CN103589674A - 枯草芽孢杆菌Pc3及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用 - Google Patents
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Abstract
枯草芽孢杆菌Pc3及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用，涉及芽孢杆菌。所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3的保藏编号为CCTCC NO：M2013470。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用，防治的植物致病真菌包括：香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌和镰刀菌等。在油菜菌核病菌防治的盆栽试验中有较好的生物防治效果，防效可以达到95.6%。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3发酵上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，生防效果好。
Description
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一种枯草芽孢杆菌Pc3及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
背景技术
随着植物病虫害对已有农药的耐药性及新病害的出现，要求不断开发新的农药。微生物资源一直是农业工作者研究的重点资源，寻找新的微生物源先导化合物或活性产物是农药创制的主要手段之一。但是由于研究开发时间长，对筛选技术要求较高，筛选得到新型农用活性物质越来越困难。从新药研发的进程来看，绝大部分还是来自于自然资源(Bevan et al.1995)，其中包括微生物和植物提取物的活性筛选(Shadomy.1987)。
随着陆地微生物资源的日渐枯竭，从陆源微生物中发现新结构活性物质的几率越来越小。新的微生物类群在微生物代谢产物研究领域越来越受到人们的重视，而且也是筛选新的微生物代谢产物的一条重要途径。近年对海洋和极地微生物资源的研究结果充分证明，利用海洋和极地微生物资源研制开发新型药物具有着巨大的潜力和诱人的前景(Zhang et al.2005)。
南极由于其独有的地理及气候特征，是一个潜在的、有待开发的微生物资源库。它不仅是独特生态系统微生物的生存繁衍地，而且是新型生物活性物质（如酶、多糖及脂类等)和先导化合物合成菌株的潜在种源地。在这种特殊的生态多样性环境中生存的微生物，可能具有不同于陆生微生物的独特的遗传和代谢多样性。因此，南极微生物资源可能是新型化合物或新型活性代谢产物的潜在来源。
芽孢杆菌是一类好氧、能产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌。这类菌能产生脂肽抗生素、细胞壁降解酶类、细菌素、抗菌蛋白及挥发性抗菌物质，对某些植物病原真菌或细菌、甚至某些动物病原菌、病毒等表现出一定的抑制作用（(Stein2005）。同时，这类细菌可以通过发酵大规模获得，且产生的芽孢对高温、强酸、紫外线具有很强的耐受力。因此，有关芽孢杆菌的研究已成为近几年国内外的研究热点之一。已报道的能抑制真菌生长的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuriniensis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloloquefaci)等。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3。
本发明的目的之二在于提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3分离自中国第28次南极科学考查所采集的海水样品（D3-3站点；W50.76°，N61.16°）；该菌已于2013年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学，邮编为430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2013470。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3分离自中国第28次南极科学考查所采集的海水样品，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其16S rDNA序列，与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)具有99%的序列相似性；16S rDNA序列的GenBank登录号为KF751703。
为实现植物致病真菌防治的目的，首先将该菌在含有5ml LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到1L发酵培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到发酵上清液，该发酵上清液直接喷洒植物用于致病真菌的防治。
所述LB培养基的组成如下（g/L）：葡萄糖20，KH2PO46，K2HPO414，MgSO40.2，(NH4)2SO44，2ml微量元素（FeSO4·4H2O，CaCl2·2H2O，MnSO4·4H2O，ZnCl2各1mM，过滤除菌后放入无菌试剂瓶中备用），0.1MPa灭菌30min。
所述离心除去菌体是指在6000～8000g下离心10min。
所述菌株活化培养时间为8～12h，发酵培养时间为36～72h；所述菌株培养过程中的pH为5.0～8.0；所述细菌培养发酵的温度为28～37℃。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3抑制的植物致病真菌种类包括以下真菌：香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌和镰刀菌等。在油菜菌核病菌（核盘菌）防治的盆栽试验中有较好的生物防治效果，防效可以达到95.6%。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：芽孢杆菌Pc3发酵上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，生防效果好。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3的菌落形态。
图2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。在图2中：A，长柄链格孢B，绿色木霉C，香蕉炭疽菌D，核盘菌E，立枯丝核菌F，镰刀菌G，宛氏拟青霉。
图3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3的发酵上清液防治油菜菌核病的盆栽试验生防效果。在图3中，Pc3：Pc3发酵上清液处理过油菜植株；CK：发酵培养基处理过油菜植株（作为阴性对照）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3的分离筛选
本发明涉及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3来源于本申请人从中国第28次南极科学考查所采集的海水样品中所分离获得，该菌在LB培养基上生长，30℃培养48h后，菌体呈浅黄色，菌落较大，生长初期菌落呈水滴状，见图1。
实施例2：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3菌种鉴定
利用16S rDNA通用引物27F和1495R(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAT；1495R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT)对南极来源菌株Pc316S rDNA序列进行扩增。以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3总DNA为PCR扩增模板，在Eppendorf PCR扩增仪上进行PCR反应。反应条件为：94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延长1.5min，30个循环。扩增基因送测序公司测序，获得该菌株16S rDNA序列后，将该序列通过NCBI BLAST与GeneBank中核酸数据进行对比分析(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)。结果发现，Pc316S rDNA序列与Bacillus subtilis(EU257448.1)、Bacillus amyloliquefaciens（KF181458.1）、Bacillusamyloliquefaciens（HG328254.1）、Bacillus subtilis（KC196261.1）等菌株的序列相似性为99%，即枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3与芽孢杆菌同源，因此，将其命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3。
实施例3：植物致病真菌抗菌谱的测定
采用滤纸片法测定枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3对7种植物致病真菌的抑制活性。用直径为6mm无菌打孔器将受试致病真菌制成菌块，用牙签挑取一菌块于马铃薯固体培养基（PDA）平板中央，28℃的条件下培养1～2天，等待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，在每个菌块的四周放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，滤纸片距离菌块中心0.5～1cm，再在每个滤纸片上加50μL的无菌发酵上清液，继续培养2～3天，通过与对照培养的比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制，如果受试致病真菌的菌丝体受到抑制时，菌丝体会形成月牙型或者线型边缘。结果如图2所示，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3发酵上清液对香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、镰刀菌等7种受试植物致病真菌具有抑制活性。
实施例4：油菜菌核病（核盘菌感染引起）的生物防治盆栽试验
所选油菜品种为秦优10号，施药时期为油菜盛花后期，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3发酵上清液使用小型喷雾器（500ml）进行均匀喷雾，孔径<7mm，药剂不留残液，然后在油菜叶片和茎杆（接种前用接种针制造微伤口）上接种菌碟（选取1株油菜菌核病菌，活化2天后制成直径5mm的菌碟），接种后的盆铂置于25℃，相对湿度80%的环境下，3天后调查病斑直径（d），计算病斑面积（病斑面积=π*(d/2)2），通过以下公式计算防效：
计算结果表明，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3对油菜菌核病防效达到95.6%。其防治油菜菌核病的盆栽试验生防效果见图3。
Claims (8)
1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3，已于2013年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2013470。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述防治植物致病真菌发酵上清液的制备方法如下：首先将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3在含有5ml LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到1L发酵培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到防治植物致病真菌发酵上清液。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述LB培养基的组成如下：葡萄糖20g/L，KH2PO46g/L，K2HPO414g/L，MgSO40.2g/L，(NH4)2SO44g/L，2ml微量元素，0.1MPa灭菌30min，所述微量元素包括FeSO4·4H2O，CaCl2·2H2O，MnSO4·4H2O，ZnCl2各1mM，过滤除菌后放入无菌试剂瓶中备用。
5.如权利要求3所述应用，其特征在于所述离心除去菌体是在6000～8000g下离心10min。
6.如权利要求3所述应用，其特征在于所述菌株活化培养时间为8～12h，发酵培养时间为36～72h；所述菌株培养过程中的pH为5.0～8.0。
7.如权利要求3所述应用，其特征在于所述细菌培养发酵的温度为28～37℃。
8.如权利要求3所述应用，其特征在于所述植物致病真菌包括：香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌和镰刀菌。
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