CN106978351A - 对油菜核盘菌具强致病力的淡紫紫孢菌及其应用 - Google Patents

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杨凡
肖炎农
马凯
赵秀山
孙文喜
李艳
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    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom

Abstract

本发明涉及一种对油菜核盘菌具强致病力的淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）及其应用，所述菌株为淡紫紫孢菌pt361，可开发为生防菌制剂用于对油菜菌核病的生物防治，较目前防治油菜核盘菌的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征。本发明菌株除了对油菜核盘菌有强致病力以外，而且菌株培养快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备，具有良好的市场应用前景。

Description

对油菜核盘菌具强致病力的淡紫紫孢菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种对油菜核盘菌具强致病力的淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）及其应用。
背景技术
油菜菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum （Lib.）de Bary）引起的一种世界性病害，主要发生在油菜生长相对冷凉和潮湿的地区。在英国，菌核病可造成油菜高达50%的减产；在德国，严重的年份油菜茎杆发病率高达70%。在我国冬油菜产区，油菜菌核病是常发性病害，居油菜三大病害之首，发病率一般为10～30%，严重年份高达到80%以上，减产11～73%，含油量降低1～5%。在长江中、下游及东南沿海的主要油菜产区，包括江苏、安徽、上海、浙江、湖南、湖北、江西等地发生尤为突出，严重影响了我国的油菜生产。
目前，对于油菜核盘菌的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和油菜核盘菌产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治油菜核盘菌也逐渐引起人们的重视。
当前，油菜菌核病的生物防治以活体微生物或其代谢产物控制核盘菌的研究报道较多，已有的研究结果表明，许多土壤、叶围、根围及内生微生物甚至包括一些植物病原物对核盘菌均有一定程度的抑制作用。初步统计，对核盘菌具有生防潜能的生物种类已达54属90种的真菌、细菌或其它微生物，对核盘菌具有寄生或拮抗作用。但当前用于防治菌核病的生防真菌有盾壳霉、木霉、粘帚霉、食菌核葚孢霉和黄色蠕形霉等，其中又以盾壳霉的研究最为广泛及深入，并且国外已有其商品制剂问世。然而，目前对于油菜核盘菌生防菌的研究多处于实验室阶段，尚未有能在农业生产中对油菜核盘菌达到有效防治效果的菌株，亟待进一步分离筛选或驯化出能应用于生物防治的有效菌株，并进行生物潜能的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一株对油菜核盘菌具有强致病力的淡紫紫孢菌菌株，该菌株作为生防菌，具有良好的市场应用前景。
为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：
在已分离、筛选获得的原始菌株pl36-1（来源于华中农业大学植物病理学线虫实验室）基础上，发明人进一步通过根癌农杆菌介导的遗传转化而得到的稳定突变子，进而得到变异的淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）菌株pt361，并于2016年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编430072），保藏编号为CCTCC NO：M2016681。
本发明还公开了该淡紫紫孢菌菌株pt361在防控油菜菌核病中的应用，以及在制备用于防治油菜核盘菌的生物农药中的应用，该菌株的分生孢子悬浮液及代谢产物对油菜核盘菌具有强致病力。
与现有技术相比，本发明具有以下积极有益的技术效果：
（1）本发明淡紫紫孢菌菌株pt361是一种线虫病原生防真菌，可制成生防菌制剂用于对油菜核盘菌的生物防治，较目前防治油菜核盘菌的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性的特征。
（2）本发明淡紫紫孢菌菌株pt361易于培养、繁殖速度快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。
（3）本发明淡紫紫孢菌菌株的孢子悬浮液和代谢产物对油菜核盘菌具有很强的致病力。
附图说明
图1为不同浓度的淡紫紫孢菌pt361无菌发酵液对核盘菌菌丝抑制效果的对比照片；其中，
a：CK；b：10%的pt361菌株发酵液对核盘菌菌丝抑制结果；c：50%的pt361菌株发酵液对核盘菌菌丝抑制结果；d：100%的pt361菌株发酵液对核盘菌菌丝抑制结果。
图2为不同浓度的淡紫紫孢菌pt361无菌发酵液对离体叶片上菌核病的抑制效果对比照片。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂如无特别说明，均为常规市售产品；所涉及的检测方法或试验方法，如无特别说明，则均为常规方法。
实施例1：淡紫紫孢菌菌株pt361获取
淡紫紫孢菌原始菌株pl36-1王明祖老师1991年在湖北省从根结线虫体内分离得到（参见1991年发表于《植物病理学报》的《根结线虫卵寄生真菌的研究初报》），保存于华中农业大学植物病理线虫研究室。pt361是通过根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化而获得的突变菌株。
转化子遗传稳定性的方法参考曾大兴的方法。大致如下：在不含草丁膦和萎锈灵的PDA平板上接种淡紫紫孢菌转化菌株，28℃，恒温黑暗培养3-5天后，接着转移到4℃冰箱，放置2天，再然后28℃，恒温黑暗培养3-5天，用打孔器挑取菌落边缘菌丝接种到新的PDA平板上培养，如此连续转接10代，再接种到含4.5mg/mL草丁膦+400μg/mL萎锈灵的PDA平板上，28℃，恒温黑暗培养，记录插入突变子菌落生长情况。试验结果表明，经过转代10次驯化后的插入突变子仍旧可以在含草丁膦和萎锈灵的PDA平板上正常生长，说明淡紫紫孢菌的插入突变子在无性繁殖过程中，bar和抗萎锈灵基因并未丢失，具有较高的遗传稳定性。
实施例2：淡紫紫孢菌菌株pt361代谢产物对核盘菌的拮抗效果（PDA平板）
淡紫紫孢菌发酵液制备：在装有150mL PDB培养基的250mL三角瓶中接入直径0.5cm的淡紫紫孢菌pt361菌块，28℃，200r/min摇床培养，培养6d。取发酵液，10000r/min离心15min，取上清液用细菌过滤器过滤。所得到的液体即为原液（100%）。根据需要用无菌水稀释10%、30%和50%。
PDA平板制备：将融好的PDA培养基冷却到30℃左右，取2mL的不同浓度的上述所得菌液分别加入到8mL的冷却的PDA培养基中混合均匀，倒平板，静置1～2h。
接种：用直径0.5cm的打孔器在玻璃培养皿上已生长3d的核盘菌菌丝边缘打孔，用接种针将菌块接入到已冷却的平板中。25℃培养、观察、统计抑制效果。
结果见图1，可以看出淡紫紫孢菌的浓度越高，核盘菌生长的菌块越小，受到的拮抗作用越强，100%的原液可以达到100%的抑制效果（d），50%的原液可以达到87.3%的抑制效果（c），而10%的原液也可以达到60.3%的抑制效果（b）。
实施例3：淡紫紫孢菌菌株pt361代谢产物对核盘菌的拮抗效果（油菜离体叶片）
淡紫紫孢菌发酵液制备：在装有150mL PDB培养基的250mL三角瓶中接入直径0.5cm的淡紫紫孢菌pt361菌块，28℃，200r/min摇床培养，培养6d。取发酵液，10000r/min离心15min，取上清液用细菌过滤器过滤。所得到的液体即为原液（100%）。根据需要用无菌水稀释至10%、30%和50%。
接种：选用叶龄相同、大小一致的健康叶片，用无菌水洗净、备用。将油菜叶片浸泡在上述不同浓度的发酵液里20分钟左右。在叶片两边中间接种2个直径为0.5cm的核盘菌菌块，25℃保湿培养3天。观察发病情况，统计发病率，计算病情指数，病情指数(%)=[(对照发病面积-处理发病面积)/对照发病面积]×100%。
结果见图2，可以看出淡紫紫孢菌的浓度越高，核盘菌生长的菌块越小，受到的拮抗作用越强，油菜叶片发病病斑面积越小。100%的原液可以达到98.1%的抑制效果（d），50%的原液可以达到84.3%的抑制效果（c），而10%的原液也可以达到40.2%的抑制效果（b）。
实施例4：淡紫紫孢菌菌株pt361代谢产物对核盘菌菌核萌发的抑制效果
淡紫紫孢菌发酵液制备：在装有150mL PDB培养基的250mL三角瓶中接入直径0.5cm的淡紫紫孢菌pt361菌块，28℃，200 r/min摇床培养，培养6 d。取发酵液，10000 r/min离心15min，取上清液用细菌过滤器过滤。所得到的液体即为原液（100%）。根据需要用无菌水稀释10%、30%和50%。
浸泡：用同一批、大小一致的核盘菌菌核，用无菌水洗净、浸泡在上述不同浓度的发酵液里20分钟左右。然后放在玻璃培养皿（每皿20个，3皿为一重复，共4次重复），25℃保湿培养5天。观察菌核萌发情况，统计发病率，计算抑制效果。
结果见表1，可以看出淡紫紫孢菌的浓度越高，核盘菌菌核萌发受到的抑制作用越强，菌核萌发的越少。100%的原液可以达到75.8%的抑制效果，50%的原液可以达到42.7%的抑制效果，而10%的原液也可以达到21.6%的抑制效果。
表1 淡紫紫孢菌菌株pt361对油菜核盘菌菌核萌发抑制效果
。

Claims (4)

1. 一种淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）菌株pt361，其保藏编号为CCTCCNO：M2016681。
2.权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株pt361在油菜菌核病中的应用。
3.权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株pt361在制备用于防治油菜核盘菌的生物农药中的应用。
4.一种生防菌制剂，含有权利要求1所述的淡紫紫孢菌菌株pt361、其分生孢子或/和其代谢产物。
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