CN113174352A - 枯草芽孢杆菌hf1突变体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了枯草芽孢杆菌HF1突变体及其构建方法与应用，该突变体是利用基因工程手段将枯草芽孢杆菌HF1 Fengycin操纵子的启动子替换成基因smpB的启动子得到的。与HF1相比，无论是活菌还是无菌发酵液上清均表现出更强的对核盘菌的抑杀作用以及优异的抗油菜菌核病特性，为防治油菜菌核病提供优良菌株。

Description

枯草芽孢杆菌HF1突变体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物学和基因工程技术领域，具体地说，涉及枯草芽孢杆菌HF1突变体及其构建方法与应用。

背景技术

油菜菌核病是一种由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)等盘菌属真菌引起的土传、气传真菌病害。核盘菌寄主非常广泛，是许多重要农作物如：油菜、大豆和许多蔬菜作物等主要的病原真菌(Bolton et al.,2006)。油菜菌核病是影响油菜生长的主要病害之一。油菜菌核病在世界油菜生产国均有分布，在我国东南沿海和长江流域发病极其严重，病害不仅影响油菜的各项品质还会导致油菜大幅度减产，最严重时可导致减产70％，甚至绝收。对油菜菌核病的防治主要是加强作物管理、喷洒化学农药和选育抗病品种。然而，利用传统耕作制度的作物管理防治方法收效甚微。喷洒化学农药带来的环境污染，农药残留，病原菌抗药性增强等问题也日益突出(Saharan and Mehta,2008)。在选育抗病品种方面，虽然油菜品种或种质的抗性变异是存在的，但是油菜菌核病免疫品种较难发现。目前，利用有益微生物进行生物防治的研究和应用成为热点。研究发现约45种真菌和两种细菌(假单胞杆菌、芽孢杆菌)对核盘菌能产生拮抗作用。其中枯草芽孢杆菌对核盘菌的防控作用具有重要潜在价值。Elkahoui等分离得到的Bacillus subtilis BCLRB2产生的抗菌脂肽Bacillomycin D对菌核病有较强的防控作用(Elkahoui et al.,2014)。Athukorala等从Bacillus subtilis 49培养基中分离出的抗菌脂肽经MALDI-TOF鉴定为Fengycin和Bacillomycin D，抑菌实验发现其对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和核盘菌表现出较高的抗真菌活性(Athukorala et al.,2009)，是防治油菜菌核病的优良菌种。

枯草芽孢杆菌HF1是中国科学院遗传与发育生物学研究所申请的专利菌株(参见CN108603161A，菌种保藏编号为CGMCC No.11487)，该菌株对多种病原真菌具有抗性，对核盘菌也具有一定程度的抑杀作用。

发明内容

本发明的目的是提供枯草芽孢杆菌HF1突变体及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌HF1突变体，所述突变体是利用基因工程手段(如同源重组技术)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF1Fengycin操纵子的启动子替换成基因smpB的启动子得到的。

本发明中，基因smpB来源于枯草芽孢杆菌，优选HF1。基因smpB在NCBI上的参考序列编号为936170。

其中，Fengycin操纵子包含fenA、fenB、fenC、fenD和fenE，在NCBI上的参考序列编号分别为939983、939993、940102、940013和939956。

进一步地，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF1/PsmpB-fenA，其为枯草芽孢杆菌HF1突变体，该菌株现已保藏于现已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.21897，保藏日期2021年3月12日。

第二方面，本发明提供枯草芽孢杆菌HF1突变体的构建方法，包括以下步骤：

1)提取枯草芽孢杆菌HF1的基因组DNA，设计引物，分别克隆得到基因smpB的启动子以及Fengycin操纵子的启动子的上游同源臂和下游同源臂；

2)利用In-fusion体系，将Fengycin操纵子的启动子的上游同源臂、基因smpB的启动子以及Fengycin操纵子的启动子的下游同源臂依次连接到载体pKSV7上，然后用所得重组载体(pKSV7-up-SmpB-down)转化(如电转化)枯草芽孢杆菌HF1，筛选阳性克隆。所得枯草芽孢杆菌HF1突变体命名为HF1/PsmpB-fenA。

优选地，基因smpB的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，Fengycin操纵子的启动子的上游同源臂和下游同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。

优选地，基因smpB的启动子的扩增引物序列如SEQ ID NO:4-5所示，Fengycin操纵子的启动子的上游同源臂的扩增引物序列如SEQ ID NO:6-7所示，Fengycin操纵子的启动子的下游同源臂的扩增引物序列如SEQ ID NO:8-9所示。

第三方面，本发明提供枯草芽孢杆菌HF1、所述枯草芽孢杆菌HF1突变体或按照上述方法构建得到的枯草芽孢杆菌HF1突变体的以下任一应用：

1)用于防治核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；

2)用于防治由核盘菌所导致的植物病害。

第四方面，本发明提供枯草芽孢杆菌HF1、所述枯草芽孢杆菌HF1突变体或按照上述方法构建得到的枯草芽孢杆菌HF1突变体的发酵液上清的以下任一应用：

i)用于防治核盘菌；

ii)用于防治由核盘菌所导致的植物病害。

本发明中，枯草芽孢杆菌发酵液上清的制备方法包括：取一环甘油管保存的枯草芽孢杆菌菌液并在LB固体培养基划线，37℃培养箱中培养16h活化菌种，将活化后的单菌落接种于50mL离心管装液量为10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm培养18h后，作为种子液，取2mL种子液接种于250mL三角瓶装液量为100mL的硝酸钾液体培养基(葡萄糖28g/L，KNO₃6g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L)中，于28℃，180rpm摇床振荡培养枯草芽孢杆菌48-72h，取发酵液于离心机12,000～14,000g离心2min，收集发酵液上清，用0.22μm无菌微孔滤膜过滤器过滤后备用。

本发明中，所述植物包括油菜、向日葵、花生、大豆、豌豆、菜豆、莴苣、甜菜、小白菜、一品红和柑橘等。

优选地，所述植物病害为油菜菌核病。

第五方面，本发明提供一种提高枯草芽孢杆菌HF1胞外真菌细胞壁降解酶活性的方法，利用基因工程手段将枯草芽孢杆菌HF1 Fengycin操纵子的启动子替换成基因smpB的启动子，得到改造后的枯草芽孢杆菌HF1，然后发酵培养改造后的菌株，并从发酵液中分离纯化得到胞外真菌细胞壁降解酶。

本发明中，所述胞外真菌细胞壁降解酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶。

本发明利用基因工程手段，用枯草芽孢杆菌HF1基因smpB启动子替换Fengycin操纵子自身启动子，得到突变体HF1/PsmpB-fenA，意外发现突变体HF1/PsmpB-fenA无论是活菌还是无菌发酵液上清均表现出优异的抗油菜菌核病特性，突变体HF1/PsmpB-fenA为防治油菜菌核病提供优良菌株。

附图说明

图1为本发明中pKSV7穿梭载体结构示意图。

图2为本发明较佳实施例中pKSV7-up-smpB-down枯草芽孢杆菌同源重组载体示意图。

图3为本发明较佳实施例中活菌抑制率；其中，A：活菌抑制图片；B：抑制率柱状图，指示菌为油菜核盘菌(S.sclerotiorum)。

图4为本发明较佳实施例中无菌上清抑制率；其中，A：无菌上清抑制图片；B：抑制率柱状图。菌株HF1、突变体HF1/PsmpB-fenA分别在硝酸钾培养基培养24h，36h，48h，60h和72h的发酵液过滤除去菌体后抑菌实验，数据来自三次独立的生物学重复，每次生物学重复包括三个技术重复，**P<0.01，****P<0.001vs.HF1。

图5为本发明较佳实施例中野生型菌株HF1和突变体HF1/PsmpB-fenA对油菜菌核病致病性的影响；其中，A：油菜叶离体致病性测试；B：HF1/PsmpB-fenA、HF1菌悬液(1×10⁸CFU/mL)处理油菜叶片后立即接种油菜核盘菌，72h后与硝酸钾培养基处理后接种油菜核盘菌的油菜叶片对照组比较病斑直径，****P<0.001，***P<0.05。

图6为本发明较佳实施例中实时荧光定量PCR检测启动子PsmpB和PfenA驱动靶基因fenA、fenB、fenC、fenD和fenE相对表达量。注：定量RT-PCR分析启动子PsmpB和PfenA在硝酸钾培养基中24h，36h，48h，60h和72h驱动靶基因fenA、fenB、fenC、fenD和fenE的相对表达量。

图7为本发明较佳实施例中突变体HF1/PsmpB-fenA和HF1抗菌物质LC-MS检测总离子图(TIC)；注：1为HF1菌株抗菌活性物质LC-MS检测总离子图，2为突变体HF1/psmpB-fenA菌株抗菌活性物质LC-MS检测总离子图，在4.5min-8.5min突变体HF1/PsmpB-fenA菌株检测不到Fengycin。

图8为本发明较佳实施例中突变体HF1/PsmpB-fenA和HF1菌株产真菌细胞壁降解酶活性；注：菌株HF1、突变体HF1/PsmpB-fenA在硝酸钾培养基培养12h，24h，36h，48h，60h和72h测定蛋白酶、淀粉酶、几丁质酶、葡聚糖酶和纤维素酶的活性。

具体实施方式

本发明旨在对枯草芽孢杆菌HF1进行改造，使改造后的HF1具有更强的对核盘菌的抑杀作用，并能用于防治油菜菌核病及其他作物由于核盘菌感染造成的病害，减少化学农药的使用，保护环境、减少农作物药残，提高作物产量和品质。

为了达到上述目的，一方面本发明利用基因工程手段将枯草芽孢杆菌HF1Fengycin操纵子的启动子更换成基因smpB的启动子(来源于枯草芽孢杆菌)，得到阳性突变体HF1/PsmpB-fenA。具体地，本发明的技术方案如下：根据已发表的枯草芽孢杆菌168基因组的注释，得到枯草芽孢杆菌HF1基因smpB启动子和Fengycin操纵子序列，根据序列设计合成寡核苷酸引物，提取枯草芽孢杆菌HF1的基因组DNA后，克隆smpB基因启动子及Fengycin操纵子启动子上游及下游同源臂序列，并构建到穿梭载体pKSV7(图1)上，得到图2所示的重组载体pKSV7-up-SmpB-down，然后将重组质粒通过电转化转入枯草芽孢杆菌HF1之后，载体上Fengycin操纵子启动子上游及下游同源臂通过与枯草芽孢杆菌HF1基因组发生同源重组反应，将Fengycin操纵子的启动子更换成基因smpB的启动子，筛选阳性克隆，得到突变体HF1/PsmpB-fenA。该突变体表现出优异的抑杀核盘菌作用及很强的抗油菜菌核病特性。

另一方面，本发明发现突变体HF1/PsmpB-fenA无菌上清对核盘菌具有很强的抑杀作用，比野生型HF1对核盘菌的拮抗作用显著增强。具体地，活菌拮抗实验发现，突变体HF1/PsmpB-fenA活菌对油菜核盘菌的抑制率可达47.33％，而枯草芽孢杆菌HF1对核盘菌的抑制率为45.73％(图3，A和B)；突变体HF1/PsmpB-fenA发酵液无菌上清体外抗菌实验表明，突变体HF1/PsmpB-fenA发酵培养24-72小时的发酵液无菌上清抑菌活性显著强于野生型HF1，且突变体HF1/PsmpB-fenA发酵培养36小时的无菌上清液抑菌活性最强，抑制率可达73.14％，而野生型HF1的发酵无菌上清液对核盘菌的抑制率仅为62.54％(图4，A和B)。

另一方面，本发明发现突变体HF1/PsmpB-fenA可显著抑制油菜菌核病病斑在离体油菜叶片上的扩展，其生物防治效果可达67.1％(P<0.001)(图5，A和B)。鉴于此，突变体HF1/PsmpB-fenA可应用于油菜菌核病的防治，也可用于其它作物由核盘菌引起的病害，如向日葵、花生、大豆、豌豆、菜豆、莴苣、甜菜、小白菜、一品红和柑橘等。

另一方面，将Fengycin操纵子的启动子更换成基因smpB的启动子形成的突变体HF1/PsmpB-fenA，其Fengycin操纵子中的5个基因的表达显著降低(图6)，Fengycin含量显著降低，在4.5min-8.5min质谱水平检测不到Fengycin(图7)，但是突变体HF1/PsmpB-fenA培养12h-48h时，发酵液上清中淀粉酶活性远高于菌株HF1，在发酵培养12h-72h时，发酵液上清中蛋白酶和纤维素酶活力也都高于菌株HF1，在培养24h-72h时，发酵液上清中几丁质酶活性也高于菌株HF1，而β-1,3-葡聚糖酶活性在发酵前48h突变体HF1/PsmpB-fenA高于菌株HF1，60h-72h突变体HF1/PsmpB-fenA低于菌株HF1(图8)。综合考虑，突变体HF1/PsmpB-fenA发酵上清抗油菜核盘菌能力增强可能是由于胞外真菌细胞壁降解酶活性增强导致。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook and Russell,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枯草芽孢杆菌HF1基因组DNA的提取

利用酵母DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京，中国)，获得Bacillussubtilis HF1基因组DNA，具体操作如下：将约含有2×10⁹的菌体培养液，12,000～14,000g离心2min去上清，急速冷冻后37℃温浴2min。加入180μL Lysozyme Solution混匀，37℃静置30min，加入200μL Extraction Solution混匀。加入20μL proteinase K solution，涡旋震荡混合。56℃水浴1h，每隔一段时间可震荡5～10秒，直至液体澄清。14,000g离心5min，将上清移至到新的1.5mL离心管中，加入4μL RNase A solution，室温静置5min。加入200μLBinding Solution，涡旋震荡混合均匀。70℃温浴10min，加入200μL Ethanol，涡旋震荡此混合液加至spin column中，12,000～14,000g离心1min。丢弃滤液，加入300μL BindingSolution，12,000～14,000g离心1min。丢弃滤液，加入700μL Wash Solution，12,000～14,000g离心1min，重复此步骤一次。弃滤液，12,000～14,000g离心5min，吹干，去除残留的酒精。将Spin column置于新的1.5mL离心管中，加入100～200μL无菌水(65℃温浴)，静止2min。12,000～14,000g离心1min将DNA回收，保存于-20℃。

实施例2枯草芽孢杆菌HF1基因smpB的启动子及Fengycin操纵子启动子上、下游同源臂的克隆及载体的构建

通过Prodiga软件(Hyatt et al.,2010)对组装基因组进行编码基因预测，利用预测得到的基因序列与COG(Tatusov et al.,2000)、KEGG(Kanehisa et al.,2004)、Swiss-Prot(Boeckmann et al.,2003)、TrEMBL(Boeckmann et al.,2003)、Nr(Deng et al.,2006)等功能数据库进行BLAST(Altschul et al.,1997)比对，得到基因功能注释结果，查找获得基因smpB的启动子序列144bp及Fengycin操纵子启动子上下游同源臂序列各827bp、828bp。以Bacillus subtilis HF1的基因组DNA作为模板，设计基因smpB启动子扩增引物(forward：5′-TCGAGCTCGGTACCCGGGGCCAGAACCTCCTCTCTCTAAGGA-3′，reverse：5′-GAGTCAATAAGTCGACCAGCTCAACCAGCAAATAGGGC-3′，SEQ ID NO:4-5)，Fengycin操纵子启动子上游同源臂扩增引物(forward：5′-ATCCTCTAGAGTCGACTTATTGACTCGCCAAAATGACAGCGA-3′，reverse：5′-GGCCAGTGCCAAGCTTTCTCTCCGAAAACCGATTATATAACGATAAAGAAC-3′，SEQ ID NO:6-7)，下游同源臂扩增引物(forward：5′-ACATGATTACGAATTCGTTGCCATAGTAGGTGCCAATGG-3′，reverse：5′-GGAGGTTCTGGCCCCGGGTTGAGCGAACATACTTATTCTTTAACCCATGC-3′，SEQ IDNO:8-9)，用pfu酶(2×High-Fidelity Master Mix)扩增基因smpB启动子和Fengycin操纵子启动子上、下游同源臂。扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，退火和延伸35个循环；72℃延伸5min。三段序列的PCR产物经试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)纯化后，待用。

利用In-fusion体系(上海翊圣生物科技有限公司，上海，中国)，将Fengycin操纵子启动子上游同源臂、smpB启动子和下游同源臂依次连接到pKSV7载体(Yakhnin et al.,2004)上，获得载体pKSV7-up-SmpB-down(图2)，具体如下：将3μL酶切后的pKSV7(100ng/μL，用Hind III、Sal I酶切)，2μL Fengycin操纵子启动子上游同源臂PCR产物(80ng/μL)和5μLIn-fusion Mix混合，50℃孵育50-60min；转化大肠杆菌DH5α，通过PCR鉴定筛选阳性克隆，经测序鉴定后，用同样的方法通过Sal I、Sma I酶切位点将smpB启动子序列构建在载体上，通过Sma I、EcoR I酶切位点将Fengycin操纵子启动子下游同源臂序列构建在载体上，获得最终的表达载体pKSV7-up-PsmpB-down(图2)。

实施例3枯草芽孢杆菌HF1遗传转化及阳性转基因菌株的筛选

将待转化的重组质粒和枯草芽孢杆菌HF1感受态细胞混匀并冰浴进行电击，得到转入枯草芽孢杆菌HF1的具有抗氯霉素的细胞，经PCR鉴定正确的单克隆(含pKSV7-up-SmpB-down重组质粒)接种于LB液体培养基试管(不加抗生素)，30℃培养12h，将该试管转移至40℃，每隔12h转接1次，连续转接4次；稀释至1/100后，取100μL涂布无抗LB固体平板上，挑取单克隆分别点在氯霉素Cm(5μg/mL)和无抗LB固体板上，将在氯霉素Cm(5μg/mL)板上不长，但在无抗板上生长的单克隆保菌并提取基因组DNA，用引物(forward：5′-GAAGGTATGCCTTCAGAC-3′，reverse：5′-TTTTCCGAGGGGGTTTTT-3′)进行鉴定敲入启动子PsmpB，筛选出阳性克隆，得到突变体HF1/PsmpB-fenA(保藏编号CGMCC No.21897)。

实施例4平板菌落对峙法测定突变体HF1/PsmpB-fenA对核盘菌的抑制作用

在配置好的PDA培养基(200g/L马铃薯，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂，1000mL蒸馏水，高压灭菌)的培养皿底部找到中心点，然后在其上划十字线，将直径为6mm的油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)菌饼接种到中心；将37℃过夜培养的突变体HF1/PsmpB-fenA和枯草芽孢杆菌HF1单菌落点到距离中心30mm的4个方向，在PDA培养基中心接种病原菌而在其他地方不接种突变体HF1/PsmpB-fenA和枯草芽孢杆菌HF1来作为对照组。在对照组的病原菌铺满整个培养基平板时，再测量实验组中突变体HF1/PsmpB-fenA、枯草芽孢杆菌HF1对致病菌的拮抗直径。抑制菌丝生长率(％)＝(对照病原菌落的平均直径－处理病原菌落的平均直径)/对照病原菌落的平均直径×100％。

结果见图3，突变体HF1/PsmpB-fenA活菌对油菜核盘菌的抑制率可达47.33％，而枯草芽孢杆菌HF1对核盘菌的抑制率为45.73％。

实施例5突变体HF1/PsmpB-fenA发酵液无菌上清对核盘菌的抑制作用

收集培养24h，36h，48h，60h和72h的突变体HF1/PsmpB-fenA、枯草芽孢杆菌HF1发酵液上清(发酵液上清的制备方法包括：取一环甘油管保存的突变体HF1/PsmpB-fenA和野生型HF1菌液并在LB固体培养基划线，37℃培养箱中培养16h活化菌种，将活化后的单菌落接种于50mL离心管装液量为10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm培养18h后，取2mL接种于250mL三角瓶装液量为100mL的硝酸钾液体培养基(葡萄糖28g/L，KNO₃ 6g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L)，于28℃，180rpm摇床振荡培养突变体HF1/PsmpB-fenA和野生型HF124h，36h，48h，60h和72h，取发酵液于离心机12,000～14,000g离心2min，收集发酵液上清)，用0.22μm无菌微孔滤膜过滤器过滤后备用。在PDA培养基(200g/L马铃薯，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂，1000mL蒸馏水，高压灭菌)培养皿底部找到中心点之后划出十字线，在中心点接种直径为6mm的病原菌菌饼，在距离中心30mm处分别用打孔器打出4个不同方向的孔洞，在孔洞中加入200μL的发酵液无菌上清。在对照组的病原菌铺满整个培养基平板时，再测量实验组中突变体HF1/PsmpB-fenA、枯草芽孢杆菌HF1对致病菌的拮抗直径。

结果见图4，突变体HF1/PsmpB-fenA发酵培养24-72h的发酵液无菌上清抑菌活性显著强于野生型HF1，且突变体HF1/PsmpB-fenA发酵培养36h的无菌上清液抑菌活性最强，抑制率可达73.14％，而野生型HF1的发酵无菌上清液对核盘菌的抑制率仅为62.54％。

实施例6突变体HF1/PsmpB-fenA对离体油菜叶片的菌核病的防效

将突变体HF1/PsmpB-fenA、野生型HF1接种于硝酸钾液体培养基(葡萄糖28g/L，KNO₃ 6g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L)中，于28℃、180rpm摇床上振荡培养60h。用无菌蒸馏水将菌悬液稀释成10⁸CFU/mL喷在健康、叶龄一致的油菜叶片，24h后接种油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)菌碟(直径约6mm)。以硝酸钾液体培养基浸泡处理的叶片为对照，于25±1℃培养箱中保湿培养。72h后测量病斑直径。生防效果(％)＝(对照组病斑的平均直径－处理组病斑的平均直径)/对照组病斑的平均直径×100％。

结果见图5，突变体HF1/PsmpB-fenA和HF1菌株均可显著抑制油菜菌核病病斑在离体油菜叶片上的扩展，但是突变体HF1/PsmpB-fenA抑制效果显著强于野生型HF1，其生物防治效果可达67.1％(P<0.001)。

实施例7突变体HF1/PsmpB-fenA Fengycin操纵子中基因表达的测定

250mL三角瓶装液量为100mL的硝酸钾培养基，28℃180rpm条件下培养野生型HF1、突变体HF1/PsmpB-fenA，分别在24h、36h、48h、60h和72h取样，按照EASYspin细菌RNA提取试剂盒(RN0802)方法提取细菌RNA，利用全式金公司的去DNA反转录试剂盒，利用mRNA合成cDNA。其体系为：5μg总RNA，50mM Oligo(dT18)，10μL 2×TS Reaction mix，1μLTransScript RT/RI Enzyme Mix，1μL gDNA Redmover，用RNase-free水补至20μL。轻轻混匀后，42℃孵育40-50min，85℃失活5min。按照Monad

Green qPCR Mix(Low Rox)(RN04005)定量PCR反应体系和反应程序进行荧光定量PCR实验。

结果见图6，24h、36h、48h、60h和72h突变体HF1/PsmpB-fenA中Fengycin操纵子中的5个基因的表达量显著低于野生型HF1。

实施例8突变体HF1/PsmpB-fenA Fengycin含量的测定

采用超高效液相-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术鉴定突变体HF1/PsmpB-fenA发酵液中的Fengycin，液相参数如下：采用WatersBEHC18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm particle)进行液相分离；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为HPLC级甲醇；洗脱梯度：0.1min，70％B；0.1-2.0min，70％B；2.0-8.0min，70％-100％B；8.0-10min，100％B；10.1min，70％B，10.1-13min 70％B；流速为0.3mL/min。质谱方法：采用正离子模式分析。MStune参数：脱气速度500L·h^-1，脱气温度500℃，锥孔气流50L·h^-1，源温度为120℃，毛细管电压和锥孔电压分别为3.0KV和30V。数据收集时间为0.5s，质荷比范围为100-1200。碰撞电压设定为25V。并根据实际情况微调。

结果见图7，突变体HF1/PsmpB-fenA发酵液甲醇粗提物在4.5min-8.5min质谱水平检测不到Fengycin。

实施例9菌株HF1和突变体HF1/PsmpB-fenA发酵液几种真菌细胞壁降解酶的活力测定

菌株HF1和突变体HF1/PsmpB-fenA发酵液中纤维素酶活力测定按照高珍娜等人的方法进行(高珍娜等，2010)，蛋白酶活力测定按照周德庆等人的方法进行(周德庆等，2010)，液淀粉酶活力测定按照王磊等人的方法进行(王磊等，2017)，几丁质酶活力测定按照朱茂山等人的方法进行(朱茂山等，2003)，β-1,3-葡聚糖酶活力测定按照洪永聪等人的方法进行(洪永聪等，2006)。

结果见图8，突变体HF1/PsmpB-fenA培养12h-48h时其发酵液上清中淀粉酶活性远高于菌株HF1，发酵培养12h-72h时，蛋白酶和纤维素酶活力也都高于菌株HF1，发酵培养24h-72h时，几丁质酶活性也高于菌株HF1，而β-1,3-葡聚糖酶活性在发酵培养前48h突变体HF1/PsmpB-fenA酶活性高于菌株HF1，60h-72h突变体HF1/PsmpB-fenA酶活性低于菌株HF1。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 枯草芽孢杆菌HF1突变体及其构建方法与应用

<130> KHP211111367.3

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 144

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

cagctcaacc agcaaatagg gccgcagcgc tctatttgct ttctttcgga aacagctttt 60

cattgtagca gtacgtgaca tttggtaaaa tagagcgtat cgcaaaaggt ggacagtttt 120

tccttagaga gaggaggttc tggc 144

<210> 2

<211> 827

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

tctctccgaa aaccgattat ataacgataa agaacgatgc taaaacgact gctgccggtt 60

cagagaaaga cctcacaatc gaaagagagc atggaacaaa cacgattaca attgaaggga 120

gcgtaccggt tgacgcaaac aagacaaagg agtggatttc tgtctgggag cctgccggat 180

atgccttaga tttatttaag cagtcactaa aaaaacaagg aattactgtg aaaggggaca 240

tcaagacggg tgaagcacct agttcttcag atgtgctgct ctctcttcgc tcaatgcctt 300

tatcgaaact ttttgtgccg ttcatgaaat taagtaataa cggacatgcc gaagtcctcg 360

taaaagagat ggggaaagtg aaaaaaggag aagggagctg ggaaaagggg ctcgaagtgt 420

taaacagtac gcttccggaa tttggtgttg attctaaatc actcgtctta agggacggat 480

caggaatctc acatattgat gctgtatcct cagatcaact ttcacagctg ttatatgaca 540

ttcaggatca gagttggttc tcggcttatc taaattcttt acctgttgcg ggcaatcctg 600

acagaatggt gggcggaacg ctgagaaacc gcatgaaaga cactcctgca caaggaaaag 660

taagagcaaa aaccggatcg ctcagtacgg taagctctct atctgggtac gcagaaacaa 720

agagcggaaa aaaacttgtt ttctctattc ttctaaatgg attgattgat gaagaggatg 780

gaaaagatat tgaggatcaa atcgctgtca ttttggcgag tcaataa 827

<210> 3

<211> 828

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

ttgagcgaac atacttattc tttaacccat gcccaaagga gagtgtggtt taccgaactg 60

ctggagccaa ataccagcat ttgcaatctc acagcctgtg tgaaattcaa aggcaatatt 120

gagcttgata ctctggaggg agcgctgaat cattccatct cccgcaacga cgccattaga 180

tttcagctgt tagaaggaga agagcttgag ccgcgattgc accttactga atataaatat 240

tatccactta gaataattga tttttcaaat gttgaaatga tagaaataga gcaatggatt 300

caggatcaag cgagcattcc atttaaactg atcaactcgc ctctttatca attttacctc 360

cttagaattg actctcatga agtttggcta tttgcgaaat tccatcatat cataatggat 420

ggaatctctt taaacgtgat gggaaatcaa attatagatc tttatcaaaa aatgaaaaag 480

aaagatcctt tacctgatca gccggaacct tcttacttga gctacatcga aaaagagagt 540

caatatctac aatctccgcg gtttgcaaag gaccgtttat tttggacgca aacctttgag 600

cacccgttgg aataccactc gttagccgac cagacgtcct tacaaaaaca gagcacatct 660

gcatccagag acaccatcat tctttcacct gatctagagc aaacgattcg aatcttctgc 720

gaagaacaca agatcaatat catttcctta tttatggctt cattttacat atgcatcagc 780

cgaatcactt ctaaaaaaga tcttgccatt ggcacctact atggcaac 828

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgagctcgg tacccggggc cagaacctcc tctctctaag ga 42

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagtcaataa gtcgaccagc tcaaccagca aatagggc 38

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcctctaga gtcgacttat tgactcgcca aaatgacagc ga 42

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggccagtgcc aagctttctc tccgaaaacc gattatataa cgataaagaa c 51

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acatgattac gaattcgttg ccatagtagg tgccaatgg 39

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaggttctg gccccgggtt gagcgaacat acttattctt taacccatgc 50

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌HF1突变体，其特征在于，所述突变体是利用基因工程手段将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF1 Fengycin操纵子的启动子替换成基因smpB的启动子得到的；

其中，基因smpB来源于枯草芽孢杆菌，基因smpB在NCBI上的参考序列编号为936170；

Fengycin操纵子包含fenA、fenB、fenC、fenD和fenE，在NCBI上的参考序列编号分别为939983、939993、940102、940013和939956。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，基因smpB来源于枯草芽孢杆菌HF1。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，基因smpB的启动子的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

4.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF1/PsmpB-fenA，其保藏编号为CGMCCNo.21897。

5.枯草芽孢杆菌HF1突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取枯草芽孢杆菌HF1的基因组DNA，设计引物，分别克隆得到基因smpB的启动子以及Fengycin操纵子的启动子的上游同源臂和下游同源臂；

2)利用In-fusion体系，将Fengycin操纵子的启动子的上游同源臂、基因smpB的启动子以及Fengycin操纵子的启动子的下游同源臂依次连接到载体pKSV7上，然后用所得重组载体转化枯草芽孢杆菌HF1，筛选阳性克隆；

其中，基因smpB的启动子的扩增引物序列如SEQ ID NO:4-5所示，Fengycin操纵子的启动子的上游同源臂的扩增引物序列如SEQ ID NO:6-7所示，Fengycin操纵子的启动子的下游同源臂的扩增引物序列如SEQ ID NO:8-9所示。

6.枯草芽孢杆菌HF1、权利要求1-3任一项所述突变体、权利要求4所述枯草芽孢杆菌HF1/PsmpB-fenA或按照权利要求5所述方法构建得到的突变体的以下任一应用：

1)用于防治核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；

2)用于防治由核盘菌所导致的植物病害。

7.枯草芽孢杆菌HF1、权利要求1-3任一项所述突变体、权利要求4所述枯草芽孢杆菌HF1/PsmpB-fenA或按照权利要求5所述方法构建得到的突变体的发酵液上清的以下任一应用：

i)用于防治核盘菌；

ii)用于防治由核盘菌所导致的植物病害；

其中，枯草芽孢杆菌发酵液上清的制备方法包括：取一环甘油管保存的枯草芽孢杆菌菌液并在LB固体培养基划线，37℃培养箱中培养16h活化菌种，将活化后的单菌落接种于50mL离心管装液量为10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm培养18h后，作为种子液，取2mL种子液接种于250mL三角瓶装液量为100mL的硝酸钾液体培养基中，于28℃，180rpm摇床振荡培养枯草芽孢杆菌48-72h，取发酵液于离心机12,000～14,000g离心2min，收集发酵液上清，用0.22μm无菌微孔滤膜过滤器过滤后备用；

其中，硝酸钾液体培养基的配方为：葡萄糖28g/L，KNO₃ 6g/L，KH₂PO₄ 1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述植物病害为油菜菌核病。

9.提高枯草芽孢杆菌HF1胞外真菌细胞壁降解酶活性的方法，其特征在于，利用基因工程手段将枯草芽孢杆菌HF1 Fengycin操纵子的启动子替换成基因smpB的启动子，得到改造后的枯草芽孢杆菌HF1，然后发酵培养改造后的菌株，并从发酵液中分离纯化得到胞外真菌细胞壁降解酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述胞外真菌细胞壁降解酶包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶。

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