CN107964514B - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在植物上的应用 - Google Patents

一种贝莱斯芽孢杆菌及其在植物上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及其在植物上的应用，其目的在于提供一株在植物上具有广谱防病促生活性的贝莱斯芽孢杆菌菌株和以该菌株为活性成分的微生物菌剂。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ‑YBGJ0001，保藏编号为CGMCC No.14384。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ‑YBGJ0001 CGMCC No.14384可以有效防控植物病害，对植物本身没有危害，并且可在一定程度上促进植物生长；利用本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂可替代或减少化学农药使用；在很大程度上保护了生态环境和农产品的质量安全。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及其在植物上的应用
技术领域
本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在植物上的应用，属于植物防病促生的微生物菌剂领域。
背景技术
近年来，我国的农业种植结构发生了很大调整，而且这种调整趋势将在今后一段时期内持续进行，经济作物、园艺作物等附加值高的作物品种不断丰富，种植区域和面积不断扩大；同时我国的种植业发展模式也发生了巨大转变，规模化种植、保护地生产面积和比例迅速上升；此外，由于整体上种植业较高的复种指数、快速迅捷的物流运输、规模化社会化农事操作等因素，给植物病害发生、传播和流行的防控带来巨大挑战，一些重点病害持续爆发，一些原本次要的非主流病害逐年加重，造成严重的生产安全隐患，成为制约我国农业现代化的主要问题之一。
当前我国植物病害防控仍以化学农药为主。据中国农药信息网等有关部门公布的数据统计结果，在产品登记方面，2014-2015年我国登记农药产品总数为34315个，其中生物农药(含微生物农药)登记产品3191个，而微生物农药的产品登记数量仅为429个，化学农药、生物农药和微生物农药登记产品数量百分百分别为90.7％、9.3％和1.25％；从生产情况来看，全国农药生产企业共约2232家，其中涉及生物农药(抗生素除外)的生产厂家428家，约占19.2％，全国农药年总产量约355万吨，其中化学农药和生物农药产量分别为326万吨和29万吨，分别约占总产量的91.83和8.17％；从应用情况来看，全国农作物防治总面积约65.25亿亩次，其中化学农药和生物农药防治面积分别约为61.25和4亿亩次，分别占防治总面积的93.87％和6.13％。
化学农药在相当长一段历史时期内保障了农产品安全生产，但是从现阶段以及未来发展来看，呈现出很大弊端。首先是长期化学农药造成病虫害的严重抗药性，导致用药量逐步加大。其次是大量、长期化学农药的应用给农产品质量、农业生产环境和整个生态带来严重威胁，近年来不断出现的农产品质量安全事件多由化学农药引起。再次，化学农药产品开发成本逐步升高，获得一个有效化学成分的比率在上世纪90年代大约为两万分之一，而在2010年前后降为十四万分之一；研发成本则由最初的百万美元上升至2010年的2.56亿美元；同时研发周期也在不断地大幅度加长，而市场使用寿命却在不断缩短。当前化学农药产品重复登记，同质化程度严重，据农业部公布的数据计算，2015年度化学农药每1个有效成分平均登记55.5个产品，而生物农药和微生物农药则分别为1/32和1/12。
微生物农药是农药的一大类，也是生物农药的重要内容。因其本身来源于自然，而对环境生态、人和动物具有天然的友好性，不仅能长效控制植物病虫害，还具有促进植物免疫和生长的综合效应。虽然相对于化学农药，微生物农药的靶标针对性和速效性相对较弱，但是在当前以及未来更加注重质量安全、生态安全和社会安全的的大前提之下，其发展潜力和市场前景不可限量。
芽孢杆菌是微生物农药领域研究的重中之重，从专利申请和授权情况来看，截止当前我国共公布芽孢杆菌申请专利11492件，其中正式授权3709件。其中涉及枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡质(状、样)芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、多粘(黏)芽孢杆菌等的专利占据了绝大部分，而涉及贝莱斯芽孢杆菌专利的研究较少，仅有4项申请和2项正式授权。从芽孢杆菌农药登记情况来看，我国主要集中在苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌上，共登记制剂和原药310个产品，其中贝莱斯芽孢杆菌还未有正式登记的产品；美国已有3株枯草芽孢杆菌和1株解淀粉芽孢杆菌获得环保局(EPA)商品化生产应用许可，进入大面积推广应用，并取得较好的销售业绩。
贝莱斯芽孢杆菌是2005年Ruiz-García等新命名的芽孢杆菌新种，是一种新型生防细菌，近几年有关研究逐步增多。有研究者证实该菌的抑菌活性物质为蛋白质类物质。国内，已发现该菌对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb、黑斑病致病菌芸薹链格孢菌Alternaria brassicae、番茄灰霉病灰葡萄孢菌Botrytis cinereapers等有拮抗活性；国外，有学者发现该菌对稻瘟病菌等有强拮抗作用。
当前关于芽孢杆菌的研究和开发主要集中在苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌等少数种上，贝莱斯芽孢杆菌作为一种新型的、极具潜力的生防细菌，相关研究较少、且不够深入，产业化开发及其在植物防病促生中的应用等各方面研究均需要进一步加强。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一株在植物上具有广谱防病促生活性的贝莱斯芽孢杆菌菌株和以该菌株为活性成分的微生物菌剂。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的目的之一是提供一株具有广谱防病促生活性的贝莱斯芽孢杆菌。
本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌，是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001，该菌株已于2017年7月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.14384。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384是从海南省三亚市陵水县田间土壤中分离得到的。
本发明的目的之二是提供一种具有广谱防病促生活性的贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂。
本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂，其活性成分是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384。
本申请还保护所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCCNo.14384在抑制植物病原真菌和病原线虫、保护植物本身及促生中的应用。
实验结果表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCCNo.14384对8个属的10种植物病原真菌和1种植物病原线虫均有不同程度的拮抗作用。其中对引起土传病害的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)和炭疽菌(Colletotrichum spp.)的抑制率为76.86％-96.91％；对灰梨孢菌(Pyricularia grisea)、极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)、桃褐腐菌(Monilinia fructicola)和胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的抑制率为87.65％-99.75％；发酵液稀释1-10倍时对南方根结线虫(Meloidogyneincongnita)的致死率高达100％，稀释100倍的致死率为67％，是一株具有广谱抑菌活性的生防菌株。
实验结果表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCCNo.14384对水稻苗、小麦苗、番茄苗、黄瓜苗、西瓜苗、豇豆、油菜苗、芹菜苗、生菜苗以及芒果树、橙子树、梨树、桃树、苹果树的嫩茎嫩叶均无致病作用。其中，对水稻苗、番茄苗、黄瓜苗、西瓜苗、生菜苗及其根系具有较好的促生作用；对芒果树、橙子树、桃树的嫩茎嫩叶亦有促生作用。
有益效果：
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCCNo.14384可以有效防控植物病害，对植物本身没有危害，并且可在一定程度上促进植物生长；利用本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂可替代或减少化学农药使用；在很大程度上保护了生态环境和农产品的质量安全。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384的菌落和菌体形态。
其中A为平板上多个落菌落形态；
B为50倍显微镜下单个菌落形态；
C为3万倍扫描电镜下菌体群形态；
D为3.5万倍扫描电镜下单个菌体形态。
图2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001CGMCC No.14384的16s rDNA电泳图，电泳图最左边条带为mark；右边1-10条带均为16s rDNA重复。
图3为MEGA7.0软件构建的系统进化树。
图4为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384与贝莱斯芽孢杆菌标准菌株Bacillus velezensis strain NJAU-Z9的16s rDNA序列同源性比对结果图。
图5为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384的发酵液与部分植物病原真菌对峙效果图。
其中A为贝莱斯芽孢杆菌NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384与桃褐腐病菌对峙效果图；
其中B为贝莱斯芽孢杆菌NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384与胶孢炭疽菌对峙效果图；
其中C为贝莱斯芽孢杆菌NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384与极细链格孢菌对峙效果图；
其中D为贝莱斯芽孢杆菌NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384与腐皮镰刀菌对峙效果图。
具体实施方式
以下结合附图1-5对本发明作进一步详细说明。
举实例说明本发明，但本发明并不限于下述的实施例。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384的分离纯化及鉴定
1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384的分离与纯化
从海南省三亚市市陵水县豇豆田间采集土壤0.1g，加入0.9mL无菌水，并充分振荡摇匀，即为10-1稀释液，依次稀释10-3，10-4，10-5倍。分别取以上悬浮液0.1mL在牛肉膏蛋白胨(NA)培养基上均匀涂布，每个浓度重复3次，置于28℃恒温培养箱中培养24h。待长出单菌落，挑取单一细菌菌落于NA平板上划线，获得纯化的细菌菌株。并分别以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、炭疽菌(Colletotrichum spp.)、灰梨孢菌(Pyricularia grisea)、极细链格孢菌(Alternariatenuissima)、桃褐腐菌(Monilinia fructicola)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)共11种植物病原物作为靶标，进行拮抗菌株的筛选(图5)。从中筛选出对靶标菌均具有明显抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384。
2、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384的鉴定
(1)菌体的形态特征
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384在NA培养基上，28℃培养20-24h后菌落中等大小，乳白色不透明，偏平，边缘不整齐，表面干燥无光泽(图1中A和B)，随着培养时间增加，菌落颜色变为浅褐色。光学显微镜下观察到杆状菌体细胞，革兰氏染色阳性。扫描电子显微镜观察菌体细胞呈短杆状，大小为0.5-0.7μm×2-3μm，芽孢中生或偏中生，无伴胞晶体(图1中C和D)。
(2)菌株的生理生化鉴定
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384进行生理生化检测，结果如表1。将NSZ-YBGJ0001的生理生化性状检测结果，在《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《常见细菌系统鉴定手册》中的检索表进行检索，确定NSZ-YBGJ0001生理生化性状与贝莱斯芽孢杆菌的相应性状一致。
表1.NSZ-YBGJ0001生理生化鉴定结果
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
(3)NSZ-YBGJ0001菌株的16s rDNA序列测定
挑取少量单菌落于50mL NB培养基中，置于28℃，180rpm摇床上培养16h，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，置于-20℃保存备用。PCR扩增16s rDNA序列，引物为27F/1492R。
27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′
1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′
扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。检测合格后委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。
测序得到NSZ-YBGJ0001菌株的16s rDNA序列1421bp(序列如SEQ ID NO.1所示)。
NSZ-YBGJ0001菌株的16s rDNA序列具有序列表中的核苷酸序列，通过NCBI数据库BLAST进行同源性比对，结果表明NSZ-YBGJ0001与Bacillus velezensis strain NJAU-Z9的相似性达100％(图4)。
将NSZ-YBGJ0001菌株的16s rDNA序列用MEGA7.0软件构建系统进化树(图3)，NSZ-YBGJ0001菌株与Bacillus velezensis strain NJAU-Z9的距离最近。
结合NSZ-YBGJ0001菌株的形态学、生理生化性状以及16s rDNA序列同源性比对结果，确认NSZ-YBGJ0001为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对植物病原真菌的活性
采用平板培养法检测贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001CGMCC No.14384对植物病原真菌的抑制活性。
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384在NA平板上活化24h，挑取单菌落接种到NB液体培养基中，置于28℃，180rpm摇床上培养16h，用麦克比浊法测定细菌菌悬液浓度为108cfu/ml备用。
将供试靶标真菌在PDA平板上25℃培养3d-5d，备用。
将备用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCCNo.14384菌液离心，收集上清液。将上清液以1∶25的比例均匀混合到50℃以下的PDA培养基中，倒平板备用。
取备用的靶标真菌平板，用打孔器(直径5mm)制取真菌菌饼。
将菌饼菌丝面朝下接种于备用的含贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384发酵上清液的PDA平板中央。
每个处理4次重复，25℃下黑暗培养3d、5d、7d后分别测量各处理的真菌菌落直径，并计算抑菌率。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对供试病原真菌的抑制结果如表2所示。
本实施例以包括8个属的10种植物病原真菌为靶标菌，测定贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384的抑菌效果(表2)。结果显示贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对供试的靶标病原物均具有明显的拮抗作用，抑制其生长。表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384抑菌活性较强，抑菌谱较广。
表2.NSZ-YBGJ0001对供试病原真菌的抑制作用
实施例3贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对南方根结线虫的活性
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384在NA平板上活化24h，挑取单菌落接种到NA液体培养基中，置于28℃，180rpm摇床上培养16h，用麦克比浊法测定细菌菌悬液浓度为108cfu/mL备用。
在24孔板中，每孔中加入1mL线虫悬浮液(浓度约300头/mL)，将上述备用的NSZ-YBGJ0001菌悬液定量添加于其中稀释，配置成10、100、1000、5000、10000倍(NSZ-YBGJ0001菌液稀释倍数)的稀释液，此时各处理中NSZ-YBGJ0001的浓度分别为107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、0.5×105cfu/mL、108cfu/mL、104cfu/mL。
以加入同等体积的NA培养基稀释液为对照，每个处理重复3次。
将24孔板置于25℃恒温箱中黑暗培养24h，统计每孔中根结线虫总数，并计算根结线虫的校正死亡率。
本实施例以1种最重要植物病原线虫南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)为靶标菌，测定贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对其的抑制效果。结果表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCCNo.14384对南方根结线虫均具有显著的抑制活性(表3)。
表3.NSZ-YBGJ0001对南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)的抑制作用
实施例4贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对植物的安全性和促生性测定
首先进行种苗安全性检测，使用108cfu/mL的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384菌液处理水稻、小麦、番茄、黄瓜、西瓜、豇豆、油菜、芹菜、生菜种子，观察种子的发芽率和发芽势。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对上述9种作物的种子发芽没有致病性；同时与对照相比，除西瓜、芹菜和生菜种子之外，其余作物种子的发芽率和发芽势均优于对照，但是没有显著差异。
表4.NSZ-YBGJ0001对几种农作物种苗的安全性和促生性测定
其次进行植物茎叶安全性检测，使用采用针刺和剪叶接种法，将浓度为108cfu/mL的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384菌液接种于芒果树、橙子树、梨树、桃树、苹果树的幼嫩茎叶上，观察幼嫩茎叶的发病情况。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001 CGMCC No.14384对上述5种植物的幼嫩茎叶均没有致病性，而且与对照相比芒果和橙子的幼嫩茎叶涨势明显优于对照。
表5.NSZ-YBGJ0001对几种植物茎叶的安全性和促生性测定
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (3)

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001，保藏编号为CGMCCNo.14384。
2.一种微生物菌剂，其活性成分是权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)NSZ-YBGJ0001。
3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NSZ-YBGJ0001在抑制植物病原真菌、保护植物本身及促生中的应用。
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