CN105132339B - 一株广谱抗真菌芽孢杆菌及其在防治小麦赤霉病中的应用 - Google Patents
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Abstract
一株广谱抗真菌芽孢杆菌及其在防治小麦赤霉病中的应用，涉及一株芽孢杆菌。所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26‑010的保藏编号CCTCC NO：M 2015407。所述芽孢杆菌发酵上清液可拮抗镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。芽孢杆菌DY26‑010发酵上清液对小麦赤霉病的病原菌镰刀菌拮抗作用强，在小麦赤霉病的盆栽试验中，防效可以达到57.1％，可用于制备应用于防治小麦赤霉病发酵上清液。提供了小麦赤霉病的生物防治方法，不使用化学农药，具有无毒、不易产生抗药性、环境和生物安全等优点，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一株广谱抗真菌芽孢杆菌DY26-010及其在防治小麦赤霉病中的应用。
背景技术
小麦赤霉病是由镰刀菌属真菌引起的小麦一大病害，其发生不仅会引起小麦减产，而且由于镰刀菌产生的毒素(如DON等)威胁人及动物安全。小麦花期降雨日数多，而小麦赤霉病受气候因素的影响较大，降雨和气流给小麦赤霉病的发生和流行提供有利条件，也给化学防治带来许多困难(陈华保,肖方琼,谢婷,等.小麦内生菌对小麦赤霉病菌的抑制活性[J].西北农业学报,2011,20(7):46-49)。另外，在选育抗病品种方面常规育种存在一定难度，一直未获得突破性进展(Bai G,Shaner G.Management and resistance in wheatand barley to Fusarium head blight 1[J].Annu.Rev.Phytopathol.,2004,42:135-161)。实际生产中使用多菌灵或其复配剂来防治赤霉病，虽然效果较好，但连续使用后存在产生抗药性的问题。因此，继续使用多菌灵防治小麦赤霉病将存在着防治失败的潜在威胁。
随着综合防治措施的不断完善，生物防治开始在植物病害防治中应用，为传统的病害防治策略提出新的方向。植物病害生物防治是指利用拮抗作用的微生物或微生物代谢产物对植物病害进行有效防治的方法；从实质上说，就是利用微生物种间的抗生、竞争、重寄生，或者通过微生物代谢产物的溶菌作用等，来抑制某些病原菌的活动甚至杀死(李凯,袁鹤.植物病害生物防治概述[J].山西农业科学,2012,40(7):807-810)。由于其来源的天然性以及对人畜和环境低毒等特点，而越来越受到重视。
在生物防治的活动中，拮抗细菌及其代谢产物都起到了重要作用。目前，应用最多的生防细菌主要是芽孢杆菌，芽孢杆菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布广泛。应用的芽胞杆菌主要有：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)以及短小芽孢杆菌(B.pumilis)等(周晓梅,刘强,王瑛璐.拮抗菌生物防治农作物病害的研究进展[J].吉林师范大学学报:自然科学版,2010,31(4):36-39)。已有大量研究表明芽胞杆菌可通过拮抗作用、竟争作用抑制病原菌生长，分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物获得系统抗性以达到抑制植物病原菌的效果(Smilanick J L,Margosan D A,Mlikota F,et al.Control of citrus greenmold by carbonate and bicarbonate salts and the influence of commercialpostharvest practices on their efficacy[J].Plant Disease,1999,83(2):139-145)。尤其是来自海洋极端环境条件下的芽孢杆菌，其生长条件、代谢类型和产物与陆地来源的不同，从而有可能开发出更具有应用价值的芽孢杆菌。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株广谱抗真菌芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010。
本发明的目的之二在于提供一种广谱抗真菌芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010在制备防治小麦赤霉病发酵上清液中的应用。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010分离自中国大洋第26次科学考查所采集的沉积物样品(S003站点；W63°45.3496′，S3°39.8693′)；该菌已于2015年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2015407。
通过16S rDNA同源性分析，以芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010菌株的基因组DNA为模版扩增其16S rDNA序列，PCR产物为单一条带，回收纯化后，进行DNA测序。将DY26-010的16S rDNA序列，与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)具有99％的序列相似性。其16S rDNA序列的GenBank登录号为KT270353。
所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010的16S rDNA部分序列如下：
所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010可在制备防治小麦赤霉病发酵上清液中的应用。
所述小麦赤霉病包括但不限于镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。
所述防治小麦赤霉病发酵上清液的制备方法如下：
将芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010在LB培养基中活化培养，再将活化培养后的菌株接种到LB培养基中进行扩大培养，离心除去菌体，即得防治小麦赤霉病发酵上清液。
所述LB培养基的组成可为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，121℃高灭压菌20min。
所述活化培养的条件可为：在28～30℃，180～220r/min下，培养12～24h；所述扩大培养的条件可为：在28～30℃，180～220r/min下，培养50～60h。
所述离心除去菌体的条件可在10000r/min下离心15～20min。
所述防治小麦赤霉病发酵上清液的使用方法如下：将防治小麦赤霉病发酵上清液喷施在小麦植株上。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的所述的广谱抗真菌芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010发酵上清液能拮抗多种植物致病真菌，包括：镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。
(2)在生物防治盆栽试验中，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010对镰刀菌引起的小麦赤霉病的生物防治效果较好，防效达到57.1％。
(3)本发明芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010应用于小麦赤霉病菌的防治，可完全克服因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于农产品的无公害生产，提高农产品质量。
附图说明
图1为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010的菌落形态。
图2为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。在图2中：A：灰霉菌；B：宛氏拟青霉；C：核盘菌；D：绿色木霉；E：立枯丝核菌；F：长柄链格孢；G：胶孢炭疽菌；H：互生链格孢；I：镰刀菌；J：香蕉炭疽菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010的分离筛选
本发明涉及芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010来源于本申请人从中国大洋第26次科学考查所采集的沉积泥样品中筛选获得。该菌在LB培养基上生长，28℃培养24h后，菌体呈淡黄色，半透明，边缘整齐，表面光滑且有光泽，菌落形态见图1。
实施例2：芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010菌种鉴定
以芽孢杆菌DY26-020总DNA为模版，细菌通用引物扩增其16S rDNA序列，通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAT；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反应条件为：94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1.5min，30个循环。扩增序列经测序公司测序后，获得该菌株16S rDNA序列。将该序列通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GeneBank中核酸数据进行对比分析(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)。比对结果显示，DY26-010 16S rDNA序列与Bacillus amyloliquefaciens(JQ245705.1)、Bacillus amyloliquefaciens(HQ844506.1)、Bacillus methylotrophicus(KC790301.1)、Bacillus amyloliquefaciens(KC478951.1)、Bacillus amyloliquefaciens(JX081245.1)等菌株的序列相似性为99％，即芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010与芽孢杆菌同源，因此，将其命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010。
实施例3：植物致病真菌抗菌谱的测定
采用纸片法测定芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010对10种植物致病真菌的抑制活性。用无菌打孔器将受试致病真菌制成菌碟，接种于马铃薯固体培养基(PDA)平板中央，28℃的条件下培养。待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，将灭菌的双层滤纸片(直径6mm)放置于菌块四周，滤纸片距离菌丝边缘约1cm。
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010摇床培养2天后，经10000转离心10min，过滤除菌后制成无菌发酵上清液，滴加在每个滤纸片上，50μL/滤纸片。28℃继续培养24h，通过与对照组比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制。结果如图2所示，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010发酵上清液对10种受试植物致病真菌具有抑制活性，分别为：镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌。
实施例3：小麦赤霉病(镰刀菌感染引起)的生物防治盆栽试验
镰刀菌制成106个/mL的孢子悬浮液，于小麦扬花期，将10μL孢子悬浮液滴注入麦穗中部的小花内。24h后，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010发酵上清液利用小型喷雾器(500ml)进行均匀喷雾防治，孔径<7mm，药剂不留残液。乳熟后期逐穗记载严重度，分级，计算病情指数、防治效果。
分级方法：
0级：全穗无病；
1级：感病穗面积占全穗面积的四分之一以下；
3级：感病穗面积占全穗面积的四分之一至二分之一；
5级：感病穗面积占全穗面积的二分之一至四分之三以下；
7级：感病穗面积占全穗面积的四分之三以上。
药效计算方法：
计算结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)DY26-010小麦赤霉病防效达到57.1％。
Claims (8)
1.芽孢杆菌（Bacillus sp.）DY26-010，已于2015年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为 CCTCC NO：M 2015407；
16S rDNA部分序列如下：
1 TACCTCACCG ACTTCGGGTG TTACAAACTC TCGTGGTGTG ACGGGCGGTG
51 TGTACAAGGC CCGGGAACGT ATTCACCGCG GCATGCTGAT CCGCGATTAC
101 TAGCGATTCC AGCTTCACGC AGTCGAGTTG CAGACTGCGA TCCGAACTGA
151 GAACAGATTT GTGGGATTGG CTTAACCTCG CGGTTTCGCT GCCCTTTGTT
201 CTGTCCATTG TAGCACGTGT GTAGCCCAGG TCATAAGGGG CATGATGATT
251 TGACGTCATC CCCACCTTCC TCCGGTTTGT CACCGGCAGT CACCTTAGAG
301 TGCCCAACTG AATGCTGGCA ACTAAGATCA AGGGTTGCGC TCGTTGCGGG
351 ACTTAACCCA ACATCTCACG ACACGAGCTG ACGACAACCA TGCACCACCT
401 GTCACTCTGC CCCCGAAGGG GACGTCCTAT CTCTAGGATT GTCAGAGGAT
451 GTCAAGACCT GGTAAGGTTC TTCGCGTTGC TTCGAATTAA ACCACATGCT
501 CCACCGCTTG TGCGGGCCCC CGTCAATTCC TTTGAGTTTC AGTCTTGCGA
551 CCGTACTCCC CAGGCGGAGT GCTTAATGCG TTAGCTGCAG CACTAAGGGG
601 CGGAAACCCC CTAACACTTA GCACTCATCG TTTACGGCGT GGACTACCAG
651 GGTATCTAAT CCTGTTCGCT CCCCACGCTT TCGCTCCTCA GCGTCAGTTA
701 CAGACCAGAG AGTCGCCTTC GCCACTGGTG TTCCTCCACA TCTCTACGCA
751 TTTCACCGCT ACACGTGGAA TTCCACTCTC CTCTTCTGCA CTCAAGTTCC
801 CCAGTTTCCA ATGACCCTCC CCGGT。
2.如权利要求1 所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）DY26-010在制备防治小麦赤霉病发酵上清液中的应用；
所述小麦赤霉病为镰刀菌、香蕉炭疽菌、宛氏拟青霉、核盘菌、长柄链格孢、绿色木霉、立枯丝核菌、互生链格孢、灰霉菌、胶孢炭疽菌中的至少一种。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述防治小麦赤霉病发酵上清液的使用方法如下：将防治小麦赤霉病发酵上清液喷施在小麦植株上。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述防治小麦赤霉病发酵上清液的制备方法如下：
将芽孢杆菌（Bacillus sp.）DY26-010在LB培养基中活化培养，再将活化培养后的菌株接种到LB培养基中进行扩大培养，离心除去菌体，即得防治小麦赤霉病发酵上清液。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于所述LB培养基的组成为：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，121 °C高灭压菌20min。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于所述活化培养的条件为：在28~30 ℃，180~220r/min下，培养12~24 h。
7.如权利要求4所述应用，其特征在于所述扩大培养的条件为：在28~30 ℃，180~ 220r/min下，培养50~ 60 h。
8.如权利要求4所述应用，其特征在于所述离心除去菌体的条件是在10000 r/min下离心15~20min。
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