CN111961613B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治桃褐腐病上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，尤其涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治桃褐腐病上的应用。该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WH‑P2‑20，保藏编号为CCTCC NO:M 2020257，于2020年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株具有生长速度快、对致病菌拮抗性强等优点，在防治桃褐腐病、延长桃采后贮藏保鲜时间和拮抗多种致病菌方面有广阔的应用场景。且由该贝莱斯芽孢杆菌制备的发酵液能够高效的防治桃褐腐病，是一种极具应用前景的生防菌株。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治桃褐腐病上的应用
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，尤其涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治桃褐腐病上的应用。
背景技术
桃褐腐病是由链核盘菌属(Monilinia)中的褐腐菌引起的，主要危害桃果实的一种桃树病害。褐腐菌在世界范围内主要有6种，其中美澳型核果褐腐菌(Moniliniafructicola)对我国造成最大经济危害最大、地理分布也最广。褐腐病在桃的幼果至成熟期都能侵染发病，发病初期，桃果表面出现圆形或椭圆形褐色病斑，随后病斑迅速扩展，并在果实表面产生大量棕褐色分生孢子，严重时覆盖整个果实，后期病果脱水形成僵果。田间若在桃树幵花期和幼果期遇到低温多雨，果实成熟期温暖高湿，则褐腐病发病严重，极易造成流行，果实的损失可达到总产量的90％。桃褐腐病同时也是桃果实采后的重要病害，采后由褐腐病等病害引起的桃果实腐烂，同样损失巨大，可达贮藏运输总量的20％。
自18世纪中叶以来化学合成杀菌剂一直作为防治病害的主要手段，目前用来防治桃褐腐病的有氯硝胺(2、6-二氯，4-硝基胺苯)、1-MCP(1-甲基环丙烯)和苯来特(1-正丁胺基甲酰-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯)等有机合成杀菌剂，但在化学药剂的使用过程中出现越来越严重的农药残留、环境污染和病原菌抗药性等问题。
用微生物对采后病害进行生物防治是近年来发展起来的一个研究领域，其可以替代化学药剂对病害进行防治，确保桃果实的品质和安全。芽孢杆菌属是被研究最多的生物控制剂之一，其在生物防治中具有独特的优势，一方面能够形成抗逆芽孢，增强了芽孢杆菌在不良环境条件下的生存能力；另一方面可以产生具有拮抗活性的次级代谢物，包括抗真菌蛋白、低分子量挥发性化合物和抗生素等。多肽类抗菌素中的表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturins)和芬枯草菌素(Fengycin)具有许多理想的特性，如抗菌谱广、低毒性、强抗菌活性、抗病毒、高生物降解性和高温耐受性等。其中枯草芽孢杆菌作为商品化的生防制剂已经成熟，国内外已开发出如“MicroBio Group Ltd”、“Idemistu Kosan CoLtd”、“百抗”和“麦丰宁”等生防制剂，用来替代化学药剂在田间防治病害。
目前已有多种芽孢杆菌被报道可以用来防治桃褐腐病，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)等，但关于贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)防治褐腐病并能延长采后保鲜时间的报道尚未发现。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治桃褐腐病上的应用。
一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WH-P2-20，保藏编号为CCTCC NO:M2020257，于2020年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
上述的贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在防治桃褐腐病中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在拮抗美澳型核果褐腐菌(Moniliniafructicola)、贝氏葡萄座腔菌苹果专化型(Botryosphaeria berengeriana f.sp.mali)、果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)、福士拟茎点霉菌(Phomopsis fukushii)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)中的应用。
所述贝氏葡萄座腔菌苹果专化型为苹果轮纹病病原，葡萄座腔菌属；果生炭疽菌为梨炭疽病病原，炭疽菌属；福士拟茎点霉为梨胴枯病病原菌，拟茎点霉属；美澳型核果褐腐菌为桃褐腐病病原，褐腐菌属；尖孢镰刀菌为香蕉枯萎病病原，镰刀菌属；匍枝根霉为桃软腐病病原，根霉属。
上述的贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在延长桃采后贮藏保鲜时间中的应用。
一种发酵液，所述生物防治制剂是由上述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20制得。
上述发酵液为液体菌剂，且所述发酵液中所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的浓度为109～1010cfu/mL。
上述的发酵液在防治桃褐腐病和延长桃采后贮藏保鲜时间产品中的应用。
上述的发酵液在制备在拮抗美澳型核果褐腐菌、贝氏葡萄座腔菌苹果专化型、果生炭疽菌、福士拟茎点霉菌、尖孢镰刀菌和匍枝根霉菌产品中的应用。
所述贝氏葡萄座腔菌苹果专化型为苹果轮纹病病原，葡萄座腔菌属；果生炭疽菌为梨炭疽病病原，炭疽菌属；福士拟茎点霉为梨胴枯病病原菌，拟茎点霉属；美澳型核果褐腐菌为桃褐腐病病原，褐腐菌属；尖孢镰刀菌为香蕉枯萎病病原，镰刀菌属；匍枝根霉为桃软腐病病原，根霉属。
一种测定对美澳型核果褐腐菌孢子萌发抑制率的方法，主要包括以下几个步骤：
S1、利用上述发酵液，将所述发酵液离心后经0.22μm细菌过滤器过滤，得到菌株的无菌发酵液；
S2、将无菌发酵液加入WA培养基中混匀，分别制得所述无菌发酵液的体积分数为1％、5％和10％的平板；
S3、待WA培养基凝固后，在每个平板内WA培养基的表面平铺一层无菌玻璃纸；
S4、在玻璃纸上涂布100μL浓度为105cfu/mL的美澳型核果褐腐菌孢子悬浮液，25℃的条件下暗培养12h，观察所述美澳型核果褐腐菌的孢子萌发情况，以及计算孢子萌发率和芽管伸长抑制率。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大和对致病菌拮抗性强等优点，在防治桃褐腐病、延长桃采后贮藏保鲜时间和拮抗多种致病菌方面有广阔的应用场景。且由该贝莱斯芽孢杆菌制备的发酵液能够高效的防治桃褐腐病，延长桃果实采后贮藏保鲜时间，是一种极具应用前景的生防菌株。
附图说明
图1为本发明所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的菌落形态特征(a)、革兰氏染色结果(b)和菌体形态特征(c)；
图2为本发明所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的16s rDNA系统发育进化树；
图3为本发明所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的rpoB系统发育进化树；
图4为本发明所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的生长曲线；
图5为本发明所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的菌液OD600值和单位体积活菌量的关系；
图6为试验例2中贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20发酵液在不同体积分数条件下，对美澳型核果褐腐菌孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长影响的示意图；
图7为实施例3中贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20无菌发酵液对美澳型核果褐腐菌孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长抑制率的结果示意图。
图8为试验例2贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的挥发性气体对美澳型核果褐腐菌菌丝生长影响的结果示意图。
图9为实施例4中贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20和各种病原真菌的对峙培养图。
图10为试验例3中贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20对各种致病菌抑制率的结果示意图。
图11为实施例5中田间褐腐病发病情况图；A为WH-P2-20，B为苯甲醚菌酯，C为水对照。
图12为实施例5中采后褐腐病发病情况图；A为为苯甲醚菌酯，B为WH-P2-20，C为水对照。
图13为实施例6中放置9天后发病情况图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
下述试验例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。以下实验例中的定量实验，均设置三次重复，结果取平均数。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)：去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL，121℃高温灭菌20min。
肉汤培养基(Luria Broth，LB)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，121℃高温灭菌20min。
水琼脂培养基(Water Agar,WA)：琼脂14g，蒸馏水1000mL，121℃高温高压灭菌20min。
苯甲醚菌酯(悬浮剂)：江苏万农化工有限公司，有效成分为嘧菌酯和苯醚甲环唑，浓度分别为200g/L和125g/L；农药登记证号：PD20150140，农药生产批准证号：HNP32190-D4082，产品标准号：Q/321322GXA18-2014。
革兰氏染色试剂盒：选用北京索莱宝生物科技有限公司生产。
桃褐腐病发病表征：发病初期，桃果表面出现圆形或椭圆形褐色病斑，随后病斑迅速扩展，并在果实表面产生大量棕褐色分生孢子，严重时覆盖整个果实，后期病果脱水形成僵果。
贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的分离、鉴定、发酵和保藏
一、菌株的分离
湖北省武汉市华中农业大学的南湖桃园，采集“曙光”油桃(P.persicavar.nectarine‘Shuguang’)叶片于自封袋带回实验室，将叶片切成大小为1cm的组织，经过浓度为75％的酒精消毒30s，经无菌水冲洗2-3次后，放置于PDA培养基上25℃暗培养。培养36h后，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落。
获得了一株纯培养的菌株，根据属地命名原则命名为WH-P2-20。
保存：纯化后的菌株，置于LB培养基摇培24h后，4℃保存。
二、菌株WH-P2-20的形态特征鉴定和生理生化鉴定
取菌株WH-P2-20稀释至合适浓度，涂布于PDA培养基平板，25℃恒温培养箱中培养，观察单菌落的形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度和菌落颜色特征。
菌落形态特征：菌落呈圆形，光滑无隆起，乳白色，边缘规则(见图1)。
取菌株WH-P2-20菌液于PDA平板上划线培养，置于25℃恒温培养箱中培养24h，挑取单菌落于无菌水中稀释，吸取菌液滴于铜网上吸附3min，将铜网置于吸水滤纸上晾干2min，再将铜网置于2％磷钨酸钠负染液中负染3min，最后晾干2min，进行透射电镜观察。用ImageJ软件测量50个菌体长度和宽度。
用革兰氏染色试剂盒对稀释的菌株WH-P2-20菌液进行染色，100倍油镜下观察。
菌体形态特征：菌体呈长直杆状，周生鞭毛，革兰氏染色为阳性，大小为0.65～1.05×1.20～3.00μm(见图1)。
API50 CHB试剂条是传统生化试验的微型化和标准化模块，依据48个糖类分解产酸测试、一个七叶灵水解测试的结果，对芽孢杆菌的生化型进行识别，用来鉴别许多形状明确的芽孢杆菌种属。使用过程包括以下三个步骤：
接种液配制：挑取菌株WH-P2-20的菌落，用无菌生理水配制浓的WH-P2-20菌悬液，将该菌悬液与9mL培养基混匀；用己接种的培养基加入实验条的管部，在30℃培养24h和48h。结果判定：反应状态分为阳性和阴性，阳性性状编码为“+”，阴性性状编码为“-”，如果接种孔内菌株WH-P2-20能够利用控制培养基，那么在生长的过程中会使培养基酸化，48个糖类接种孔内的培养基的酚红会变黄，七叶灵(第25号管)由红色变黑色，此时判定为阳性；如菌株WH-P2-20不能利用控制培养基，则接种孔的培养基颜色不变。
API试剂条生化反应见表1。
表1 菌株WH-P2-20的API试剂条反应结果
Figure GDA0003428390510000071
Figure GDA0003428390510000081
三、菌株WH-P2-20分子鉴定
基于提取的细菌菌株的基因组DNA为模板，采用扩增细菌16S rDNA区域的16sF通用引物(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACT-3′)和16sR互补引物(5′-CCTGAGCCAGGATCAAACTCT-3′)，rpoB基因的同源引物(5’AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC3’)和互补引物(5’AAGAACCGTAACCGGCAACTT3’)进行PCR扩增，扩增产物采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。用TAE缓冲液制作1.2％琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，用溴化乙锭溶液染色15min，在凝胶成像仪中观察片段大小，用回收试剂盒回收目的片段，提交上海生工生物科技有限公司进行序列测定。
PCR反应体系：10×buffer 3μL、Taq酶0.5μL、dNTP 2.5μL、正向引物16sF1μL、反向引物16sR 1μL、模板DNA 2μL和去离子无菌水20μL。
PCR反应程序：第一步，95℃预变性3min；第二步，95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；第三步，72℃延伸10min，16℃保存。
将获得序列与NCBI数据库中序列采用BLASTn进行相似性分析，结果表明菌株WH-P2-20的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)与Bacillus velezensis B2的16SrDNA序列(序列登陆号：MG234434.1)同源率为99.24％(Total Score 2599；coverage99％；E value 0.0；identity 99.24％)；rpoB序列(为SEQ ID NO：2所示)与Bacillusvelezensis WLYS23的rpoB序列(序列登陆号：CP055160.1)同源率为99.82％(Total Score1005；coverage 98％；E value 0.0；identity 99.82％)。
其中，菌株WH-P2-20的16S rDNA具体序列如下：
CGCGGCGGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGGAAGTTTGTAAACACCCGGAAAAGTCGGTGGAAGGTAAACCTTTTAAGGGAAGCCAGCCGCCCGA。
NCBI下载得到各芽孢杆菌模式种16S rDNA和rpoB基因序列，构建系统发育树，进行亲缘关系远近分析，16s rDNA系统发育树和rooB系统发育树显示菌株WH-P2-20和Bacillus velezensis聚为一簇，见图2和图3。
四、菌株WH-P2-20的发酵
取WH-P2-20菌液600L于装有20mL LB培养基的100mL的三角瓶中，30℃恒温摇床中200rpm震荡摇培12～16h得到种子液；取种子液600μL于装有20mL LB培养基的100mL的三角瓶中，30℃恒温摇床中200rpm震荡摇培60h得到发酵液，测得发酵菌液单位体积活菌量的浓度为109～1010cfu/mL。
五、菌株WH-P2-20的生长曲线测定
将菌株WH-P2-20在PDA平板上划线，待单菌落长出后，挑取平板上的单菌落至装有20mL LB培养基的100mL三角瓶中，在30℃摇床中200rpm震荡摇培16h，得到种子液。取种子液600μL，接种至装有20mL无菌LB培养基的100mL三角瓶中，在30℃摇床中200rpm震荡培养。在培养0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h和60h时，取适量菌液用分光光度计在600nm波长下，测定菌液中的吸光值。
菌株WH-P2-20在LB培养基中摇培发酵，以发酵的时间为横坐标，菌液在600nm时的吸光光度值为纵坐标，构建生长曲线，在0～24h时为对数生长期，24～60h为平稳期(见图4)。
测量并计算得出，菌株WH-P2-20菌液的OD600值在0.5～1.0时，其OD600值和单位体积活菌量呈线性相关关系，相关方程为y＝5.1729x-0.2339(见图5)。
六、菌株的保藏
根据上述鉴定结果，菌株WH-P2-20为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020257，保藏日期为2020年7月1日。
<试验例1>
本试验例旨在研究贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的发酵液对美澳型核果褐腐菌的抑制作用
实验步骤：
S1、取健康水蜜桃(prunus persica Batsch.cv.)，用2％的NaOCl溶液消毒2min，用清水冲洗，在消毒后的桃果实“赤道”位置等距离取直径5mm、深3mm的3个接种孔；
S2、在PDA培养基上活化美澳型核果褐腐菌，于无菌操作台中采用直径为5mm的打孔器进行打孔取样，以得到直径为5mm的美澳型核果褐腐菌菌饼；
S3、分别取20μL贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的发酵液(单位体积活菌量为109cfu/mL)、20μL的100倍贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20稀释发酵液(单位体积活菌量为107cfu/mL)和20μL的清水于三个接种孔内，以得到实验组1、实验组2和对照组；
S4、S3中实验组1、实验组2和对照组桃果实放置于25℃和相对湿度为99％的接种盆内24h后，向实验组1、实验组2和对照组内分别接种S2得到的美澳型核果褐腐菌菌饼后，将桃果实放置于室温为25℃和相对湿度为99％的接种盆内，待对照发病后观察、拍照和记录各处理的桃果实发病情况。
Figure GDA0003428390510000121
Figure GDA0003428390510000122
实验结果表明如表2，贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20对桃褐腐病具有良好的生防效果，接种美澳型核果褐腐菌的第三天时，实验组1(菌液浓度为109cfu/mL)对桃褐腐病的抑制率为100％，实验组2(菌液浓度为107cfu/mL)对桃褐腐病的抑制率为60.4％。
表2 贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20不同浓度的菌液对桃褐腐病的防效
Figure GDA0003428390510000131
<试验例2>
本试验例旨在研究贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的发酵液及挥发性气体对美澳型核果褐腐菌的抑制作用
一、贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的无菌滤液对孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长的影响
将贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20发酵液装入50mL离心管，7000rpm离心10min，去除菌体，得到上清液；最后将上清液经0.22μm细菌过滤器过滤，滤液即为无菌发酵液。
将贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20无菌发酵液加入融化但不烫手(温度约为50℃)的WA培养基中，混匀，配制成无菌滤液体积分数分别为1％、5％和10％的平板；凝固培养基后，于每个培养基的表面平铺一层玻璃纸后(孢子能够透过玻璃纸吸取水分而萌发，但芽管不能穿透玻璃纸，以便于观察孢子萌发状态和芽管长度)，涂布100μL浓度为105cfu/mL的美澳型核果褐腐菌孢子悬浮液；将PDA平板置于恒温培养箱中，25℃，暗培养12h；在显微镜下观察各处理对美澳型核果褐腐菌孢子萌发情况，统计孢子萌发率，同时拍照并利用Image J软件测量美澳型核果褐腐菌孢子萌发后芽管的长度。
将贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20无菌发酵液加入融化但不烫手(温度约为50℃)的PDA培养基中，混匀，配制成无菌滤液体积分数分别为1％、5％和10％的平板；凝固培养基后，于每个培养基内接种直径为5mm的美澳型核果褐腐菌菌饼，将PDA平板置于25℃恒温培养箱中，待对照菌落长至培养皿边缘，测量统计不同体积分数下，每个平板内贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的菌落直径，并计算其对美澳型核果褐腐菌菌丝生长的抑制率。
结果见表3、图6和图7，当无菌滤液体积分数为10％时，贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的可完全抑制美澳型核果褐腐菌孢子萌发和芽管伸长，抑制率均为100％，对美澳型核果褐腐菌菌丝生长抑制率为80.6％；当无菌滤液体积分数为5％时，对美澳型核果褐腐菌孢子萌发的抑制率为22.7％，芽管伸长的抑制率为90.2％，对美澳型核果褐腐菌菌丝生长的抑制率为69.0％；当无菌滤液体积分数为1％时，对美澳型核果褐腐菌的萌发无抑制作用，对芽管伸长的抑制率为48.9％，对美澳型核果褐腐菌菌丝生长抑制率为16.9％。
表3 贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20无菌发酵液对美澳型核果褐腐菌的影响
Figure GDA0003428390510000141
二、贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20挥发性气体对美澳型核果褐腐菌菌丝生长的影响
取200μL贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20发酵液均匀涂布在PDA培养基平皿上，放置于超净工作台吹干。同时在另外一皿PDA培养基平板中央接种新鲜的直径为5mm的桃褐腐真菌菌丝块，去掉两平皿的皿盖，将带有贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20发酵液的皿与接种真菌菌丝块的皿对扣，用封口膜密封，接种菌株贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20菌液的平皿在下放置培养。每组设置三个重复，对照组用涂布无菌水的PDA平板与接种真菌菌丝块的皿对扣。将各实验组放置于25℃培养箱，培养7d，待空白对照长满平皿后观察结果。
实验结果表明，贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的挥发性气体对菌丝生长的抑制率为34.1％。贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的挥发性气体对菌丝生长的抑制效果见图8，其中，图8(A)为无菌水对菌丝生长的抑制效果图，图8(B)为贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的挥发性气体对菌丝生长的抑制效果图。
表4 贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20挥发性气体对美澳型核果褐腐菌菌丝生长的影响
Figure GDA0003428390510000151
<试验例3>
本试验例旨在研究贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20对多种致病菌的拮抗作用
测试致病菌包括葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌，炭疽菌属(Colletotrichum)真菌，拟茎点霉属(Phomopsis)真菌，褐腐菌属(Monilinia)真菌，镰刀菌属(Fusarium)真菌，根霉属(Rhizopus)真菌。所述葡萄座腔菌属为苹果轮纹病病原贝氏葡萄座腔菌苹果专化型(Botryosphaeria berengeriana f.sp.Mali)，炭疽菌属为梨炭疽病病原果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)，拟茎点霉属为梨胴枯病病原菌福士福士拟茎点霉菌(Phomopsis fukushii)，褐腐菌属为桃褐腐病病原美澳型核果褐腐菌(Monilinia fructicola)，镰刀菌属为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，根霉属为桃软腐病病原匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)。
实验步骤如下所示：
S1、分别在PDA培养基上活化上述6种致病菌，于无菌操作台中使用直径为5mm的打孔器进行打孔取样，以分别得到直径为5mm的6种致病菌菌饼。
S2、分组处理如下
实验组：在PDA培养基上，取10μL摇培的菌液(菌液OD600值为2.2)于培养皿一端划线，在离细菌线的6cm处接种直径为5mm的致病菌菌饼，25℃静置培养，以得到6个实验组。
对照组：在PDA培养基的一端接种直径为5mm的致病菌菌饼，25℃静置培养，以得到每个致病菌的对照组。
待对照菌落长满培养基时，测量各处理抑菌圈大小，计算抑制率。
如表5、图9和图10的结果表明，贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20对多种致病菌均具有较强的抑制作用。
表5 贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20对多种病原菌的抑制率
Figure GDA0003428390510000161
<试验例4>
本试验例旨在研究贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20对田间及采后的桃褐腐病的生防效果
一、贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在田间对桃褐腐病的生防效果
实验地位于华中农业大学南湖果园，桃树品种为“曙光”油桃(P.persicavar.nectarine‘Shuguang’)和“安农”水蜜桃(P.persica Batsch.cv.‘Annong’)，株行距2m×3m，历年桃褐腐病发病严重，选择该田块用来实验。
实验药剂分别选取贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20和农药苯甲醚菌酯，贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20施用时稀释100倍(稀释后贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的浓度为107cfu/mL)，农药苯甲醚菌酯(有效成分嘧菌酯和苯醚甲环唑，浓度分别为200g/L和125g/L)的2000倍稀释液，同时设立清水对照，共3个处理，以完全随机区组设计分布图。
每个处理4个重复，每个重复包括3～4棵树(取决于每棵树上的果实数量)，屏障树(未处理的树)用于分离处理。
所有治疗均在早晨或者傍晚使用背负式喷雾器进行，每棵树被持续喷雾1～2L药剂，在桃树落花坐果期(4月中上旬)喷洒第一次药，之后每隔10～15天喷洒一次，共施药4次，时间分别在2019年4月12号、4月22号、5月2号、5月12号，并于最后一次施药后7天开始调查统计各处理桃果实发病率。
调查方法：一棵树上选取50个果实(不足50个选取整树全部果实)统计病果树，要考虑到树上和地下的果实总数(健康的和受桃褐腐病影响掉落)，每个重复共150个桃果实，每个处理4个重复约600个桃果实，统计出桃褐腐发病率并计算各处理防效。
Figure GDA0003428390510000181
二、贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在采后对桃褐腐病的生防效果
“曙光”油桃果实成熟后，设置处理组1(贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20发酵菌液的浓度为107cfu/mL)、处理组2(2000倍稀释农药苯甲醚菌酯)和对照处理组(清水)，每个处理组中均包括10个随机收集的健康桃果实，将每个处理组内的健康桃果实分别放置在对应的处理组内浸泡处理30s后，放置在接种盘中，于25℃和99％湿度保存，注意每个处理组内各个桃果实的间距以及接种盘的稳定，以避免它们之间的接触以及随之而来的污染，统计不同时间各处理中的病果率，并计算防效。
Figure GDA0003428390510000182
结果见表6、表7、图11和图12，以上结果表明贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在田间能够一定程度抑制褐腐病的发生和发展，对采后褐腐病具有良好的防效。
表6 贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20处理在田间对桃褐腐病的防效
Figure GDA0003428390510000183
表7 贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20处理不同时间后曙光油桃果实发病情况
Figure GDA0003428390510000184
<试验例5>
本试验例旨在研究贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的发酵液对抑制桃腐烂和延长采后贮藏保鲜时间的影响
购买自市场的健康水蜜桃(prunus persica Batsch.cv.)，经贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20发酵液(单位体积活菌量为109～1010cfu/mL)浸泡30s，取出后放置于25℃恒温保湿的接种盘内，对照为水处理，每个处理10个重复，观察记录各处理桃果实不同时间的腐败数，计算防效。
Figure GDA0003428390510000191
结果见图13和表8，以上结果表明贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20能抑制贮藏期各种桃腐烂病的发生，延长了贮藏保鲜的时间。
表8 贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20处理后对桃果实腐烂病的抑制率
Figure GDA0003428390510000192
综上实验结果表明，本发明贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的发酵液可用于制备防治桃褐腐病和延长桃采后贮藏保鲜时间的产品，以及制备拮抗美澳型核果褐腐菌、贝氏葡萄座腔菌苹果专化型、果生炭疽菌、福士拟茎点霉菌、尖孢镰刀菌和匍枝根霉菌产品。
在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本申请请求保护的范围。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治桃褐腐病上的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 菌株WH-P2-20
<400> 1
cgcggcgggc gtgcctatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180
cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420
agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260
aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag gaagtttgta aacacccgga aaagtcggtg gaaggtaaac cttttaaggg 1440
aagccagccg cccga 1455
<210> 2
<211> 553
<212> DNA
<213> 菌株WH-P2-20
<400> 2
tgcatagcgc agagctatgc tcgcattagc gaagtgttag aattaccaaa tctcattgaa 60
attcaaacct cttcttatca gtggtttctt gatgagggtc ttagagagat gtttcaagac 120
atatcaccaa ttgaggattt cactggtaac ctctctctag agttcattga ctacagttta 180
ggagatccta agtatcccgt tgaagagtca aaagaacgtg atgtgactta ctcagctccg 240
ctgagagtga aggttcgttt aattaacaaa gaaactggag aggtaaaaga tcaggatgtc 300
ttcatgggtg atttccctat tatgacagat accggtactt ttatcatcaa cggtgcagaa 360
cgtgttatcg tatctcagct tgttcggtct ccaagtgtat atttcagtgg taaagtagac 420
aaaaacggta aaaaaggttt taccgcgact gtcattccaa accgtggcgc atggttagaa 480
tacgaaactg atgcgaaaga tgttgtgtat gtccgcattg atcgcacacg taagttgccg 540
gttacggttc tta 553

Claims (9)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)WH-P2-20，保藏编号为CCTCC NO:M2020257，于2020年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在防治桃褐腐病中的应用。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在拮抗美澳型核果褐腐菌(Monilinia fructicola)、贝氏葡萄座腔菌苹果专化型(Botryosphaeria berengeriana f.sp.mali)、果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)、福士拟茎点霉菌(Phomopsis fukushii)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)中的应用。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20在延长桃采后贮藏保鲜时间中的应用。
5.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液由权利要1所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20制得。
6.根据权利要求5所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液为液体菌剂，且所述发酵液中所述贝莱斯芽孢杆菌WH-P2-20的浓度为109～1010cfu/mL。
7.权利要求5所述的发酵液在制备防治桃褐腐病和延长桃采后贮藏保鲜时间产品中的应用。
8.权利要求5所述的发酵液在制备拮抗美澳型核果褐腐菌、贝氏葡萄座腔菌苹果专化型、果生炭疽菌、福士拟茎点霉菌、尖孢镰刀菌和匍枝根霉菌产品中的应用。
9.一种测定对美澳型核果褐腐菌孢子萌发抑制率的方法，其特征在于，主要包括以下几个步骤：
S1、利用权利要求5所述发酵液，将所述发酵液离心后经0.22μm细菌过滤器过滤，得到菌株的无菌发酵液；
S2、将无菌发酵液加入WA培养基中混匀，分别制得所述无菌发酵液的体积分数为1％、5％和10％的平板；
S3、待WA培养基凝固后，在WA培养基的表面平铺一层无菌玻璃纸；
S4、在玻璃纸上涂布100μL浓度为105cfu/mL的美澳型核果褐腐菌孢子悬浮液，25℃的条件下暗培养12h，观察所述美澳型核果褐腐菌的孢子萌发情况，以及计算孢子萌发率和芽管伸长抑制率。
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