CN105238715A - 芽孢杆菌dy26-004及其在防治植物致病真菌的应用 - Google Patents
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Abstract
芽孢杆菌DY26-004及其在防治植物致病真菌的应用，涉及芽孢杆菌。所述芽孢杆菌(Bacillus？sp.)DY26-004的保藏编号为CCTCC？NO：M？2015406。该菌株具有如下特征：对多种植物病原真菌(镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌)具有较强的抑制作用。在油菜菌核病菌防治和小麦赤霉病防治的盆栽试验中有较好的生物防治效果，防效分别为72％和65％。芽孢杆菌DY26-004无毒无致病性，对环境友好，是微生物农药研发的有用资源，具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一株芽孢杆菌DY26-004及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
背景技术
植物病害一直是影响农业生产的重要因素之一，化学农药的长期大量使用不仅催生了病原菌的抗药性，而且农药残留对人、畜和环境都有危害。生物防治是利用有益生物或其产物来抑制或消灭有害生物的一种方法，由于其无毒害、无污染和不易产生抗药性的优点，使其成为防治植物病害研究中的一个新方向(Calvoetal.2007)。细菌由于生长周期短，代谢易于调控，可通过发酵实现大规模生产的特点，被广泛应用于植物病害防治的研究。芽胞杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、节杆菌(Arthrobacter)和沙雷氏菌(Serratia)等都在控制植物真菌性病害上具有明显效果(BashaandUlaganathan.2002)。
目前用于生物防治的微生物菌株多数来自于陆地，而多年来对陆地微生物的筛选，导致筛选到产生新型抗病机制的微生物越来越少。因而人们逐渐把目光投向了海洋，希望从海洋环境中开发出新型抗病原菌活性物质，用于植物病害的生物防治。海洋微生物相对于陆地微生物而言，一直处于海洋特有的高盐、高压、低氧、低光照等极端条件，导致其在物种、基因组成和生态功能上的多样性(李越中，陈琦.1998)。海洋微生物活性物质的开发利用研究进展迅速,人们已从放线菌、真菌、细菌、微藻等海洋微生物中分离出具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节功能以及其它用途的生物活性物质。
据报道，芽孢杆菌对多种由植物病原真菌所引起的植物病害具有良好的拮抗和防治效果。在水稻中，由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的纹枯病、由稻梨孢(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病；在谷物中，由禾白粉菌(Erysipheraminis)引起的禾谷类白粉病等；在蔬菜中由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的灰霉病、由尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)引起的枯萎病以及由瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)引起的根腐病，等。由此可见，芽孢杆菌是筛选拮抗植物病原真菌生防菌有效来源之一(齐爱勇，等.2011)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004。
本发明的目的之二在于提供一种芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
所述芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004分离自中国第26次大洋科学考查所采集的沉积泥样品(S003站点；w63°45.3496′，S3°39.8693′)；该菌已于2015年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏中心保藏编号为CCTCCNO：M2015406。
通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DY26-00416SrDNA序列，与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属(Bacillussp.)具有99％的序列相似性；其16SrDNA序列的GenBank登录号为KT270352。
所述芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004的16SrDNA部分序列如下：
所述芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004可在制备防治植物致病真菌发酵上清液中应用。
所述防治植物致病真菌发酵上清液的制备方法如下：
将芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004放入种子培养基培养，得芽孢杆菌DY26-004种子液，再接入到液体发酵培养基中培养，发酵结束后离心，除去沉淀菌体，即得防治植物致病真菌发酵上清液。
所述种子培养基的组成可为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121℃高灭压菌20min。
所述液体发酵培养基的组成可为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121℃高灭压菌20min。
所述放入种子培养基培养的条件可在28～30℃，转速180～220r/min下，培养12～24h。
所述接入到液体发酵培养基中培养的芽孢杆菌DY26-004种子液的接入量与液体发酵培养基的体积比可为1∶100，所述接入到液体发酵培养基中培养的条件可为28～30℃，转速180～220r/min，培养48～72h。所述离心的条件可在10000r/min下离心15～20min。
所述植物致病真菌包括但不限于镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。在油菜菌核病菌(核盘菌)和小麦赤霉病(镰刀菌)防治的盆栽试验中有较好的生物防治效果，防效分别为65％和72％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004对多种植物病害的防治有明显效果，抑真菌谱广、抑菌效果明显、发酵培养基简单。
附图说明
图1为芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004的菌落形态。
图2为芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。在图2中：A，长柄链格孢；B，绿色木霉；C，香蕉炭疽菌；D，核盘菌；E，立枯丝核菌；F，镰刀菌；G，宛氏拟青霉；H：互生链格孢；I：镰刀菌；J：香蕉炭疽菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004的分离筛选
本发明涉及芽孢杆菌((Bacillussp.)DY26-004由本申请人从中国第26次大洋科学考查所采集的沉积泥样品中所分离获得，该菌在LB培养基上生长，28℃培养24h后，菌体呈水滴状，浅白色，菌落较大，见图1。
实施例2：芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004菌种鉴定
采用16SrRNA基因测序方法对芽孢杆菌DY26-004进行菌种鉴定。利用通用引物扩增大洋来源菌株DY26-00416SrDNA序列，正向引物27F序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAT，反向引物1492R序列为：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。以芽孢杆菌DY26-004总DNA为PCR扩增模板，进行PCR反应。反应条件为：94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延长1.5min，30个循环。扩增基因送测序公司测序，获得该菌株16SrDNA序列后，将该序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)与GeneBank中核酸数据进行对比分析(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)。结果显示，DY26-00416SrDNA序列与Bacillussubtilis(EU257448.1)、Bacillusamyloliquefaciens(KF181458.1)、Bacillusamyloliquefaciens(HG328254.1)、Bacillussubtilis(KC196261.1)等菌株的序列相似性为99％，即芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DY26-004与芽孢杆菌同源，因此，将其命名为芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DY26-004。
实施例3：植物致病真菌抗菌谱的测定
将实施例1获得的芽孢杆菌DY26-004在LB液体培养基上活化，然后以1％接种量移入50mLLB培养液中，在28℃下200r/min振荡培养2天，离心后过滤除菌制成无菌发酵上清液备用。采用滤纸片法测定芽孢杆菌DY26-004对10种植物致病真菌的抑制活性。
用直径为6mm无菌打孔器将受试致病真菌制成菌块，置于马铃薯固体培养基(PDA)平板中央，28℃的条件下培养1～2天，等待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，在每个菌块的四周放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，滤纸片距离菌块边缘0.5～1cm，向滤纸片上加入50μL上述无菌发酵上清液，继续培养1～2天，通过与对照培养的比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制。如果受试致病真菌的菌丝体受到抑制时，菌丝体会形成月牙型或者线型边缘。结果如图2所示，芽孢杆菌DY26-004发酵上清液对受试植物致病真菌具有抑制活性，包括：镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽。
实施例4：生物防治盆栽试验
将实施例1获得的芽孢杆菌DY26-004在LB液体培养基上活化，然后以1％接种量移入50mLLB培养液中，在28℃下200r/min振荡培养2天，发酵结束后10000r/min下离心20min，除去沉淀菌体，得到DY26-004发酵上清备用。
(1)油菜菌核病(核盘菌感染引起)的生物防治盆栽试验
油菜菌核病菌在马铃薯蔗糖琼脂培养基上培养5天后制成直径5mm的菌碟，留待备用。于油菜主茎开花期，在叶片和茎杆上接种油菜菌核病菌菌碟，接种后的盆钵置25℃，相对湿度80％的环境下。油菜盛花后期，芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004发酵上清液利用小型喷雾器(500ml)进行均匀喷雾，孔径<7mm，药剂不留残液。3天后调查叶片调查病斑直径(d)，计算病斑面积，病斑面积＝π×(d/2)2，茎秆量取病斑长度，按下式计算防效：
计算结果表明，芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004对油菜菌核病防效达到72％。
(2)小麦赤霉病(镰刀菌感染引起)的生物防治盆栽试验
镰刀菌制成106个/mL的孢子悬浮液，于小麦扬花期，将10μL孢子悬浮液滴注入麦穗中部的小花内。24h后，芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004发酵上清液利用小型喷雾器(500ml)进行均匀喷雾防治，孔径<7mm，药剂不留残液。乳熟后期逐穗记载严重度，分级后计算病情指数、防治效果。
分级方法：
0级：全穗无病；
1级：感病穗面积占全穗面积的四分之一以下；
3级：感病穗面积占全穗面积的四分之一至二分之一；
5级：感病穗面积占全穗面积的二分之一至四分之三以下；
7级：感病穗面积占全穗面积的四分之三以上。
药效计算方法如下：
计算结果表明，芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004小麦赤霉病防效达到65％。
Claims (10)
1.芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004，已于2015年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCCNO：M2015406。
2.如权利要求1所述芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004，其特征在于16SrDNA部分序列如下：
3.如权利要求1所述芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述防治植物致病真菌发酵上清液的使用方法如下：将防治植物致病真菌发酵上清液直接或稀释后喷洒在植物上。
5.如权利要求3所述应用，其特征在于所述防治植物致病真菌发酵上清液的制备方法如下：将芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-004放入种子培养基培养，得芽孢杆菌DY26-004种子液，再接入到液体发酵培养基中培养，发酵结束后离心，除去沉淀菌体，即得防治植物致病真菌发酵上清液。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述种子培养基的组成为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121℃高灭压菌20min；所述液体发酵培养基的组成可为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121℃高灭压菌20min。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于所述放入种子培养基培养的条件是在28～30℃，转速180～220r/min下，培养12～24h。
8.如权利要求5所述应用，其特征在于所述接入到液体发酵培养基中培养的芽孢杆菌DY26-004种子液的接入量与液体发酵培养基的体积比为1∶100；所述接入到液体发酵培养基中培养的条件可为28～30℃，转速180～220r/min，培养48～72h。
9.如权利要求5所述应用，其特征在于所述离心的条件是在10000r/min下离心15～20min。
10.如权利要求5所述制备方法，其特征在于所述植物致病真菌包括但不限于镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌及胶孢炭疽菌。
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