CN107475133B - 一种淡紫紫孢菌及其在促进白芨生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淡紫紫孢菌及其在促进白芨生长中的应用。菌株命名为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ‑001，其分类地位为子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目蛇形虫草科紫孢属，菌株号为JSNLBJ‑001，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13690，保藏日期为2017年3月10日。本发明淡紫紫孢菌JSNLB‑001在促进白芨生长作用效果显著；且能够人工培养，繁殖速度快，便于进行规模化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种淡紫紫孢菌及其在促进白芨生长中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种淡紫紫孢菌及其在促进白芨生长中的应用。
背景技术
白芨(Bletilla striata)为兰科白芨属多年生草本植物，药用部位为其干燥块茎，别名良姜、紫兰。其味苦、甘、涩，性微寒；归肺、肝、胃经，具有收敛止血，消肿生肌的功能。广泛分布于长江流域，在全国各地有零星种植，喜阴耐潮，多分布于峡谷、溪边等地。花色艳丽，有紫、红、黄等多种色彩，可用于花盆、花坛等造景。
白岌目前基本上依靠采集野生药材经加工后供药用。由于需求量的增加，导致药农对野生资源大量采挖，野生资源在不断减少，而白芨种子细小、萌发率极低、自然繁殖困难且生长缓慢，我国野生白芨急剧减少，现已濒临灭绝。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明的目的之一是提供一种对白芨栽培中促生作用效果显著地菌根真菌——淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)。本发明的另一目的是提供上述真菌在促进白芨生长中的应用。
技术方案：本发明所述的淡紫紫孢菌，命名为淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)JSNLBJ-001，分类命名为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)，其分类地位为子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目蛇形虫草科紫孢属，菌株号为JSNLBJ-001，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13690，保藏日期为2017年3月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
上述菌株在PDA培养基上培养7d，菌落直径3.5cm，生长较慢。菌落墨绿色，毛毡状，革质，边缘整齐，有1mm左右透明外圈。
本发明还提供了所述的淡紫紫孢菌在促进白芨生长中的应用。
所述的应用包括：将所述的淡紫紫孢菌制成固体菌剂混入白芨栽培基质中，维持栽培基质相对含水量在50％～70％5～10天，然后栽种白芨。
接种时，每立方白芨栽培基质接种固体菌剂的接种量为10～30g。
所述固体菌剂的制备方法包括：以麦麸为培养基质、硫酸铵为外源氮源、蔗糖为外源碳源，制备成固体培养基，灭菌，接种淡紫紫孢菌进行培养，培养结束后粉碎成粉末状。
所述麦麸、硫酸铵和蔗糖的质量比80:8～12:3～6，优选为80:10:5。
接种后，培养条件为：25～28℃、10～12h光照/10～12h黑暗、pH5～6条件下培养15～20天。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001对白芨幼苗促生作用效果较为显著，施用后能显著提高白芨苗的叶绿素含量，从而促进其生长。
(2)淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001培养条件简单、容易保存，易于规模化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为本发明菌株培养的菌落正面形态图；
图2为本发明菌株培养的菌落正面形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1菌株的分离与鉴定
菌株JSNLBJ-001是2015年5月在江苏省句容市江苏茅山道地药材有限公司白芨种植区内生长状况较好的植株上分离获得的。
分离方法为：取野生新鲜的白芨根，将根段表面上的基质土壤用流动的自来水冲洗干净后，在超净工作台内用滤纸吸干表面的水分。再用灭菌的去离子水冲洗干净，然后分次浸入75％酒精45s，2％次氯酸钠溶液浸泡消毒5min。消毒完成后，用灭菌的去离子水冲洗5-6次以彻底去除次氯酸钠，用灭菌的滤纸吸干根表面的残留水滴，然后用灭菌的解剖刀将根段切成0.5mm左右的组织段。将组织段转移到加有硫酸链霉素(100μg/mL)的PDA培养基平板上，每个平板上接种5个组织段，每种培养基接15个平板。将分离获得的内生真菌进行回接试验，得到本发明所述菌株，将该菌株定名为JSNLBJ-001，该菌株能明显促进白芨幼苗的生长，提高幼苗的成活率。
菌株JSNLBJ-001的菌落特征如下：
形态学特征观察表明：在PDA培养基上培养7d，菌落直径3.5cm，生长较慢。菌落墨绿色，毛毡状，革质，边缘整齐，有1mm左右透明外圈。(图1，图2)。
扩增ITS区全序列并进行测序，PCR扩增得到的16sRNA全序列如下所示。PCR扩增得到的全序列(SEQ ID NO.1)：
CTAAGAAAGTTGGGCGTTTTACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTGCTACTACGCAGGGGAGGCTGCGGCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGCTGGTGTGCCGTCCCCCAACACCGAGGCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTCAGAGAAGAAATTCCGCCCGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCGGCGGGCGCCTGGGTCCGGCGCCGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGCCGAGGCAACTGAGGTAAGGTTCACAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTCACCCCTACGGAA
经形态学及分子生物学鉴定表明，该菌株为淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)，其分类地位为子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目蛇形虫草科紫孢属，菌株号为JSNLBJ-001，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13690，保藏日期为2017年3月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
实施例2
淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001对白芨幼苗促生作用效果分析。
(1)以麦麸为培养基质、硫酸铵为外源氮源、蔗糖为外源碳源，制备成固体培养基质，麦麸、硫酸铵、蔗糖按照质量比80:10:5进行配置，将上述培养基加入5％的纯净水混匀，然后装入高压灭菌袋内，于121℃和101.3千帕的高压条件下灭菌20分钟，待培养基质冷却后在无菌条件下接种菌根真菌淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001，在27℃、12h光照+12h黑暗、pH5.5条件下培养15～20天，将培养好的菌剂粉碎成粉末状，混入白芨栽培基质中，每立方白芨栽培基质接种固体菌剂的接种量为20g，施用菌剂后，基质相对含水量维持在50％以上10天，以确保菌丝在基质内成活。
(2)选取白芨组培苗为栽培材料，将白芨组培苗洗净，晾干，称重后，按照20株/㎡的种植密度种植于上述的接菌栽培基质中，并将未接种菌的基质设为对照(CK)。
(3)进行正常的水肥管理，栽培90d后，采用多点随机取样，取出的白芨苗，进行促生效果分析。
A、净重增量测定：清洗干净根部和块茎上的栽培基质，自然条件下风干，用分析天平(0.0001g)称取白芨苗的鲜重，减去移栽前白芨苗的重量，即得净重增量；
B、叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量：称取0.5g左右的健康白芨叶片，切碎后加入25mL无水乙醇与丙酮的混合浸提液(体积比为1:1)，避光浸提24h。24h后，将浸提液离心，使用紫外可见分光光度计测量各上清液在645nm和663nm波长下的吸光度A645和A663。将测得的数据按以下公式分别计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。
Ca(mg/g)＝(12.71A663－2.59A645)*V/1000m
Cb(mg/g)＝(22.88A645－4.67A663)*V/1000m
Ca+b(mg/g)＝(8.04A663+20.29A645)*V/1000m
式中：V代表体积比为1:1的无水乙醇与丙酮的混合浸提液的最终体积(mL)；
m代表所用白芨叶片的鲜重(g)。
JSNLBJ-001对白芨组培苗促生效果分析如下：
表1
从表1中可知JSNLBJ-001能显著地促进白芨组培苗鲜重的增加，接种后，其植株叶绿素含量显著提高，表明接菌后其光合作用能力大大增强，从而起到促生的作用。
序列表
<110> 江苏农林职业技术学院
<120> 一种淡紫紫孢菌及其在促进白芨生长中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 538
<212> DNA
<213> 淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)
<400> 1
ctaagaaagt tgggcgtttt acggcgtgac cgcctccgcg ctccggtgcg aggtgtgtgc 60
tactacgcag gggaggctgc ggcggggtcg ccactgcatt tcgggggcgg ctggtgtgcc 120
gtcccccaac accgaggccc ccgggggggc tcgagggttg aaatgacgct cgaacaggca 180
tgcccgccag aatgctggcg ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt 240
ctgcaattca cattacttat cgcatttcgc tgcgttcttc atcgatgcca gaaccaagag 300
atccgttgtt gaaagttttg attcatttgt ttttgcttgt gcaactcaga gaagaaattc 360
cgcccgctgg gcgtaatgca agagagtttg gggtccctgc ggcgggcgcc tgggtccggc 420
gccggcgcgg gggcaggcgg ccggggcgtt cccgccgagg caactgaggt aaggttcaca 480
gtgggtttgg gagttgtata actcggtaat gatccctccg caggtcaccc ctacggaa 538

Claims (7)

1.一种淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)，其特征在于，命名为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001，保藏编号为CGMCC NO：13690。
2.根据权利要求1所述的淡紫紫孢菌在促进白芨生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将所述的淡紫紫孢菌制成固体菌剂混入白芨栽培基质中，维持栽培基质相对含水量在50％～70％5～10天，然后栽种白芨。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，每立方白芨栽培基质接种固体菌剂的接种量为10～30g。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述固体菌剂的制备方法包括：以麦麸为培养基质、硫酸铵为外源氮源、蔗糖为外源碳源，制备成固体培养基，灭菌，接种淡紫紫孢菌进行培养，培养结束后粉碎成粉末状。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，培养条件为：25～28℃、10～12h光照/10～12h黑暗、pH5～6条件下培养15～20天。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述麦麸、硫酸铵和蔗糖的质量比80:8～12:3～6。
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