CN111269851B - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在小麦全蚀病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及其在小麦全蚀病防治中的应用，属于植物保护技术领域。所述的贝莱斯芽孢杆菌的编号XJ‑4，2019年10月30日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019872，贝莱斯芽孢杆菌的培养条件为：采用液体LB培养基进行振荡培养，振荡培养速度为200r/min，培养温度为28℃，培养时间为24h。本发明首次使用贝莱斯芽孢杆菌应用到小麦全蚀病的防治中，贝莱斯芽孢杆菌的剂型为菌悬液或可湿性粉剂；数据表明，与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌(编号为XJ‑4)对小麦幼苗的生长有促进作用，株高与干重均明显增加，对接种小麦全蚀病菌的小麦有明显的防治效果，使用其菌液灌根缓解了发病小麦植株矮化和颈基部、根部发黑的症状，平均防效高达52.46％。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及其在小麦全蚀病防治中的应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其在小麦全蚀病防治中的应用。

背景技术

小麦是我国主要的粮食作物之一，由禾顶囊壳小麦变种(G.graminisvar.tritici)引起的小麦全蚀病(Wheat Take-all)是小麦生产中重要的土传病害之一。小麦全蚀病对小麦整个生育期都有影响，在小麦出苗3d后即可侵染，从根毛处侵入，菌丝附着在根部轴向生长，侵入到根茎内部，致使小麦根部组织破坏、植株地上部分枯死。苗期症状较轻，表现为植株稍显矮小，地上部分无明显变化，而初生根、茎部发黑；小麦拔节期症状较明显，种子、根及茎部全部发黑，叶片枯黄，分蘖比正常植株少，植株矮化，类似缺肥或缺水症状。拔节后期，小麦植株发病更重，叶片由下而上黄化枯死，并出现“白穗”症状。

小麦全蚀病在世界各小麦主要产区均有发生，已经成为世界上主要小麦产区的重要根部病害。其为土壤寄居菌，在土壤中的病残体上营腐生生活，在适宜的环境下菌丝直接侵染寄主种子和根部并引起病害；另一方面，病菌以子囊壳和菌丝在病残体上越冬，同时种子也会携带小麦全蚀病原菌，故而给防治带来很大难度。

迄今为止，我国植物病害的防治主要依赖于化学防治。化学农药的长期单一使用，不仅让植物病原物对化学农药产生很强的抗性，降低了防治效果，同时大量使用农药导致农药残留量超标对人体健康造成重大威胁。因此，利用有益微生物及其制品来控制小麦全蚀病是符合我国现代农业绿色发展的要求。国内外众多学者已开展利用拮抗微生物防治小麦全蚀病的研究，但现阶段仍缺乏有效防治小麦全蚀病的拮抗菌。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其在小麦全蚀病防治中的应用，与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌(编号为XJ-4)对小麦幼苗的生长有促进作用，株高与干重均明显增加，对接种小麦全蚀病菌的小麦有明显的防治效果，使用其菌液灌根缓解了发病小麦植株矮化和颈基部、根部发黑的症状，平均防效高达52.46％。

2、技术方案.

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种贝莱斯芽孢杆菌，所述的贝莱斯芽孢杆菌的编号XJ-4，2019年10月30日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019872。

上述贝莱斯芽孢杆菌中，所述的贝莱斯芽孢杆菌的培养条件为：采用液体LB培养基进行振荡培养，振荡培养速度为200r/min，培养温度为28℃，培养时间为24h。

一种如上述所述的贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用。

上述贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，所述小麦全蚀病的病原菌为禾顶囊壳小麦变种(G.graminis var.tritici)。

上述贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌的剂型是药学上可接受的剂型。

上述贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌的剂型为菌悬液。

上述贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液的有效活菌数为1.0×10⁷CFU/mL-1.0×10¹⁰CFU/mL。

上述贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液的有效活菌数为1.0×10⁸CFU/mL。

上述贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，所述的贝莱斯芽孢杆菌的剂型为可湿性粉剂。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明首次从健康小麦根际土壤中分离并筛选小麦全蚀病菌的拮抗细菌XJ-3和拮抗细菌XJ-4，其抑制率分别为64.31％和65.25％。结果表明，菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦幼苗的生长有促进作用，与对照组相比，株高与干重均增加，菌株XJ-4效果更为明显；菌株XJ- 3和菌株XJ-4对接种小麦全蚀病菌的小麦有明显的防治效果，使用其菌液灌根缓解了发病小麦植株矮化和颈基部、根部发黑的症状，平均防效分别为51.29％和52.46％；此外，贝莱斯芽孢杆菌还可设计成可湿性粉剂的剂型。

附图说明

图1为实施例1中小麦根际土壤细菌稀释涂布及初筛的结果图；图中：A、B标示小麦根际土壤细菌涂布，C、D表示小麦根际土壤细菌初筛；

图2为实施例2中菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦全蚀病菌抑制作用的结果图；图中：A：小麦全蚀病菌培养7天，B：XJ-3与小麦全蚀病菌对峙培养7天，C：XJ-4与小麦全蚀病菌对峙培养7天，a：正常的小麦全蚀病菌丝形态，b：XJ-3导致的畸形菌丝形态，c：XJ-4导致的畸形菌丝形态；

图3为实施例2中菌株XJ-3和菌株XJ-4无菌发酵液对小麦全蚀病菌生长的抑制作用的结果图；图中：A：小麦全蚀病菌在PDA上培养7天,B：小麦全蚀病菌在含XJ-3发酵液平板上培养7天,C：小麦全蚀病菌在含XJ-4发酵液平板上培养7天；

图4为实施例3中菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦幼苗生长影响的结果图；

图5为实施例3中菌株XJ-3和菌株XJ-4对接种小麦全蚀病菌的小麦幼苗生长影响的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

供试材料如下：

(1)菌种来源

供试小麦全蚀病的病原菌(禾顶囊壳小麦变种(G.graminis var.tritici))由安徽农业大学植物保护学院菌种库提供。供试贝莱斯芽孢杆菌如下：其中一株贝莱斯芽孢杆菌的编号为 XJ-3，拉丁文名称为Bacillus velezensis，2019年10月30日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCCM 2019871；另一株贝莱斯芽孢杆菌的编号为XJ-4，拉丁文名称为Bacillus velezensis，2019年10月30日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC M 2019872。

(2)主要试剂

1-萘胺、明胶、碘化钾、磷酸氢二钾、氯化钠等生物化学试剂、无水对氨基苯磺酸、硝酸钾等生物化学试剂、胰蛋白胨TRYPTONE、琼脂、酵母提取物YEAST EXTRACT、马铃薯葡萄糖培养基、D-果糖、天冬氨酸、酪蛋白胨、分散剂、硫代乙酸钠、95％乙醇、冰醋酸、碳酸钙、氯化钙、氢氧化钠、蔗糖、硫酸铵、碳酸氢二钠碳酸二氢钠、硝酸钠、柠檬酸钠、肌酸冰醋酸、溴百里酚蓝。

(3)主要培养基

PDA培养基、LB培养基、NA培养基、碳源基本培养基、氮源基本培养基、葡萄糖氧化发酵培养基、硝酸盐液体培养基、肉汁胨培养基、明胶液化培养基、柠檬酸盐培养基、硝酸盐液体培养基、淀粉水解培养基。

实施例1

小麦全蚀病拮抗菌的筛选鉴定

运用系列梯度稀释法分离小麦根际土壤细菌(参考：“Xianbing W,Ruikui S,Yixin W, et al.Screening and identification of biocontrol Bacillus strainsagainst take-all of wheat[J]. Acta Agriculturae Jiangxi,2012.”)。称取15g(精确至0.01g)健康的小麦根际土壤于150m L锥形瓶中，加入50mL无菌去离子水及适量玻璃珠，在28℃下恒温振荡培养30min(振荡速度为200r/min)。按照10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9倍稀释上清液，每个梯度各取100μL稀释液涂布于LB平板上，平板于28℃培养箱中培养24h。挑取单菌落接种于LB平板上，进行纯化培养，得到根系土壤细菌。将所得根系土壤细菌分别接种于LB液体培养基中，在28℃下恒温振荡培养24h(振荡速度为200r/min)，移取等量的菌液和30％(V/V)甘油于2mL无菌离心管中混合，于-20℃冰箱保存。

分别移取甘油保存的小麦根系土壤细菌100μL，涂布于LB平板上，28℃培养48h。将活化所得菌落接种于液体LB培养基中，在28℃下恒温振荡培养24h(振荡速度为200r/min)，得到细菌发酵液。通过添加无菌的液体LB培养基，将细菌发酵液的OD值调整为1.0。

使用4mm内径的打孔器打取已活化的小麦全蚀病菌落边缘菌丝块，转接于PDA平板中心位置，将平板置于25℃下培养48h后，于距离中心位置2.5cm的四个对称方位贴上无菌滤纸片(Φ＝5mm)，移取10μL上述细菌发酵液滴于滤纸片上，将滴加LB设置为空白对照，置于25℃下恒温培养。待对照组菌丝铺满整个培养皿时，测量菌落半径(以病原菌碟中心与滤纸片中心连线向生防菌方向生长的菌落半径为菌落半径)，每组实验重复3次，计算抑菌率，筛选出平板抑菌效果较佳的菌株(参考：“王瑞,雷霁卿,查仕连,等.二十种生物源杀菌剂对三株猕猴桃溃疡病病原菌的毒力测定[J].北方园艺,2018(21):54-59”)。

小麦根系土壤细菌对小麦全蚀病菌的抑制率计算：

式中：A是指对照组病原菌落的半径；

B是指处理组病原菌落的半径。

运用系列梯度稀释法分离健康小麦根际土壤细菌，得到112株细菌，经过平板对峙实验筛选出12株细菌对小麦全蚀病病菌(Wheat take-all)有明显拮抗作用，稀释涂布及拮抗菌初筛结果如图1。

经过平板对峙培养，发现12株对小麦全蚀病菌有拮抗作用的细菌中，菌株XJ-3和菌株 XJ-4对小麦全蚀病菌的抑制效果明显，抑制率分别达到64.31％和65.25％。菌株XJ-65、菌株菌株XJ-88对小麦全蚀病菌的抑制率超过50％，剩余有5株菌株抑制率低于40％，结果见表 1。

表1拮抗菌株对小麦全蚀病菌生长的抑制作用

注：抑制率表示为平均值±标准误差。

实施例2

菌株XJ-3和菌株XJ-4发酵液对小麦全蚀病菌生长的影响

点接保存在LB平板上的菌株于液体LB培养基中，在28℃下恒温振荡培养24h(振荡速度为200r/min)，得到菌液。通过添加灭菌的液体LB培养基，将细菌发酵液的OD₆₀₀值调整为1.0。移取1.5mL OD₆₀₀为1.0的菌液于2.0mL无菌EP离心管中，离心10min(离心速度为13000r/min)后，取上清液。使用无菌的细菌过滤器过滤上清液，得到菌株发酵液。

制备菌株XJ-3和菌株XJ-4的发酵液，将发酵液加入PDA培养基中，制成10％的含发酵代谢产物平板。使用4mm内径的打孔器打取已活化的小麦全蚀病菌落边缘菌丝块，转接于PDA平板中心位置，以未加入无菌发酵液的平板为空白对照，置于25℃下恒温培养。待对照组菌丝铺满整个培养皿时，记录数据并计算抑菌率。

由实施例1可知，菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦全蚀病菌有较强的抑制作用，因此，使用手术刀刮取对峙培养平板上抑菌圈边缘菌丝，置于载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察。如图2所示，对照组小麦全蚀病菌丝形态匀称，表面光滑；而对峙培养组拮抗菌株XJ-3和菌株XJ-4抑菌圈边缘菌丝有明显的菌丝肿大、畸形，尖端分枝异常和原生质体渗透。

运用抑制菌丝生长速率法，测定菌株XJ-3和菌株XJ-4的发酵液对小麦全蚀病菌的抑制作用(培养基中发酵液含量为10％)，将详细结果及小麦全蚀病菌生长状况绘制成表2及图3。菌株XJ-3发酵液的抑菌率为70.20％，菌株XJ-4发酵液的抑菌率为74.27％，均高于其菌液的抑菌率，且实验组的小麦全蚀病菌丝均有菌丝直立，加厚生长的现象。

表2菌株XJ-3和菌株XJ-4发酵液对小麦全蚀病菌生长的抑制作用

实施例3

菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦全蚀病的盆栽防效试验

种子萌发试验：将供试小麦种子用75％(V/V)酒精进行表面消毒0.5min-1min，无菌水冲洗3次，使用无菌水于无菌培养皿中浸泡已消毒的小麦种子12h，取出小麦种子铺平于无菌水润湿的无菌纱布上，喷洒无菌水(使小麦种子表面保持湿润)，待其露白后，湿润保存，备用。

盆栽防效试验：按照体积比4∶1混合无菌营养土与蛭石，再浇灌生防菌液使混合土湿润，菌液用量为25mL/盆，其有效活菌数为10⁸-10⁹CFU/mL。将处理过的土壤填入方形花盆(上下边长分别为10.00cm、7.20cm，高为8.50cm)7cm，将打取预先培养7d的小麦全蚀病菌菌落边缘的菌碟(Φ＝4mm)，按三行三列铺在土壤上，每个菌碟上铺放已露白的小麦种子，再铺盖1cm的土壤，均匀浇水至浇透。所有步骤相同，以不加小麦全蚀病菌碟为阴性对照。将各处理移至25℃培养室，每天光照10h，适时浇水。

病害级别统计和植株生长状况检测：利用流水将小麦根部洗净，分别测量每株小麦的株高、根长、干重。病害检测参照陈怀谷(参考：“陈怀谷,王裕中,史建荣,等.小麦全蚀病菌的致病力及寄主范围测定[J].江苏农业学报,2000(01):22-24”)分级标准(见表3)进行统计。

表3小麦全蚀病病害分级标准

生防效果的计算：

式中：代表数值是指根据小麦变黑根面积占根总面积的百分数确定的级别数

菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦幼苗生长的影响：菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦幼苗生长有一定的促进作用，与对照组相比，株高分别增加6.48％和13.12％，干重分别增加了1.30％和14.29％(见表4和图4)。

表4菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦幼苗生长的影响

注：抑制率表示为平均值±标准误差，小写英文字母为组间差异在5％显著水平的显著性。

菌株XJ-3和菌株XJ-4对接种小麦全蚀病菌的小麦幼苗的防效测定：将菌株XJ-3和菌株 XJ-4进行小麦全蚀病的温室防效试验，结果表明，接种小麦全蚀病菌的小麦幼苗有矮化及颈基部、根部发黑(如图5所示)，与对照组(未接种)相比，株高减少25.04％，干重减少24. 68％(表2-5)。

接种小麦全蚀病菌三天后，使用菌株XJ-3和菌株XJ-4灌根的小麦幼苗株高分别大于对照组(接种小麦全蚀病菌)4.4cm和8.15cm，干重分别大于对照组(接种小麦全蚀病菌)34. 48％和48.28％，显著减轻了小麦全蚀病对小麦的影响(见表5)。

菌株XJ-3的平均感病指数为36.88，高于贝莱斯芽孢杆菌XJ-4的35.92。菌株XJ-3和菌株XJ-4的平均防效分别为51.29％和52.46％(见表6)。

表5菌株XJ-3和菌株XJ-4对接种小麦全蚀病菌的小麦幼苗生长的影响

注：抑制率表示为平均值±标准误差，小写英文字母为组间差异在5％显著水平的显著性。

表6菌株XJ-3和菌株XJ-4对小麦全蚀病菌的防治效果

实施例4

菌株XJ-3和菌株XJ-4可湿性粉剂的研制

(1)菌株XJ-3和菌株XJ-4可湿性粉剂母粉的制备

移取菌株XJ-3和菌株XJ-4的24h幼龄菌种液，以5％(V/V)接种量接种于一级培养基中，30℃下恒温振荡12h(振荡速度为200r/min)。在超净工作台中，将所得菌液转入二级培养基中，30℃下恒温振荡14h(振荡速度为200r/min)。再将二次发酵的菌液转入三级培养基中，30℃下恒温振荡30h(振荡速度为200r/min)。在菌液中加入比例为8％的白炭黑，搅拌混匀制成母液，烘干后，粉碎并且过300目筛，制成母粉。

其中一级培养基的配方如下：56.0g大豆蛋白胨、28.0g酪蛋白胨、5.6g牛肉膏、8.4g酵母浸膏、14.0g葡萄糖、0.42g L-半胱氨酸、0.14g硫代乙醇酸钠、2.8g吐温-80、5.6g磷酸氢二钾、1.4g氯化镁、0.7g硫酸锌、0.14g三氯化铁、0.042g维生素B1、0.042g维生素B2、0. 042g维生素B6、0.0042g D-泛酸钙、0.42g氯化钙；

其中二级培养基的配方如下：33.48g高温豆饼粉、55.8g玉米粉、4.46g鱼粉、4.46g葡萄糖、1.68g(NH₄)₂SO₄、1.12g NaCl、5.86g K₂HPO₄·3H₂O、0.58g NaH₂PO₄·2H₂O、10g CaCO₃；

其中三级培养基的配方如下：833.3g高温豆饼粉、11.46g玉米粉、1g鱼粉、0.83g葡萄糖、0.3g(NH₄)₂SO₄、0.21g NaCl、20.83g MgSO₄、0.05g K₂HPO₄、0.053g NaH₂PO₄、1.875gCaCO₃、0.03mL甲基硅油、62.5mL豆油。

(2)菌株XJ-3和菌株XJ-4可湿性粉剂的制备

称取步骤(1)制成的母粉，加入比例为10％十二烷基苯磺酸钠、4％羧甲基纤维素钠、0. 1％糊精，烘干后制成可湿性粉剂。

(3)菌株XJ-3和菌株XJ-4可湿性粉剂的质量测定结果

如表7所示，菌株XJ-3和菌株XJ-4所制可湿性粉剂中芽孢含量分别为1.23×10⁹CFU/g 和1.88×10⁹CFU/g，杂菌率都为0％，pH值分别为7.0和7.1，细度为95％，润湿时间分别为 52s和50s，悬浮率分别为78.8％和81.5％。

表7菌株XJ-3和菌株XJ-4可湿性粉剂质量测定结果

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (7)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），其特征在于：所述的贝莱斯芽孢杆菌的编号XJ-4，2019年10月30日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2019872。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，其特征在于：所述小麦全蚀病的病原菌为禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var.tritici）。

3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，其特征在于：所述的贝莱斯芽孢杆菌的剂型是药学上可接受的剂型。

4.根据权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，其特征在于：所述的贝莱斯芽孢杆菌的剂型为菌悬液。

5.根据权利要求4所述的贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，其特征在于：所述的贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液的有效活菌数为1.0×10⁷CFU/mL-1.0×10¹⁰CFU/mL。

6.根据权利要求5所述的贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，其特征在于：所述的贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液的有效活菌数为1.0×10⁸CFU/mL。

7.根据权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌在小麦全蚀病防治中的应用，其特征在于：所述的贝莱斯芽孢杆菌的剂型为可湿性粉剂。

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