CN101638623A

CN101638623A - 一种用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法

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Publication number: CN101638623A
Application number: CN200910111656A
Authority: CN
Inventors: 江斌; 吴松刚; 黄建忠
Original assignee: Inner Mongolia Kingdomway Pharmaceutical Co Ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Current assignee: Inner Mongolia Kingdomway Pharmaceutical Co Ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Priority date: 2009-05-06
Filing date: 2009-05-06
Publication date: 2010-02-03

Abstract

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制配方法。具体是：在新鲜麸皮，加水煮沸0.5－1.5小时，过滤出麸皮浸汁备用。麸皮与水的比例(g/mL)为1～1.6∶2～3。取麸皮浸汁，按麸皮浸汁的体积(L)，每升麸皮浸汁分别加入44～100g葡萄糖，0.5～2.0g的KH₂PO₄，搅拌溶解，调节浸汁液的pH为6.0～6.4之间。然后置于摇床上，培养时间2～3天，培养出种子培养基。按100mL孢子悬液加8～10mL种子培养基，加入到在摇床上继续扩大培养2～3天，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。本发明工艺简便，成本低，花生四烯酸合成稳定，产量高，适合工业化生产。

Description

一种用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵法生产花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称AA)的种子培养基制配方法。

技术背景

花生四烯酸是全顺式Δ-5，8，11，14-二十碳四烯酸，化学式为CH₃(CH₂)₄(CH＝CH-CH₂)₄(CH₂)₂COOH，花生四烯酸属于ω-6脂肪酸，由于人体内不具备相应的酶系统来合成特定的不饱和双键，因此被认为是人体必需脂肪酸。在多数花生四烯酸代谢途径中，它被磷醋化形成细胞膜磷脂，对维持细胞膜结构非常关键。因其含有4个不饱和双键，使得分子具有很大的流动性，即使在0℃以下也能保持液体状态，这也保证了在生理温度下哺乳动物的细胞膜具有一定的流动性。同时它还参与调节各种细胞活动，如调节细胞增殖、细胞生长、调节免疫系统功能(Weems YS，et al.，2007，Prostaglandins Other LipidMediat.84：163-173.)等；此外它对婴幼儿的神经系统，尤其是大脑的发育至关重要(Maekawa M，et al.，2009，PLoS ONE.4：5085.)。另外，双键也是花生四烯酸抗氧化作用的来源，它可以在无酶介导的条件下发生氧化反应，也可以通过以下三种氧化酶进行反应：环氧化酶(cycloocygenase，COX)、脂氧化酶(lipoxygenase，LOX)、细胞色素P450，其反应产物包括前列腺素、血栓烷、白细胞三烯(Zarini S，et al.，2006，J Biol Chem.281：10134-10142.)以及其他生物活性产物。而这些生物活性物质对细胞信号传导、蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用，且花生四烯酸本身也具有很好的生物活性(Cowpland C，et al.，2006，Clin ExpPharmacol Physiol.33：183-188.)。研究发现，当用葡萄糖和卡巴可(carbacol)刺激细胞后，花生四烯酸的含量分别增加一倍和十倍，推测相关的生理反应都可能由释放的花生四烯酸来介导(Liu BH，et al.，2005，J Anim Sci.83：1516-1525.)。花生四烯酸作为人体必需脂肪酸发挥着无可替代的作用，其应用前景广阔。

花生四烯酸主要来源有植物、动物组织、鱼油以及微生物和微藻类等，但花生四烯酸在动物组织中含量低，一般小于0.2％(wt/wt)，来源也有限，而微生物发酵法则为生产花生四烯酸开辟了新途径，它具有不受原材料及气候限制、生长周期短、培养工艺简单、花生四烯酸含量高等特点，近几年已成为国内外研究的热点。尤其是日本、美国等国家已先后问世了卜亚麻酸、二高-Y一亚麻酸、花生四烯酸的发酵产品，现正着手开发二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸的发酵产品。国内在这一领域的研究起步较晚，虽对微生物发酵生产花生四烯酸的发酵培养基作了初步的研究，但还存在着利用现有的培养基培养的花生四烯酸生物量偏低，生长周期长的问题，因此离大规模生产还存在一定的距离。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案，其发酵制配方法如下：

1、花生四烯酸的种子培养基的制备

(1)新鲜麸皮，加水煮沸0.5-1.5小时，过滤出麸皮浸汁备用。麸皮与水的比例(g/mL)为1～1.6∶2～3。

(2)取麸皮浸汁，按麸皮浸汁的体积(L)，每升麸皮浸汁分别加入44～100g葡萄糖，0.5～2.0g的KH₂PO₄，搅拌溶解，用少量H₃PO₄调节浸汁液的pH为6.0～6.4之间。然后置于摇床上，培养温度24～26℃，摇床转速为150～200rpm，培养时间2～3天，培养出种子培养基。

(3)采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种，经斜面活化后，加8～14ml无菌水洗下孢子，制成孢子悬液。按100mL种子培养基加8～10mL孢子悬液的比例，在摇床上继续扩大培养2～3天，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。

2、花生四烯酸发酵培养

在发酵法生产花生四烯酸的发酵培养基中，按100mL发酵培养基接入本发明制备的种子培养基18-25mL，发酵培养7～8天。发酵结束后，抽滤，收集菌体经烘干、粉碎、石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：原料易购，价格低廉，花生四烯酸合成稳定，产量在1.35-1.55g/L，发酵过程简单易行，操作简便，适合工业化生产。

具体实施方式

实施例1：

1、花生四烯酸的种子培养基的制备

(1)新鲜麸皮600g，加水1000mL，煮沸1小时，取出浸汁，备用。

(2)麸皮浸汁1000mL，葡萄糖100g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，用少量H₃PO₄调节浸汁液的pH至6.2。然后置于摇床上，培养温度为26℃，摇瓶转速为200rpm，培养2天。

(3)按500mL摇瓶装100mL种子培养基，然后采用普通的产花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌种活化后，用8mL无菌水洗下孢子，按每100mL种子培养基加入8mL孢子悬液接入摇瓶中，并按(2)中的种子培养条件进行种子扩大培养，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。

2、发酵培养：

在发酵培养基，加入备用的种子培养基，形成混合培养基，混合培养基中种子培养基和发酵培养基的体积比例为1∶1～10；保持混合培养基的温度在26℃～20℃之间，搅拌并通气，搅拌转速为100-250rpm，通气量为1.5-2.0vvm，进行培养，培养时间7～8天。发酵结束后，抽滤，收集菌体40-60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。

2、花生四烯酸发酵培养

在发酵法生产花生四烯酸的发酵培养基中，按100mL发酵培养基接入本发明制备的种子扩大培养基25mL，发酵培养8天。发酵结束后，抽滤，收集菌体60℃烘干至恒重、粉碎，采用石油醚溶剂提取油脂；气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。

实施例2：

1、花生四烯酸的种子培养基的制备

(1)新鲜麸皮400g，加水800mL，煮沸0.5小时，取出浸汁，备用。

(2)麸皮浸汁1000mL，葡萄糖60g/L，KH₂PO₄ 2g/L，pH 6.4。培养条件：培养温度为24℃，摇瓶转速为200rmp，培养3天。

(3)按500mL摇瓶装100mL种子培养液，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌种、经斜面活化后，加8mL无菌水、洗下孢子。制成孢子悬液，按每100mL种子培养基加14mL孢子悬液。再按(2)的种子培养条件进行种子扩大培养，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。

2、花生四烯酸发酵培养

在发酵法生产花生四烯酸的发酵培养基中，按100mL发酵培养基接入本发明制备的种子扩大培养基18mL，发酵培养7天。发酵结束后，抽滤，收集菌体，至55℃烘干至恒重，粉碎，石油醚萃取，气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。

实施例3

1、花生四烯酸的种子培养基的制备

(1)新鲜麸皮660g，加水1800mL，煮沸1.5小时，取出浸汁，备用。

(2)麸皮浸汁1200mL，葡萄糖53g/L，KH₂PO₄ 0.6g/L，pH 6.0。培养温度为24℃，摇瓶转速为150rpm，培养3天。

(3)按500mL摇瓶装100mL种子培养基，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉斜面保裁菌种、经斜面活化后，加10mL无菌水、洗下孢子，制成孢子悬液。按每100mL种子培养基加12mL孢子悬液，再按(2)的种子培养条件进行种子扩大培养，获得用于发酵法生产花生四烯酸发酵的种子扩大培养基。

2、发酵培养：

在发酵法生产花生四烯酸的发酵培养基中，按100mL发酵培养基接入本发明制备的种子扩大培养基20mL，发酵培养7天。发酵结束后，抽滤，收集菌体，至50℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。

实施例4：

1、花生四烯酸的种子培养基的制备

(1)新鲜麸皮900g，加水1100mL，煮沸1小时，取出浸汁，备用。

(2)麸皮浸汁1000mL，葡萄糖76g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L，pH 6.5。种子培养条件：培养温度为26℃，摇瓶转速为200rpm，培养2天。

(3)按500mL摇瓶装100mL种子培养基，然后采用产花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌种、经斜面活化后，加14mL无菌水、洗下孢子，制成饱子悬液。按每100mL种子培养基加10mL孢子悬液，再按(2)的种子培养条件进行种子扩大培养，获得花生四烯酸发酵生产用的种子扩大培养基。

2、发酵培养：

在发酵法生产花生四烯酸的发酵培养基中，按100mL发酵培养基接入本发明制备的种子扩大培养基20mL，发酵培养8天。发酵结束后，抽滤，收集菌体，至60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得龙生四烯酸纯品。

Claims

1、一种用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法，其特征是：

(1)新鲜麸皮，加水煮沸0.5-1.5小时，过滤出麸皮浸汁备用；

(2)取麸皮浸汁，分别加入葡萄糖、KH₂PO₄，搅拌溶解，用少量H₃PO₄调节浸汁液的pH为6.0～6.4之间，然后置于摇床上，培养温度24～26℃，摇床转速为150～200rpm，培养时间2～3天。

(3)采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种，经斜面活化后，加8～14ml无菌水洗下孢子，制成孢子悬液，加入种子培养基，在摇床上继续扩大培养2～3天。

2、根据权利要求1所述的用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法，其特征是麸皮与水的重量体积比例为1～1.6∶2～3。

3、根据权利要求1所述的用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法，其特征是麸皮浸汁中加入的葡萄糖量是每升麸皮浸汁加44～100g。

4、根据权利要求1所述的用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法，其特征是麸皮浸汁中加入的KH₂PO₄量是每升麸皮浸汁加0.5～2.0g。

5、根据权利要求1所述的用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法，其特征是所述的摇床培养条件是：温度24～26℃，摇床转速为150～200rpm，培养时间2～3天。