CN105132338B - 芽孢杆菌dy26-020及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用 - Google Patents
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Abstract
芽孢杆菌DY26‑020及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用，涉及芽孢杆菌属。所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26‑020的保藏编号为CCTCC NO：M 2015409。芽孢杆菌DY26‑020可用于制备防治植物致病真菌发酵上清液。所述芽孢杆菌防治的植物致病真菌如下：镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。其在油菜菌核病菌防治和小麦赤霉病防治的盆栽试验中有较好的生物防治效果，防效可以达到65％以上。芽孢杆菌DY26‑020发酵上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，生防效果好。
Description
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一种芽孢杆菌DY26-020及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
背景技术
随着人口的增长，农用土地越来越稀少，控制植物病虫害对增加农产品的输出显得越为重要。由于化学农药的毒副作用，以及植物病虫害对已有农药的耐药性及新病害的出现，要求不断开发新的农药。生物农药由于其天然来源，因此施用后具有其自然的降解途径、对环境污染小、人畜毒性低、靶生物较难产生抗药性等优点，使其成为农业生产的可持续发展的新方向。(周仕涛.我国植物源农药的研究及前景[J].西南农业学报,2004,17(4):525-529)
近年来，从传统的土壤微生物中发现结构新颖的活性化合物出现明显的下降趋势。海洋微生物主要包括生活在海水、海洋沉积物及与海洋动植物共附生的微生物，是一个正在开发的重要生物资源(陈菲菲,王勇,王以光,等.海洋微生物来源的天然产物开发研究进展[J].应用与环境生物学报,2011,17(2):287-294)。海洋环境具有高压、高盐、低营养、低温等特点，在这种环境中海洋微生物种类约为陆生微生物的20倍以上。由于代谢途径不同于陆地微生物，海洋微生物可产生许多新颖的生物活性物质，如酶、抗生素、多糖及脂类等(CartéB K.Biomedical potential of marine natural products[J].Bioscience,1996，46(4):271-286)。因此海洋微生物资源是新型化合物或新型活性代谢产物的潜在来源。
芽孢杆菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布广泛，能够产生耐热抗逆的芽孢，利于生防菌剂的生产、加工及在环境中存活与繁殖。此外，芽孢杆菌不但可以单独使用，还可以与化学农药复配，实现增强防效的目的，也可与其他生防菌混合使用，实现多种抗生菌功能互补、兼防多种病害的协同防治效果，这些特点使其成为一种理想的生防微生物(朱玥妍,刘姣,杜春梅.芽孢杆菌生物防治植物病害研究进展[J].安徽农业科学,2013,40(34):16635-16638)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020。
本发明的目的之二在于提供一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。
所述防治植物致病真菌发酵上清液的使用方法如下：将防治植物致病真菌发酵上清液直接或稀释后喷洒在植物上。
所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020分离自中国大洋第26次科学考查所采集的沉积泥样品(S003站点；w63°45.3496′，S3°39.8693′)；该菌已于2015年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2015409。
所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其16SrDNA序列，与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)具有99％的序列相似性；芽孢杆菌(Bacillussp.)DY26-02016S rDNA序列的GenBank登录号为KT240125。
所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020 16S rDNA部分序列如下：
将芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020在含有5ml LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500mL LB培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到发酵上清液，该发酵上清液直接或稀释后喷洒植物用于致病真菌的防治。
所述LB培养基的组成如下：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121℃高灭压菌20min。
所述离心除去菌体是在10000r/min下离心15min。
所述菌株活化培养时间为12～24h，发酵培养时间为48～60h；所述细菌培养发酵的温度为28～30℃，发酵培养摇床转速为180～220r/min。
所述植物致病真菌包括但不限于镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。对油菜菌核病菌(核盘菌)和小麦赤霉病菌(镰刀菌)的防治的盆栽试验中有较好的生物防治效果，对油菜菌核病菌(核盘菌)防效可以达到65.5％，小麦赤霉病菌(镰刀菌)防效67.9％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：发酵上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，生防效果好。
附图说明
图1为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020的菌落形态。
图2为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。在图2中：A：灰霉菌；B：宛氏拟青霉；C：核盘菌；D：绿色木霉；E：立枯丝核菌；F：长柄链格孢；G：胶孢炭疽菌；H：互生链格孢；I：镰刀菌；J：香蕉炭疽菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020的分离筛选
本发明涉及芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020来源于本申请人从中国大洋第26次科学考查所采集的沉积物样品中筛选获得。该菌在LB培养基上生长，28℃培养24h后，菌体呈白色，菌落较小，菌落边缘不规则，见图1。
实施例2：芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020菌种鉴定
利用16S rDNA通用引物27F和1492R(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAT；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT)对大洋来源菌株DY26-02016S rDNA序列进行扩增。以DY26-020总DNA为PCR扩增模板，在Eppendorf PCR扩增仪上进行PCR反应。反应条件为：94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1.5min，30个循环。扩增序列经测序公司测序后，获得该菌株16SrDNA序列。将该序列通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GeneBank中核酸数据(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行对比分析。比对结果显示，DY26-02016S rDNA序列与Bacillus amyloliquefaciens(JQ664685.1)、Bacillus amyloliquefaciens(JQ062537.1)、Bacillus amyloliquefaciens(JF899253.1)等菌株的序列相似性为99％，即芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020与芽孢杆菌同源，因此，将其命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020。
实施例3：植物致病真菌抗菌谱的测定
采用纸片法测定芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020对10种植物致病真菌的抑制活性。用无菌打孔器将受试致病真菌制成菌块，用牙签挑取一菌块接种于马铃薯固体培养基平板中央，28℃的条件下培养。待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，将灭菌的双层滤纸片(直径6mm)放置于菌块四周，滤纸片距离菌丝边缘约1cm。在每个滤纸片上加50μL的无菌发酵上清液，继续培养24h，通过与对照组比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制，若受试致病真菌的菌丝体受到抑制，菌丝体会形成月牙型或者线型边缘。结果如图2所示，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020发酵上清液对10种受试植物致病真菌具有抑制活性，分别为：镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。
实施例4：油菜菌核病(核盘菌感染引起)的生物防治盆栽试验
油菜菌核病菌在马铃薯蔗糖琼脂培养基上培养5天后制成直径5mm的菌碟，留待备用。于油菜主茎开花期，在叶片和茎杆上接种油菜菌核病菌菌碟，接种后的盆钵置于25℃，相对湿度80％的环境下。油菜盛花后期，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020发酵上清液利用小型喷雾器(500mL)进行均匀喷雾，孔径<7mm，药剂不留残液。3天后调查叶片调查病斑直径(d)，计算病斑面积，病斑面积＝π×(d/2)2，茎秆量取病斑长度，按下式计算防效：
计算结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020对油菜菌核病防效达到65.5％。。
实施例5：小麦赤霉病(镰刀菌感染引起)的生物防治盆栽试验
镰刀菌制成106个/mL的孢子悬浮液，于小麦扬花期，将10μL孢子悬浮液滴注入麦穗中部的小花内。24h后，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020发酵上清液利用小型喷雾器(500mL)进行均匀喷雾防治，孔径<7mm，药剂不留残液。乳熟后期逐穗记载严重度，分级，计算病情指数、防治效果。
分级方法：
0级：全穗无病；
1级：感病穗面积占全穗面积的四分之一以下；
3级：感病穗面积占全穗面积的四分之一至二分之一；
5级：感病穗面积占全穗面积的二分之一至四分之三以下；
7级：感病穗面积占全穗面积的四分之三以上。
药效计算方法如下：
计算结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-020小麦赤霉病防效达到67.9％。
Claims (6)
1.芽孢杆菌（Bacillus sp.）DY26-020，已于2015年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2015409；
16S rDNA部分序列如下：
1 GATGGGAGCT TGCTCCCTGA TGTTAGCGGC GGACGGGTGA GTAACACGTG
51 GGTAACCTGC CTGTAAGACT GGGATAACTC CGGGAAACCG GGGCTAATAC
101 CGGATGGTTG TCTGAACCGC ATGGTTCAGA CATAAAAGGT GGCTTCGGCT
151 ACCACTTACA GATGGACCCG CGGCGCATTA GCTAGTTGGT GAGGTAACGG
201 CTCACCAAGG CGACGATGCG TAGCCGACCT GAGAGGGTGA TCGGCCACAC
251 TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTAGGGAATC
301 TTCCGCAATG GACGAAAGTC TGACGGAGCA ACGCCGCGTG AGTGATGAAG
351 GTTTTCGGAT CGTAAAGCTC TGTTGTTAGG GAAGAACAAG TGCCGTTCAA
401 ATAGGGCGGC ACCTTGACGG TACCTAACCA GAAAGCCACG GCTAACTACG
451 TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGTAGGTGGC AAGCGTTGTC CGGAATTATT
501 GGGCGTAAAG GGCTCGCAGG CGGTTTCTTA AGTCTGATGT GAAAGCCCCC
551 GGCTCAACCG GGGAGGGTCA TTGGAAACTG GGGAACTTGA GTGCAGAAGA
601 GGAGAGTGGA ATTCCACGTG TAGCGGTGAA ATGCGTAGAG ATGTGGAGGA
651 ACACCAGTGG CGAAGGCGAC TCTCTGGTCT GTAACTGACG CTGAGGAGCG
701 AAAGCGTGGG GAGCGAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA
751 ACGATGAGTG CTAAGTGTTA GGGGGTTTCC GCCCCTTAGT GCTGCAGCTA
801 ACGCATTAAG CACTCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGAC TGAAACTCAA
851 AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA
901 AGCAACGCGA AGAACCTTAC CAGGTCTTGA CATCCTCTGA CAATCCTAGA
951 GATAGGACGT CCCCTTCGGG GGCAGAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG
1001 TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC
1051 TTGATCTTAG TTGCCAGCAT TCAGTTGGGC ACTCTAAGGT GACTGCCGGT
1101 GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAATCATCAT GCCCCTTATG
1151 ACCTGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGACA GAACAAAGGG CAGCGAAACC
1201 GCGAGGTTAA GCCAATCCCA CAAATCTGTT CTCAGTTCGG ATCGCAGTCT
1251 GCAACTCGAC TGCGTGAAGC TGGAATCGCT AGTAATCGCG GATCAGCATG
1301 CCGCGGTGAA TACGTTCCCG GGCCTTGTAC ACACCGCCCG TCACACCACG
1351 AGAGTTTGTA ACACCCGAAG TCGGTGAGGT AA。
2.如权利要求1所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）DY26-020在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用；
所述防治植物致病真菌发酵上清液的使用方法如下：将防治植物致病真菌发酵上清液直接或稀释后喷洒在植物上；
所述防治植物致病真菌发酵上清液的制备方法如下：首先将芽孢杆菌（Bacillus sp.）DY26-020在含有5 mL LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500 mLLB培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到防治植物致病真菌发酵上清液；
所述植物致病真菌为镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌和胶孢炭疽菌中的至少一种。
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于所述LB培养基的组成如下：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5g/L，121 °C高灭压菌20 min。
4.如权利要求2所述制备方法，其特征在于所述离心除去菌体是在10000 r/min下离心15~20 min。
5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于所述菌株活化培养时间为12~24 h，发酵培养时间为48~72 h。
6.如权利要求2所述制备方法，其特征在于所述细菌培养发酵的温度为28~30 °C，发酵培养摇床转速为180~220 r/min。
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| 海洋细菌抗菌筛选及深海独岛枝芽胞杆菌 Ａ４９３活性物质分离鉴定;张少博等;《化学与生物工程》;20131231;第30卷(第10期);第16-23页 * |
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