보수에 도움을 주며, 오래된 각질은 마그네슘(Mg)이 침투압을 높이고, 모공에 찬 노폐물과 결합해 배설하는 기능을 가지고 있어 오래된 각질을 제거할 수 있다.
또한, 아연(Zn)은 피부의 유지, 재생에 매우 중요한 기능을 하고, 셀레늄(Se)은 항산화 작용, 항산화효소의 일종인 글루타티온과산화효소(glutathione peroxidase)의 필수 구성요소로서 역할을 하며, 염증사이토카인의 생성을 억제하여 항염증작용을 일으킨다고 보고되었다.
이외에도 인(P)은 피부세포 내에서의 산알칼리 평형에 관여 및 피부세포액의 완충작용을 하며, 결핍 시 신진대사가 원활하지 못하게 되고 발육부진 등을 유발하며, 칼륨(K)은 체내외의 산알칼리 평형에 기여, 피부세포 내외의 삼투압 유지하여 이온 불균형 해소하는 작용을 하며, 결핍 시 피부조직세포를 붕괴에 의한 세포장벽 손상에 따른 노화를 유발한다. 또 다른 미네랄인 철분(Fe)은 산소와 결합하여 전 조직세포의 신진대사를 유지시키는 작용을 하며, 결핍 시에는 설염, 구순염, 손발톱의 스푼형 조갑 및 탈모 등을 유발하고, 구리(Cu)는 멜라닌 형성 효소를 활성화 작용을 하며, 결핍시 염전모, 결절성 열모증 및 염주모 등을 유발한다.
본 발명에 있어서, "미네랄"은 지의류로부터 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 미네랄을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 "미네랄"은 상기 추출과정, 탈염 및 여과 과정 또는 건조과정을 거쳐 생산된 물질을 말하며, 상기 칼슘(Ca), 인(P), 칼륨(K), 철분(Fe), 아연(Zn), 구리(Cu), 망간(Mn), 셀레늄(Se) 등의 일반적인 무기질로 지칭된 것 이외에 추출 과정에서 상기 무기질 이외의 비타민, 유기물 등이 포함된 것일 수 있다. “미네랄”은 “미네랄 복합물”로 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 지의류 선정단계(S110) 이후에는 선정된 지의류를 세척 및 건조하는 단계(S120)를 포함할 수 있으며, 상기 세척 및 건조단계(S120)는 선정된 지의류를 정제수로 세척한 후 수분 함량이 약 10% 이하가 되도록 건조할 수 있다. 수분 햠량이 10% 이하일 경우에는 추후 분쇄단계(S130)에서 지의류 분쇄가 용이하나, 수분 함량이 10% 이상일 경우에는 지의류 분쇄재료간 뭉침 현상이 생겨 분쇄할 때 많은 동력이 필요하기 때문에 생산성 측면에서 비효율적이다.
세척 및 건조단계(S120) 이후에는 분쇄단계(S130)를 포함할 수 있다. 상기 분쇄단계(S130)는 지의류 분쇄재료를 일정 크기로 분쇄하는 단계로서, 스테인레스 믹서기 등의 분쇄기로 350um 내지 2,000um 크기로 분쇄할 수 있다.
분쇄단계(S130) 이후에는 분쇄물로부터 미네랄 복합물을 추출하는 단계(S140)를 포함할 수 있다. 상기 미네랄 복합물을 추출하는 단계는 350um 내지 2,000um 크기로 분쇄된 분쇄물을 정제수 대비 0.05중량% 내지 0.5중량%가 되도록 정제수에 분산하고, 60℃ 내지 120℃에서 1h 내지 6h 동안 5rpm 내지 30 rpm으로 교반하여 추출하는 단계로 구성될 수 있다.
상기 분쇄물을 정제수 대비 0.05중량% 내지 0.5중량%가 되도록 정제수에 분산하는 이유는 분쇄물 안에 포함되어 있는 미네랄의 추출을 최적화 하기 위함이고, 0.05중량% 이하일 경우에는 추출되는 미네랄의 함량이 너무 낮아 후처리공정에서 소실되는 양이 많아 효율이 좋지 못하고, 0.5중량% 이상일 경우에는 분쇄물 안에 포함되어 있는 미네랄의 상당부분을 추출하지 못하는 문제점이 있다.
또한, 60℃ 내지 120℃에서 1h 내지 6h 동안 5rpm 내지 30 rpm으로 교반하여 추출하는 단계로 구성될 수 있는데, 온도를 60℃ 이하일 경우에는 추출되는 미네랄의 효율이 낮아지고, 120℃ 이상일 경우에는 분쇄물이 고온으로 인해 변성이 일어나 기대하는 성분 이외의 불필요한 성분까지 추출되어 후처리 공정이 복잡해지고 비용이 상승하는 문제가 있으며, 교반 속도가 5rpm 이하일 경우에는 정상적으로 교반되지 않고 분쇄물이 가라앉아 추출 효율이 낮아지고, 30rpm 이상일 경우에는 상기 분쇄물이 더 작게 분쇄되기 때문에 추출공정 이후 한외겨과장치에서 필터링 하는 과정에서 분쇄물이 포함되어 최종 제품의 품질이 고르게 되지 못하는 문제가 있다.
더욱이, 상기 추출단계(S140)는 1종 이상의 유기산을 더욱 첨가하여 미네랄 복합물을 추출하는 단계로 구성될 수 있다. 염산 등의 무기산을 사용할 경우에는 미네랄 복합물 추출 효율을 증가시킬 수 있지만, 미네랄 추출 후 무기산이 추출물에 잔류하는 문제점이 있기 때문에 이와 같은 잔류 축적 문제를 해결하고 안정성을 확보하기 위해 무기산 대신 유기산이 사용될 수 있다.
상기 유기산으로는 사과산(말산), 구연산(시트르산), 푸마르산, 주석산, 옥살산, 프로피온산 또는 젖산 등을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상의 유기산으로 구성될 수 있다.
상기 유기산은 미네랄 추출 효율이 강산에 비해 낮으므로 적절한 추출 조건을 찾는 것이 중요하다. 유기산은 상기 분쇄물과 정제수의 혼합물 전체 대비 0.01중량% 내지 2중량% 비율로 첨가함이 바람직하다. 유기산 농도가 0.01중량% 내지 2중량%일 경우 수율이 최고치에 도달하지만, 2중량% 이상일 경우에는 수율 증가 없이 일정한 수율을 보이기 때문에 경제적이지 못하며, 0.01중량% 이하일 경우에는 추출 시간이 길어지는 문제점이 있다. 따라서, 용도에 따른 pH 조건 등을 고려하여 유기산 농도를 0.01중량% 내지 2중량% 범위 내에서 적절히 조절함이 바람직하다.
추출단계(S140) 이후에는 추출한 미네랄 복합물을 탈염 및 여과하는 단계(S150)를 포함할 수 있다.
탈염단계는 상기 추출단계(S14)를 거친 미네랄 복합물에서 염을 제거하여 미네랄수를 생산하는 단계로서, 이는 불순물에 해당되는 염을 제거하기 위함이다. 상기 탈염단계는 전기추출법에 의한 탈염처리방법과 전기투석법에 의한 탈염처리방법 등의 방법으로 시행될 수 있으며 특정 방법에 국한되지 아니한다.
여과단계는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 막을 통과하는 입자의 크기를 이용하여 분리하는 공정으로 이루어 질 수 있으며, 분리 대상물의 크기에 따라 나노여과(Nanofiltration), 미세여과(Microfiltration), 한외여과(Ultrafiltraion), 역삼투(reverse osmosis) 등의 방법이 있다. 분리대상인 미네랄 입자의 크기(0.05μm 내지 1μm)를 고려할 때 통상 1nm 내지 0.1μm 범위를 분리 대상으로 하는 한외여과장치를 사용하는 것이 바람직하다.
탈염 및 여과단계(S15) 이후에는 동결건조단계(S16)를 포함할 수 있다. 건조단계는 열풍건조 또는 동결건조, 분무건조, 감압건조 등의 건조방법이 있으나, 건조된 미네랄 복합물의 효능을 고려할 때 동결건조품이 다른 건조방법에 비하여 효능 측면에서 유리하기 때문에 본 발명에서 건조방법은 동결건조방법을 이용하여 지의류 유래 미네랄 복합물을 수득할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 지의류 유래 미네랄을 첨가한 갈락토미세스(galactomyces)를 시간차 배양하여 복합 발효물질을 제조하는 방법에 있어서, 접종균을 배양하는 단계(S210)로부터 구성될 수 있다.
상기 접종균 배양단계(S210)에 있어서, 접종균은 효모균(Saccharomyces), 유산균(Lactobacillus), 고초균(Bacillus), 누룩균(Aspergillus) 또는 광합성균(Rhodobacter)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상으로 구성될 수 있다.
상기 효모균(Saccharomyces)은 피부 조직과 매우 유사한 세포 구조와 대사 리듬을 가지고 있기 때문에 화장료 조성물로서 효모 성분을 첨가해 피부에 흡수시키면 효모와 함께 피부의 세포 주기를 정상으로 환원시킬 수 있고, 각종 비타민과 아미노산, 미네랄, 유기산 등을 다량 포함되어 있는 특징이 있다. 유산균(Lactobacillus)은 피부 각질층의 70% 이상을 차지하고 있는 ‘로리크린’ 단백질의 생성을 촉진하여 건강한 각질 세포가 증가해 피부 장벽을 강화하는 기능이 있고, 피부세포의 pH 발란스가 빠르게 복원되어 외부 세균으로부터 피부를 보호하여 유해균 성장을 억제하고 항염 효과가 뛰어난 특징이 있다. 고초균(Bacillus)은 다량의 부탄디올(butanediol)을 생산하여 수분을 붙잡아 두는 기능이 있어 피부 보습을 향상시키는 효과가 있다. 누룩균(Aspergillus)의 코지산(kojic acid)은 기미 발생 발지 효과가 있고, 다양한 비타민과 아미노산, 미네랄, 유기산 등을 다량 포함되어 있는 특징이 있어 기능성 화장료 조성물로서 사용되고 있다. 광합성균(Rhodobacter)은 항염증 물질을 생산하여 피부질환 치료용 화장료 조성물로 사용되고 있다.
또한, 상기 접종균 배양단계(S210) 후 배양된 갈락토미세스(Galctomyces)를 본 발효조에 접종하여 배양하는 단계(S220)를 포함할 수 있다. 갈락토미세스(Galctomyces)는 본 발효조 배양 배지 전체 비중 대비 5% 내지 10% 비중으로 접종 될 수 있다. 갈락토미세스(Galctomyces)를 5% 미만으로 접종할 경우에는 접종균의 양이 부족하여 발효가 충분하게 진행되지 않을 가능성이 있고, 10% 초과하여 첨가할 경우에는 접종균의 양이 너무 많아 산소가 부족하여 발효가 일어나지 않고 배양액 자체가 부패되거나 과발효 되는 문제점이 있으므로, 5% 내지 10% 비중으로 접종함이 바람직하다.
상기 갈락토미세스 복합발효물은 유기물질을 다량 함유하는 천연 소재로서 지의류 유래 미네랄을 갈락토미세스 균주로 발효시켜 수득될 수 있다.
상기 갈락토미세스(Galactomyces)의 발효물은 물은 천연보습인자(NMF, natural moisturizing factor)의 전구체인 프로필라그린(profilaggrin)이 천연보습인자로 전환하는 것을 촉진하여 피부 보습을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 갈락토미세스의 발효물에 함유된 풍부한 다당 성분은 피부 표면 내의 수분 증발을 방지하고, 비타민 B1, B2, 판토텐산, B6, 엽산과 같은 각종 비타민이 풍부하며, 특히, 발효과정에서 만들어지는 당화효소인 프로테아제 등과 같은 각종 천연효소는 유효물질 생성 및 흡수를 높여주어 항산화, 항노화, 미백, 피부보습 등의 효능이 있다.
또한, 코직산(Kojic acid)을 함유하여 피부 세포의 미백효과를 나타낸다. 구체적으로, 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4-pyrone을 말하며, 하기 화학식 1을 통해 분자구조를 확인할 수 있다. 코직산(Kojic acid)은 구리의 킬레이트(Chelate)를 통해 티로시나아제(Throsinase)의 활성을 억제시켜 색소 침착을 예방하고 치료하는 효과가 있어 미백 기능성 화장료 조성물로 활용되고 있다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2019017141-appb-I000001
또한, 상기 접종균을 배양한 배지에 갈락토미세스를 접종하여 배양하는 단계(S220)는 34℃ 내지 36℃에서 24시간 내지 36시간 배양하는 것이 바람직하다. 배양시간이 24시간 미만일 경우에는 갈락토미세스(Galctomyces)를 충분히 배양시키지 못하고, 36시간을 초과할 경우에는 갈락토미세스(Galctomyces)가 과배양되어 발효공정 진행시에 산소가 부족해 부패가 일어나거나 생리활성이 낮은 갈락토미세스(Galctomyces)의 비율이 증가하여 발효 효율이 낮아지는 문제점이 있다.
또한, 상기 갈락토미세스를 접종하여 배양하는 단계(S220) 후 상기 동결건조단계(S160)를 거쳐 수득한 지의류 유래 미네랄 복합물을 추가하는 단계(S230)를 포함할 수 있다. 상기 지의류 유래 미네랄 복합물은 상기 접종균 및 갈락토미세스를 혼합 배양한 배지 대비 0.01 중량% 내지 0.5 중량% 첨가함이 바람직하다. 0.01 중량% 미만일 경우에는 지의류 미네랄 복합물의 유효성분에 따른 효과가 미미하고, 0.5중량%를 초과할 경우에는 과량의 미네랄이 오히려 갈락토미세스(Galactomyces)의 생리활성에 영향을 주어 발효 효율이 낮아지기 때문이다.
또한, 상기 지의류 유래 미네랄 복합물을 추가하는 단계(S230) 후 상기 지의류 유래 미네랄을 추가한 배지를 12시간 내지 24시간 동안 2차 배양하고, 2차 배양물 중 1/3은 분리하는 1차 시간차 발효 및 분리단계(S240)을 포함할 수 있다.
더욱이, 상기 1차 시간차 발효 및 분리단계(S240)는 상기 2차 배양물 중 1/3을 분리하는 단계(S241), 상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S242) 및 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S243)의 일련의 과정으로 구성될 수 있다.
또한, 상기 2차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 추가로 6시간 내지 12시간(누적 18시간 내지 36시간) 동안 3차 배양하고, 상기 3차 배양물 중 1/2를 분리하는 2차 시간차 발효 및 분리단계(S250)를 포함할 수 있다.
더욱이, 2차 시간차 발효 및 분리단계(S250)는 상기 3차 배양물 중 1/2을 분리하는 단계(S251), 상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S252) 및 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S253)의 일련의 과정으로 구성될 수 있다.
또한, 상기 3차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 추가로 12시간 내지 24시간(누적 30시간 내지 60시간) 동안 4차 배양하고, 상기 4차 배양물을 분리하는 3차 시간차 발효 및 분리단계(S260)를 포함할 수 있다.
더욱이, 3차 시간차 발효 및 분리단계(S260)는 상기 4차 배양물을 분리하는 단계(S261), 상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S262) 및 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S263)의 일련의 과정으로 구성될 수 있다.
또한, 상기 1차 내지 3차 시간차 발효 및 분리단계에서 분리한 1 내지 3차 시간차 발효물을 혼합 교반하는 단계(S270)을 포함할 수 있다. 단, 각 시간차 발효물 간의 혼합비율은 특정 비율로 한정된 것은 아니다.
또한, 상기 혼합 및 교반하는 단계(S270) 후 여과 및 배출단계(S280)를 포함할 수 있다. 상기 여과 및 배출단계를 통해 본 발명에서 얻고자 하는 혼합 발효물질을 수득할 수 있다.
상기 1차 내지 3차 시간차 발효 및 분리단계는 지의류 유래 미네랄을 첨가한 갈락토미세스를 누적 시간을 달리하여 발효할 경우, 이로부터 수득한 복합 발효물질은 각 시간차 발효에서 수득한 복합 발효물질들 간의 구성 성분 및 함량에서 차이를 보이므로 연속된 발효 및 분리단계에 비하여 티로시나아제 억제 활성 등의 추가적인 효능을 얻을 수 있다.
또 하나의 관점에서, 본 발명의 제조방법에 의해 수득한 복합 발효물를 이용한 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 화장료 조성물은 삼투압 바란스(Osmotic balance)조절, 염증완화, 보습 효능 및 특히 미백효과가 있어 기능성 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 다만 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 보호범위가 제한되지 않음을 밝혀둔다.
1. 지의류 유래 미네랄 추출 및 이를 포함하는 갈락토미세스의 시간차 발효 방법
<실시예 1>
(1) 지의류 유래 미네랄 추출방법
중국 운남성에 자생하는 우스네아 바르바타(Usnea barbata)종을 선정하였다(S110). 이후 선정된 지의류를 정제수로 세척하고 수분 함량이 약 10% 이하가 되도록 건조하였다(S120). 이후, 스테인레스 믹서기로 지의류를 350um 내지 2,000um 크기로 분쇄하였다(S130). 이후, 믹서기로 분쇄한 분쇄물을 정제수 대비 0.3중량%가 되도록 정제수를 분산하고, 분쇄물 및 정제수 혼합물 대비 1중량%가 되도록 유기산 중 하나인 말산(malic acid)을 첨가하고, 100℃에서 3시간 동안 15rpm을 교반하여 미네랄 복합물을 추출하였다(S140). 이후, 전기추출법으로 탈염 처리한 후 한외여과장치(Pall, SLP-3053)로 여과하였다(S150). 이후, 동결건조하여 지의류 유래 미네랄 복합물을 수득하였다(S160)
(2) 지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스의 시간차 발효 방법
포도당 1.5%(v/v), 설탕 1.5%(v/v), 물엿 1.5%(v/v)이 포함된 배지에 효모균(Saccharomyces) 0.3%(v/v)를 접종하여 배양하였다(S210). 이후, 상기 배지의 접종균이 차지하는 비중 대비 10% 비중으로 갈락토미세스(Galactomyces)를 접종한 후 35℃에서 30시간동안 1차 배양하였다(S220) 이후, 효모균 및 갈락토미세스의 혼합 균체 대비 0.3중량% 비중으로 동결건조한 지의류 유래 미네랄 복합물을 첨가하고(S230), 30℃에서 12시간 동안 2차 배양한 후 상기 2차 배양물 중 1/3을 분리하고(S241), 분리된 배양물을 파쇄하고(S242), 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하여(S243) 1차 시간차 발효 및 분리(S240)단계에 의한 복합 발효물을 수득하였다.
이후, 2차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 36℃에서 추가로 6시간 (누적 18시간) 동안 3차 배양한 후 상기 3차 배양물 중 1/2을 분리하고(S251), 분리된 배양물을 파쇄하고(S252), 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하여(S253) 2차 시간차 발효 및 분리(S250)단계에 의한 복합 발효물을 수득하였다.
이후, 이후, 3차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 25℃에서 추가로 12시간(누적 30시간) 동안 4차 배양한 후 상기 4차 배양물 전량 분리하고(S261), 분리된 배양물을 파쇄하고(S262), 파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하여(S263) 3차 시간차 발효 및 분리(S250)단계에 의한 복합 발효물을 수득하였다.
이후, 상기 1 내지 3차 시간차 발효 및 분리 과정을 거쳐 수득한 복합 발효물을 1:1:1 비율로 혼합 교반하고(S270), 여과 및 배출단계를 거쳐 본 발명의 미네랄 갈락토미세스 시간차 복합 발효물을 수득하였다.
<실시예 2>
실시예 1에서 2차 배양 시간을 24시간, 3차 배양 시간을 12시간(누적 36시간), 4차 배양 시간을 24시간 (60시간)으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
<비교예 1>
실시예 1에서 지의류 유래 미네랄 추출과정(S110 내지 S160)과 지의류 유래 미네랄 복합물을 발효 배지에 첨가하는 단계(S230)를 생략한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
<비교예 2>
실시예 1에서 1차 내지 3차 시간차 발효 및 분리단계(S240 내지 S260) 없이 지의류 유래 미네랄 복합물을 1차 배양 배지에 추가한 후 35℃에서 36시간동안 연속적으로 발효한 후 발효물을 1~3um 크기로 파쇄하고, 원심분리 및 여과하여 미네랄 갈락토미세스 복합 발효물을 수득하였다
<비교예 3>
실시예 1에서 2차 배양 시간을 28시간, 3차 배양 시간을 16시간(누적 44시간), 4차 배양 시간을 28시간 (72시간)으로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
2. 지의류 유래 미네랄을 함유한 갈락토미세스 복합 발효물 미네랄 분석
실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 조건에 따른 갈락토미세스 복합 발효물의 미네랄 분석은 유도결합 플라즈마 질량분석기질량분석기(ICP-MS, X-series(X5,X7), Thermo Elemental, UK)를 이용하여 미네랄 성분 및 함량을 분석하였으며, 분석 결과는 아래의 표 1과 같다.
구분 Ca P K Fe Zn Cu Mn Se Mg
실시예 1 582 82 62 17 38 84 55 13 41
실시예 2 597 93 65 21 42 89 57 15 42
비교예 1 15 5 ND ND ND 3 ND ND ND
비교예 2 570 77 48 10 32 76 52 12 34
비교예 3 585 76 59 15 42 81 56 14 42
표 1에서 구성성분의 단위는 모두 “ppb”이다. 상기 실시예 1, 2에서의 분석결과에서 보듯이 2차 내지 4차 시간차 발효 시간이 늘어날수록 미네랄의 추출양이 늘어나지만 비교예 3에서 보듯이 시간차 발효시간이 필요이상으로 오래 진행되게 되면 오히려 미네랄의 추출량이 줄어들거나 늘어나는 양이 큰 변화 없이 유지되는 것을 볼 수 있다. 이는 갈락토미세스(galactomyces)가 2차 시간차 발효시에 과배양되어 오히려 이후 단계에서의 미네랄의 수득에 좋지못한 영향을 끼치기 때문으로 사료된다.
3. 갈락토미세스 복합발효물을 함유하는 화장료 표준시료 제조
실시예와 비교예 1 및 2에서 제조한 갈락토미세스 복합발효물을 이용하여 화장료 표준시료를 아래의 표 2와 같이 제조하였다.
주요Phase 원료명 제형예1 제형예2 제형예3 제형예4 제형예5
A 정제수 56.18 56.18 56.18 56.18 56.18
갈락토미세스 복합발효여과물 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
Glycerine 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
Propanediol 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
Betain 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
Dipropylene Glycol 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
1,2-Hexanediol 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80
Disodium EDTA 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02
B Xanthan Gum 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
Hydroxyethyl Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
Polyacrylate Crosspolymer-6 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
C Polyglyceryl-3 Methylglucose Distearate 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
Cetearyl Alcohol 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
Butyropermum Parkii (Shea) Butter 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Caprylic/Capric Triglyceride 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
D Methyl Trimethicone 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
Dimethicone 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
E Fragrance 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
표 2에서 구성성분의 단위는 모두 "g"이고, 제형예 1 및 2는 상기 실시예 1 및 2로 제조된 지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스의 시간차 발효에 의한 복합 발효물이고, 제형예 3 내지 5는 상기 비교예 1 내지 3에서 제조한 지의류 유래 미네랄을 각각 사용하여 화장료 표준시료를 제조하였다.
4. 세포독성 시험
본 발명의 지의류 유래 미네랄을 첨가하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물로 제조된 화장료 표준시료의 인간섬유아세포(Human Dermal fibroblast: HDFa)를 Medium 106에 Low Serum Growth Supplement를 혼합하여 페니실린(100IU/ml), 스트렙토마이신 (100μg/ml)를 함유하는 배지에서 37℃, 5% CO2를 포함하는 배양기내에서 배양하였다. 상기 제조된 화장료 표준시료의 독성을 확인하기 위하여, 96 well plate에 세포를 분주한 다음 세포 배양조건에서 18시간 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 새로운 배지와 화장료 표준시료를 각각 넣고, 18시간 동안 배양하였다. 18시간 이후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 살아있는 세포의 mitochondria 활성을 측정하여 세포의 생존율을 확인할 수 있는 MTT ASSAY를 수행하여 세포 생존율을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분 세포생존율(%)
제형예1 118.7
제형예2 119.2
제형예3 93.3
제형예4 109.4
제형예5 118.9
표 3에 나타난 바와 같이, 섬유아세포에 대해 제형에 3을 제외한 모든 시료에서 100%이상의 높은 세포 생존율을 보였으며, 특히 제형예 3 및 4에 따른 화장료 표준시료와 비교하여 본원발명의 제형예 1 및 2의 화장료 표준시료는 보다 높은 세포 생존율을 보이는 것을 알 수 있다. 본 발명의 범위를 벗어나는 제형예 5의 경우에도 높은 세포 생존율을 보이지만 제조시간 및 비용 대비 수득되는 미네랄의 양 및 세포생존율을 볼 때 상용화에 적합하지 못하다고 판단할 수 있다.
5. 보습력 측정
본 발명의 지의류 유래 미네랄을 첨가하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물로 제조된 화장료 표준시료의 보습력을 측정하기 위하여 상기 표 4에서 제조된 화장료 표준시료의 제조예 1 내지 5를 대상으로 보습력을 확인하였으며, 이는 Corneometer® CM825(Courage and Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 측정하였다.
상기 화장료 표준시료를 사용하기 전 피부 수분함량을 측정한 후 사용한 후 시간에 따른 피부 수분 함량을 재측정하였다. 또한, 상기 화장료 표준시료를 사용한 후 10분이 경과할 때의 피부 수분함량과 사용 전 수분함량의 수분함량 증가율을 측정하였으며 측정 결과는 하기 표 4에 나타낸 것과 같다.
구분 시간에 따른 피부 수분 함량(AU) 피부 수분함량 증가율((사용후-사용전)/사용전))
사용전 10분 20분 30분 60분 120분 120분
제조예 1 27.9 38.3 43.6 46.2 47.3 48.7 74.6%
제조예 2 28.1 38.8 44.1 47.3 48.1 49.4 75.8%
제조예 3 28.5 33.9 36.5 38.2 38.9 39.4 38.2%
제조예 4 28.3 38.6 43.2 46.1 47.2 48.4 71.0%
제조예 5 28.2 38.7 43.5 46.2 47.5 49.4 75.2%
상기 방법에 의한 보습력 측정 결과, 지의류 유래 미네랄을 함유하지 않고 배양한 갈락토미세스 발효물질을 포함한 화장료 표준시료에 비해 지의류 유래 미네랄을 함유하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물질을 포함한 화장료 표준시료를 도포한 피부의 수분 함량이 높은 것으로 나타났으며, 시간차 발효 방법으로 배양한 경우가 시간차 발효방법이 아닌 연속된 발효 방법으로 배양한 경우보다 수분 함량이 높은 것을 확인하였다.
6. 미백 효과 - 멜라닌 함량 분석
본 발명의 지의류 유래 미네랄을 첨가하여 배양한 갈락토미세스 복합 의 미백효과와 관련 멜라닌 생성 억제능력을 확인하기 위하여, 멜라닌 유도 물질인 α-MSH를 피부암세포에 함께 처리하여 배양한 뒤 실시예와 비교예 1 및 2의 복합 발효물을 0.1, 0.5% 로 각각 처리하여 3일간 배양 후 세포를 모았다. 모아진 세포를 1N NaOH 1mL을 가한 후 가열하여 세포를 완전히 녹인 뒤 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 미백활성 보유 물질로 잘 알려진 알부틴(Arbutin)을 0.005%로 사용하였으며, 측정 결과는 하기 표 5에 나타낸 것과 같다
구분 농도(%) 멜라닌 추출(%)
실시예 1 0.1 92.43
0.5 82.34
실시예 2 0.1 91.67
0.5 80.17
비교예 1 0.1 156.45
0.5 123.03
비교예 2 0.1 132.24
0.5 107.47
비교예 3 0.1 92.01
0.5 81.63
알부틴 0.005 57.24
상기 방법에 의한 멜라닌 추출 분석 결과, 지의류 유래 미네랄을 함유하지 않고 배양한 갈락토미세스 복합 발효물질에 비해 지의류 유래 미네랄을 함유하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물질이 멜라닌이 적은 양으로 추출된 것으로 나타났으며, 시간차 발효 방법으로 배양한 경우가 시간차 발효방법이 아닌 연속된 발효 방법으로 배양한 경우보다 멜라닌이 더욱 적은 양으로 추출된 것을 확인되어 우수한 미백활성을 갖는 것을 알 수 있다.
7. 미백 효과 - 티록시나아제(Tyrosinase) 활성 억제
본 발명의 지의류 유래 미네랄을 첨가하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물의 미백효과와 관련 티록시나아제(Tyrosinase) 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, 마우스 피부암세포(B16F10)를 페니실린(100IU/ml), 스트렙토마이신(100μg/ml), 10% FBS를 함유하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37℃, 5% CO2를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.
갈락토미세스 복합 발효물의 티로시나아제(Tyrosinase) 억제능을 확인하기 위하여, 상기 제조된 갈락토미세스 복합발효물과 멜라닌 유도 물질인 α-MSH를 세포에 함께 처리하여 3일간 배양 후 RNA를 추출하여 RT-PCR을 시행하였다. 증폭된 유전자는 Gel documentation system과 Image J 프로그램을 이용하여 분석하였다. 대조군으로는 미백활성 보유 물질로 잘 알려진 알부틴(Arbutin)을 0.005%로 사용하였으며, 측정 결과는 하기 표 6에 나타낸 것과 같다
구분 농도(%) Tyrosinase mRNA발현율(%)
실시예 1 0.1 94.38
0.5 83.23
실시예 2 0.1 93.47
0.5 81.25
비교예 1 0.1 178.45
0.5 173.03
비교예 2 0.1 158.33
0.5 128.97
비교예 3 0.1 93.86
0.5 81.93
알부틴 0.005 62.24
상기 방법에 의한 티로시나아제(Tyrosinase) mRNA 발현양 분석 결과, 지의류 유래 미네랄을 함유하지 않고 배양한 갈락토미세스 복합 발효물질에 비해 지의류 유래 미네랄을 함유하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물질이 티로시나아제(Tyrosinase) mRNA가 적은 양으로 추출된 것으로 나타났으며, 시간차 발효 방법으로 배양한 경우가 시간차 발효방법이 아닌 연속된 발효 방법으로 배양한 경우보다 티로시나아제(Tyrosynase) mRNA가 더욱 적은 양으로 추출된 것을 확인되었다. 이는 본 발명의 갈락토미세스 복합 발효물에 의한 멜라닌 억제가 멜라닌 생성반응의 핵심 단백질인 티로시나아제(tyrosinase) 효소 활성 억제에 기인함을 알 수 있다.
8. 미백 효과 - 피부 밝기 변화
본 발명의 지의류 유래 미네랄을 첨가하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물로 제조된 화장료 표준시료의 피부 밝기 변화를 확인하기 위하여, 피부밝기 개선 평가를 위해 분광광도계(Spectrophotometer CR-2600D, Konica Minolta, Inc., Japan)를 적용하여 피시험자의 안면 오른쪽 볼 부위에 3번 연속하여 측정하고, 그 평균값을 계산하여 분석에 적용하였다. 기기 측정은 시험물질 적용 전과 적용 2주, 4주 후의 시점에서 이루어졌으며, 분광광도계의 측정값은 L*, a*, b* 3가지 인자로 구성되어 있으며, L*값은 명암(brightness), a*값은 붉은색(redness), b*값은 노란색(yellowness)을 나타낸다. 따라서 피부밝기를 측정하는 값으로는 L* value 값을 분석에 적용한 결과는 하기 표 7과 같다.
구분 사용 전 사용 2주차 사용 4주차
실시예 1 55.47 58.75 59.46
실시예 2 55.35 58.72 59.63
비교예 1 55.45 57.27 58.40
비교예 2 55.46 58.12 58.97
비교예 3 55.42 58.77 59.49
상기 방법에 의한 피부 밝기 변화 측정 결과, 실시예 1 및 2, 비교예 1 내지 3 모두 L* value 평균값이 사용 전, 사용 2주차, 사용 4주차로 진행될수록 증가한 것을 확인할 수 있었다.단, 지의류 유래 미네랄을 함유하지 않고 배양한 갈락토미세스 복합 발효물질로 제조한 화장료 표준시료에 비해 지의류 유래 미네랄을 함유하여 배양한 갈락토미세스 복합 발효물질로 제조한 화장료 표준시료가 L* value 평균값이 컸으며, 시간차 발효 방법으로 배양한 경우가 시간차 발효방법이 아닌 연속된 발효 방법으로 배양한 경우보다 L* value 평균값이 큰 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 피부밝기 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다.
전술한 각 실시예에서 예시된 특징, 구조, 효과 등은 실시예들이 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자에 의하여 다른 실시예들에 대해서도 조합 또는 변형되어 실시 가능하다. 따라서 이러한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (19)

  1. 지의류 유래 미네랄을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  2. 제 1항에 있어서,
    배지에 접종균을 배양하는 단계(S210);
    상기 접종균을 배양한 배지에 갈락토미세스(galactomuces)를 접종하여 1차 배양하는 단계(S220);
    상기 1차 배양한 배지에 지의류 유래 미네랄을 첨가하는 단계(S230);
    상기 지의류 유래 미네랄을 첨가한 배지를 12시간 내지 24시간 동안 2차 배양하고, 2차 배양물 중 1/3은 분리하는 1차 시간차 발효 및 분리단계(S240);
    상기 2차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 추가로 6시간 내지 12시간(누적 18시간 내지 36시간) 동안 3차 배양하고, 상기 3차 배양물 중 1/2를 분리하는 2차 시간차 발효 및 분리단계(S250);
    상기 3차 배양물 중 분리되고 남은 배양물이 포함된 배지를 추가로 12시간 내지 24시간(누적 30시간 내지 60시간) 동안 4차 배양하고 4차 배양한 배양물을 분리하는 3차 시간차 발효 및 분리단계(S260);
    상기 1차 내지 3차 시간차 발효 및 분리단계에서 분리한 1 내지 3차 시간차 발효물을 혼합 교반하는 단계(S270); 및
    상기 혼합 교반물을 여과 및 배출하는 단계(S280);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 접종균은 효모균(Saccharomyces), 유산균(Lactobacillus), 고초균(Bacillus), 누룩균(Aspergillus) 또는 광합성균(Rhodobacter)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 접종균을 배양한 배지에 갈락토미세스(galactomuces)를 접종하여 배양하는 단계는 상기 배지의 접종균이 차지하는 전체 비중 대비 상기 갈락토미세스(galactomuces)를 5% 내지 10% 비중으로 접종하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 1차 시간차 발효 및 분리단계는 상기 2차 배양물 중 1/3을 분리하는 단계(S241);
    상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S242); 및
    파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S243);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 2차 시간차 발효 및 분리단계는 상기 3차 배양물 중 1/2을 분리하는 단계(S251);
    상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S252); 및
    파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S253);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 3차 시간차 발효 및 분리단계는 상기 4차 배양물을 분리하는 단계(S261);
    상기 분리된 배양물을 파쇄하는 단계(S262); 및
    파쇄된 배양물을 원심분리 및 여과하는 단계(S263);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 접종균을 배양한 배지에 갈락토미세스(galactomuces)를 접종하여 배양하는 단계는 상기 배지의 접종균이 차지하는 전체 비중 대비 상기 갈락토미세스(galactomuces)를 5% 내지 10% 비중으로 접종하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  9. 제 2항에 있어서,
    상기 지의류 유래 미네랄은
    지의류 선정하는 단계(S110);
    상기 선정된 지의류를 세척 및 건조하는 단계(S120);
    상기 세척 및 건조된 지의류를 분쇄하는 단계(S130);
    상기 분쇄물로부터 미네랄 복합물을 추출하는 단계(S140);
    상기 미네랄 복합물을 탈염 및 여과하는 단계(S150); 및
    상기 탈염 및 여과 후 동결건조하는 단계(S160);를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  10. 제 2항에 있어서,
    상기 지의류 유래 미네랄은 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina, conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia), 잔토파르멜리아 파리노스( Xanthoparmelia farinose), 디플로시아 카네센스(Diplocia canescens), 세트라리아 아큘레아테(Cetraria aculeate), 클라도니아 푸르카타(Cladonia furcata), 슈데페베 푸베센스(Pseudephebe pubescens), 스파에로 글로보서스(Sphaerophorus globosus), 스테레오카우론 알피눔(Stereocaulon alpinum), 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 우스네아 안타르티카(Usnea antarctica), 우스네아 롱기시마(Usnea longissima), 우스네아 바르바타(Usnea barbata) 및 우스네아 아우란티아코아트라(Usnea aurantiacoatra) 또는 스틱타 니란데리아나(Stictanylanderiana)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상의 지의류로부터 유래한 미네랄을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  11. 제 2항에 있어서, 상기 지의류 유래 미네랄은 Na, Fe, K, Mg, Al, Mn, Si, Ca, Zn, I, S, P, Se, Mg 또는 이들의 약학적 또는 화장품학적 허용 가능한 미네랄을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 미네랄을 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  12. 제 2항에 있어서,
    상기 지의류 유래 미네랄을 첨가하는 단계는 상기 지의류 유래 미네랄을 상기 접종균 및 갈락토미세스(galactomuces)를 혼합 배양한 배지 대비 0.01 중량% 내지 0.5 중량% 첨가하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  13. 제 2항에 있어서,
    상기 2 내지 4차 배양하는 단계는 25℃ 내지 36℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  14. 제 9항에 있어서,
    상기 세척 및 건조하는 단계는 상기 지의류를 정제수로 세척한 후 수분 함량이 10% 이하가 되도록 건조하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  15. 제 9항에 있어서,
    상기 분쇄하는 단계는 350um 내지 2,000um 크기로 분쇄하는 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  16. 제 9항에 있어서, 분쇄물로부터 미네랄 복합물을 추출하는 단계는 상기 분쇄물을 정제수 대비 0.05중량% 내지 0.5중량%로 분산하고, 60℃ 내지 120℃에서 1h 내지 6h 동안 5rpm 내지 30 rpm으로 교반하여 추출하는 단계를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  17. 제 9항에 있어서,
    교반하여 추출하는 단계는 사과산(말산), 구연산(시트르산), 푸마르산, 주석산, 옥살산, 프로피온산 또는 젖산 등을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그 이상의 유기산을 첨가하는 단계를 포함하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 유기산은 상기 정제수 및 상기 분쇄물로 이루어진 혼합물 대비 0.01중량% 내지 2.0중량%인 것을 특징으로 하는 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 갈락토미세스(galactomyces)의 시간차 발효방법에 의해 생산된 물질을 이용한 화장료 조성물.
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