CN113846043A - 一种辅酶q10生产菌种的培养方法 - Google Patents

一种辅酶q10生产菌种的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种辅酶q10生产菌种的培养方法，所述辅酶q10生产菌种的培养方法包括：培养基的制备、菌种分纯、母瓶接种、二级瓶接种和三级发酵瓶接种。本发明通过对斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基的配方改进，能够加速菌种的生长，迟缓期短，并且工业化的大批量稳定的生产菌种，能够提高菌种的辅酶生产量，生理状态稳定，保持稳定的生产能力；简化扩种工艺，更易安排发酵过程。

Description

一种辅酶q10生产菌种的培养方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种辅酶q10生产菌种的培养方法。
背景技术
辅酶q10(2，3二甲氧基-5-甲基6癸异戊烯基苯醌，CoenzymeQ10，CoQ10)，又名泛醌，癸烯醌，广泛存在于动物、植物及微生物体内，是生物细胞呼吸链中的重要递氢体。辅酶q10是一种重要的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。同时，辅酶q10还具有抗衰老作用，在化妆品和保健品领域有广泛的市场。
辅酶q10的制备方法主要有3种，即动植物组织提取、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动物辅酶q10含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法在技术上比较成熟，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，生产成本高，限制其工业化生产的程度。微生物发酵法由于原料廉价丰富，产物分离过程相对简单，产物为天然品，不存在异构体问题，生物活性好，易被人体吸收，且可以通过发酵罐实现规模化工业化生产，因此成为最有发展潜力的辅酶q10生产方法。
目前国内的辅酶q10的市场需求呈逐年增长之势，但是目前所使用的培养基在培养辅酶q10生产菌种时，菌种的生长速度缓慢，并且菌种在发酵过程中所生产的辅酶q10的产量也不高，已经远不能满足市场的需求。
因此，亟需提供一种辅酶q10生产菌种的培养方法，能够提高菌种的生长速度，并提高菌种生产辅酶q10的产量。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种辅酶q10生产菌种的培养方法，该方法能够提高菌种的生长速度，并提高菌种生产辅酶q10的产量。
一种辅酶q10生产菌种的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
S1、培养基的制备：
分别制备斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基；
其中，所述斜面培养基的配方为：硫酸铵2.5g/L、L-谷氨酸钠1g/L、玉米浆干粉2g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠2g/L、琼脂粉18g/L、纯化水和辅液I；
S2、菌种分纯：
挑起生长正常、墨绿、光滑圆润优良、直径1mm～2mm的单菌落，放入9mL无菌生理盐水进行制备菌悬液，吸取1mL进入下一支试管，分纯到6次方按0.2～0.4mL在斜面培养基上进行平板涂布，将斜面培养基放入培养室两层纱布盖好培养，培养条件为：温度32℃，湿度45～50％，时间5～6天；
S3、母瓶接种：
挑起生长正常、墨绿、光滑圆润优良的单菌落24～36颗，接种到盛放有母瓶培养基的100mL/锥形瓶中，100mL/锥形瓶进行纱布封口传入培养室摇床，培养条件为：温度32℃，转速180r/min～220r/min，培养时间28～32h，pH6.2～6.5；
S4、二级瓶接种：
对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L；菌浓OD≥7.0；湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入种子培养基中，将盛放有种子培养基的100mL/锥形瓶通过纱布包扎好，传入培养室摇床培养，培养调节为：时间18～22h，温度32℃，转速180r/min～220r/min；
S5、三级发酵瓶接种：
对种子培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45g～50g/L时，培养好的母瓶菌种按20％的量转入发酵培养基，包扎好传入摇床培养室培养24h～48h下摇床检测，培养调节为：温度34℃，转速180r/min～200r/min。
进一步地，在所述步骤S1中，所述辅液I的配方为：VB10.01g/L、VB20.001g/L、VB60.00172g/L、烟酸0.0114g/L、烟酰酸0.0114g/L、叶酸0.00052g/L、泛酸钙0.0002g/L和生物素0.00036g/L。
进一步地，在所述步骤S1中，所述斜面培养基的制备方法为：称取18g/L的琼脂粉倒入三角瓶中，按比例称取：硫酸铵、L-谷氨酸钠、玉米浆干粉、一水硫酸锰、六水氯化钴、葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁和氯化钠加入适量的水进行热溶解，加入已配制好的六水氯化钴、氯化胆碱及辅液I使充分溶解，补足水量，测定其原始pH记录，混合均匀后按每三角瓶装500mL/瓶的量进行分装，塞上棉塞，包好防水纸，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌30分钟，灭菌后放洁净台冷却至50℃，无菌室洁净台制斜面培养基平板待接种用。
进一步地，在所述步骤S1中，所述母瓶培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱0.004g/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；
所述母瓶培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、纯化水、碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布包扎，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需的辅液I装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL。
进一步地，所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，在步骤S4中，
对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥7.0，湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入一级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥10.0，湿重35～40g/L时，将一级种子培养基中的菌种按10％的量转入二级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45～50g/L时再进行步骤S5的操作。
进一步地，
在步骤S4中，所述一级种子培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱0.004g/L、消泡剂0.3ml/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；
一级种子培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、消泡剂、纯化水、碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需已经配制保藏辅液I装入500mL的三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL。
进一步地，
在步骤S4中，所述二级种子培养基配方：硫酸铵3.0g/L、酵母粉2.0g/L、玉米浆干粉1.0g/L、味精0.75g/L、磷酸二氢钾0.75g/L、磷酸氢二钾0.75g/L、葡萄糖12.0g/L、七水硫酸亚铁0.18g/L、七水硫酸镁3.5g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.05g/L、六水氯化钴0.015g/L、氯化胆碱0.0065g/L、碳酸钙8g/L、消泡剂0.2mL/L、纯化水、pH6.4～6.5和辅液II；
所述辅液II配方：VB10.02g/L、VB20.002g/L、VB60.00344g/L、烟酸0.0228g/L、烟酰酸0.0228g/L、叶酸0.00104g/L、泛酸钙0.0004g/L和生物素0.00072g/L；
所述二级种子培养基的制备方法：称取物料，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始PH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需已经配制保藏辅液II装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液II2mL/100mL。
进一步地，在步骤5中，所述发酵培养基配方：硫酸铵3.3g/L、玉米浆干粉4.4g/L、味精3.3g/L、磷酸二氢钾0.56g/L、七水硫酸亚铁1.56g/L、七水硫酸镁14.44g/L、氯化钠2.89g/L、一水硫酸锰0.07g/L、氯化钙0.09g/L、消泡剂0.0063g/L、葡萄糖13.5g/L、氯化胆碱0.0033g/L、纯化水和辅液III、pH6.4～6.5；
辅液III配方：VB10.00648g/L、VB20.00065g/L、VB60.00119g/L、烟酸0.00739g/L、烟酰酸0.00739g/L、叶酸0.00035g/L、泛酸钙0.00012g/L和生物素0.00023g/L；
所述发酵培养基的配制方法：称取物料，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH，按150mL/500mL大挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加一层防水纸进行包扎，取所需已经配制好的辅液III装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液III4mL/200mL。
进一步地，在步骤S4中，残糖测定的方法为：取发酵液10mL分装于两只试管中，离心5min，取1mL上清液加1mL蒸馏水和1.5mL 3,5-二硝基水杨酸混合均匀，在沸水中加入5min，取出后立即用水冷却至室温，再向试管中加入21.5mL蒸馏水混匀，于520nm波长处测A值，将A带入标准曲线计算还原糖。
进一步地，还包括步骤S6、菌种的保藏：菌种用30～35％的甘油制作成的甘油管-20℃或-80℃冷冻保藏。
本发明通过对斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基的配方改进，能够加速菌种的生长，迟缓期短，并且工业化的大批量稳定的生产菌种，能够提高菌种的辅酶生产量，生理状态稳定，保持稳定的生产能力；简化扩种工艺，更易安排发酵过程。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中详细阐述，并且，将特征和优点部分通过说明书的阐述变得显而易见，或者通过实施本说明书而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出本发明实施例中辅酶q10生产菌种的培养方法流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例介绍一种辅酶q10生产菌种的培养方法，用于解决目前所使用的培养基在培养辅酶q10生产菌种时，菌种的生长速度缓慢，并且菌种在发酵过程中所生产的辅酶q10的产量也不高，已经远不能满足市场的需求的问题。
下面提供一种较佳的实施例
如图1所示，一种辅酶q10生产菌种的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
S1、培养基的制备：
分别制备斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基；其中，所述斜面培养基的配方为：硫酸铵2.5g/L、L-谷氨酸钠1g/L、玉米浆干粉2g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、葡萄糖10g/L(分消)、酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠2g/L、琼脂粉18g/L、纯化水和辅液I；辅液I的配方为：VB10.01g/L、VB20.001g/L、VB60.00172g/L、烟酸0.0114g/L、烟酰酸0.0114g/L、叶酸0.00052g/L、泛酸钙0.0002g/L、生物素0.00036g/L；斜面培养基的制备方法为：称取18g/L的琼脂粉倒入三角瓶中，按比例称取：硫酸铵、L-谷氨酸钠、玉米浆干粉、一水硫酸锰、六水氯化钴、葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁和氯化钠加入适量的水进行热溶解，加入已配制好的六水氯化钴、氯化胆碱及辅液I使充分溶解，补足水量，测定其原始pH记录，混合均匀后按每三角瓶装500mL/瓶的量进行分装，塞上棉塞，包好防水纸，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌30分钟，灭菌后放洁净台冷却至50℃，无菌室洁净台制斜面培养基平板待接种用；
母瓶培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱0.004g/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；所述母瓶培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、纯化水和碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布包扎，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需的辅液I装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL；
一级种子培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱0.004g/L、消泡剂0.3ml/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；
一级种子培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、消泡剂、纯化水和碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需已经配制保藏辅液I装入500mL的三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL；
二级种子培养基配方：硫酸铵3.0g/L、酵母粉2.0g/L、玉米浆干粉1.0g/L、味精0.75g/L、磷酸二氢钾0.75g/L、磷酸氢二钾0.75g/L、葡萄糖12.0g/L、七水硫酸亚铁0.18g/L、七水硫酸镁3.5g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.05g/L、六水氯化钴0.015g/L、氯化胆碱0.0065g/L、碳酸钙8g/L、消泡剂0.2mL/L、纯化水、pH6.4～6.5和辅液II；
所述辅液II配方：VB10.02g/L、VB20.002g/L、VB60.00344g/L、烟酸0.0228g/L、烟酰酸0.0228g/L、叶酸0.00104g/L、泛酸钙0.0004g/L和生物素0.00072g/L；
所述二级种子培养基的制备方法：称取物料，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始PH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需已经配制保藏辅液II装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液II2mL/100mL；
发酵培养基配方：硫酸铵3.3g/L、玉米浆干粉4.4g/L、味精3.3g/L、磷酸二氢钾0.56g/L、七水硫酸亚铁1.56g/L、七水硫酸镁14.44g/L、氯化钠2.89g/L、一水硫酸锰0.07g/L、氯化钙0.09g/L、消泡剂0.0063g/L、葡萄糖13.5g/L、氯化胆碱0.0033g/L、纯化水、辅液III和pH6.4～6.5；
辅液III配方：VB10.00648g/L、VB20.00065g/L、VB60.00119g/L、烟酸0.00739g/L、烟酰酸0.00739g/L、叶酸0.00035g/L、泛酸钙0.00012g/L和生物素0.00023g/L。
所述发酵培养基的配制方法：称取物料，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH，按150mL/500mL大挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加一层防水纸进行包扎，取所需已经配制好的辅液III装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液III4mL/200mL；
S2、菌种分纯：
挑起生长正常、墨绿、光滑圆润优良、直径1mm～2mm的单菌落，放入9mL无菌生理盐水进行制备菌悬液，吸取1mL进入下一支试管，分纯到6次方按0.2～0.4mL在斜面培养基上进行平板涂布，将斜面培养基放入培养室两层纱布盖好培养，培养条件为：温度32℃，湿度45～50％，时间5～6天；
S3、母瓶接种：
挑起生长正常、墨绿、光滑圆润优良的单菌落24～36颗，接种到盛放有母瓶培养基的100mL/锥形瓶中，100mL/锥形瓶进行纱布封口传入培养室摇床，培养条件为：温度32℃，转速180r/min～220r/min，培养时间28～32h，pH6.2～6.5；
S4、二级瓶接种：
对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L；菌浓OD≥7.0；湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入种子培养基中，将盛放有种子培养基的100mL/锥形瓶通过纱布包扎好，传入培养室摇床培养，培养调节为：时间18～22h、温度32℃、转速180r/min～220r/min；其中，所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥7.0，湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入一级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥10.0，湿重35～40g/L时，将一级种子培养基中的菌种按10％的量转入二级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45～50g/L时再进行后续的操作。
S5、三级发酵瓶接种：
对种子培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45g～50g/L时，培养好的母瓶菌种按20％的量转入发酵培养基，包扎好传入摇床培养室培养24h～48h下摇床检测，培养调节为：温度34℃，转速180r/min～200r/min。
在步骤S4中，残糖测定的方法为：取发酵液10mL分装于两只试管中，离心5min，取1mL上清液加1mL蒸馏水和1.5mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)混合均匀，在沸水中加入5min，取出后立即用水冷却至室温，再向试管中加入21.5mL蒸馏水混匀，于520nm波长处测A值，将A带入标准曲线计算还原糖。
S6、菌种的保藏：菌种用30～35％的甘油制作成的甘油管-20℃或-80℃冷冻保藏。
通过对斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基的配方改进，能够加速菌种的生长，迟缓期短，并且工业化的大批量稳定的生产菌种，能够提高菌种的辅酶生产量，生理状态稳定，保持稳定的生产能力；简化扩种工艺，更易安排发酵过程。
本领域的普通技术人员应当理解：尽管参考前述实施例对本发明进行的详细说明，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
S1、培养基的制备：
分别制备斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基；
其中，所述斜面培养基的配方为：硫酸铵2.5g/L、L-谷氨酸钠1g/L、玉米浆干粉2g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠2g/L、琼脂粉18g/L、纯化水和辅液I；
S2、菌种分纯：
挑起直径1mm～2mm的单菌落，放入9mL无菌生理盐水进行制备菌悬液，吸取1mL进入下一支试管，分纯到6次方按0.2～0.4mL在斜面培养基上进行平板涂布，将斜面培养基放入培养室两层纱布盖好培养，培养条件为：温度32℃，湿度45～50％，时间5～6天；
S3、母瓶接种：
挑起的单菌落24～36颗，接种到盛放有母瓶培养基的100mL/锥形瓶中，100mL/锥形瓶进行纱布封口传入培养室摇床，培养条件为：温度32℃，转速180r/min～220r/min，培养时间28～32h，pH6.2～6.5；
S4、二级瓶接种：
对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L；菌浓OD≥7.0；湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入种子培养基中，将盛放有种子培养基的100mL/锥形瓶通过纱布包扎好，传入培养室摇床培养，培养调节为：时间18～22h，温度32℃，转速180r/min～220r/min；
S5、三级发酵瓶接种：
对种子培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45g～50g/L时，培养好的母瓶菌种按20％的量转入发酵培养基，包扎好传入摇床培养室培养24h～48h下摇床检测，培养调节为：温度34℃，转速180r/min～200r/min。
2.根据权利要求1所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
在所述步骤S1中，所述辅液I的配方为：VB10.01g/L、VB20.001g/L、VB60.00172g/L、烟酸0.0114g/L、烟酰酸0.0114g/L、叶酸0.00052g/L、泛酸钙0.0002g/L和生物素0.00036g/L。
3.根据权利要求2所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
在所述步骤S1中，所述斜面培养基的制备方法为：称取18g/L的琼脂粉倒入三角瓶中，按比例称取：硫酸铵、L-谷氨酸钠、玉米浆干粉、一水硫酸锰、六水氯化钴、葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁和氯化钠加入适量的水进行热溶解，加入已配制好的六水氯化钴、氯化胆碱及辅液I使充分溶解，补足水量，测定其原始pH记录，混合均匀后按每三角瓶装500mL/瓶的量进行分装，塞上棉塞，包好防水纸，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌30分钟，灭菌后放洁净台冷却至50℃，在无菌室洁净台制斜面培养基平板待接种用。
4.根据权利要求3所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
在所述步骤S1中，所述母瓶培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱0.004g/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；
所述母瓶培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、纯化水、碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布包扎，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需的辅液I装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL。
5.根据权利要求4所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，在步骤S4中，
对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥7.0，湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入一级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥10.0，湿重35～40g/L时，将一级种子培养基中的菌种按10％的量转入二级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45～50g/L时再进行步骤S5的操作。
6.根据权利要求5所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
在步骤S4中，所述一级种子培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱0.004g/L、消泡剂0.3ml/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；
一级种子培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、消泡剂、纯化水、碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需已经配制保藏辅液I装入500mL的三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL。
7.根据权利要求6所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
在步骤S4中，所述二级种子培养基配方：硫酸铵3.0g/L、酵母粉2.0g/L、玉米浆干粉1.0g/L、味精0.75g/L、磷酸二氢钾0.75g/L、磷酸氢二钾0.75g/L、葡萄糖12.0g/L、七水硫酸亚铁0.18g/L、七水硫酸镁3.5g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.05g/L、六水氯化钴0.015g/L、氯化胆碱0.0065g/L、碳酸钙8g/L、消泡剂0.2mL/L、纯化水、pH6.4～6.5和辅液II；
所述辅液II配方：VB10.02g/L、VB20.002g/L、VB60.00344g/L、烟酸0.0228g/L、烟酰酸0.0228g/L、叶酸0.00104g/L、泛酸钙0.0004g/L和生物素0.00072g/L；
所述二级种子培养基的制备方法：称取物料，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始PH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需已经配制保藏辅液II装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液II2mL/100mL。
8.根据权利要求7所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
在步骤5中，所述发酵培养基配方：硫酸铵3.3g/L、玉米浆干粉4.4g/L、味精3.3g/L、磷酸二氢钾0.56g/L、七水硫酸亚铁1.56g/L、七水硫酸镁14.44g/L、氯化钠2.89g/L、一水硫酸锰0.07g/L、氯化钙0.09g/L、消泡剂0.0063g/L、葡萄糖13.5g/L、氯化胆碱0.0033g/L、纯化水和辅液III、pH6.4～6.5；
辅液III配方：VB10.00648g/L、VB20.00065g/L、VB60.00119g/L、烟酸0.00739g/L、烟酰酸0.00739g/L、叶酸0.00035g/L、泛酸钙0.00012g/L和生物素0.00023g/L；
所述发酵培养基的配制方法：称取物料，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH，按150mL/500mL大挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布，外加一层防水纸进行包扎，取所需已经配制好的辅液III装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液III4mL/200mL。
9.根据权利要求7所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
在步骤S4中，残糖测定的方法为：取发酵液10mL分装于两只试管中，离心5min，取1mL上清液加1mL蒸馏水和1.5mL3,5-二硝基水杨酸混合均匀，在沸水中加入5min，取出后立即用水冷却至室温，再向试管中加入21.5mL蒸馏水混匀，于520nm波长处测A值，将A带入标准曲线计算还原糖。
10.根据权利要求1所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，
还包括步骤S6、菌种的保藏：菌种用30～35％的甘油制作成的甘油管-20℃或-80℃冷冻保藏。
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