DK175699B1 - Nucleinsyremolekyle, rekombinant DNA-vektor indeholdende nucleinsyremolekylet, rekombinant ekspressionsvektor indeholdende nucleinsyremolekylet, celle indeholdende nucleotidsekvensen, oplöseligt CR1-polypeptid, fremgangsmåde til fremstilling ............. - Google Patents

Description

DK 175699 B1 1 ;

Den foreliggende opfindelse angår et nucleinsyremo-lekyle som angivet i krav 1-7, en rekombinant DNA-vektor indeholdende nucleinsyremolekylet som angivet i krav 8-10, i en rekombinant ekspressionsvektor indeholdende nulceinsyre- .

5 molekylet som angivet i krav 11-15, en celle indeholdende nueleotidsekvensen som angivet i krav 16-18, et opløseligt CRl-polypeptid som angivet i krav 19 og 21-28, en fremgangsmåde til fremstilling deraf som angivet i krav 20, en fremgangsmåde til rensning af det opløselige CRl-polypeptid som 10 angivet i krav 29-31, en farmaceutisk sammensætning indeholdende polypeptidet som angivet i krav 32-36 samt anvendelse ; af polypeptidet som angivet i krav 37.

I CRl-nucleinsyrerne og -proteinerne har anvendelse ved diagnose eller terapi af sygdomme, som involverer kom- 15 plementaktivitet, og forskellige betændelses- og immunsyg- i domme.

» i I Komplementsystemet, i Komplementsystemet er en gruppe proteiner, som udgør 20 ca. 10% af globulinerne i det normale serum fra mennesker (L.E. Hood et al., 1984, Immunology, 2. udg., The Benjamin/-Cummings Publishing Co., Menlo Park, Californien, side 339). Komplement (C) spiller en vigtig rolle ved medieringen af immun- og allergireaktioner (H.J. Rapp og T. Borsos, 1970, 25 Molecular Basis of Complement Action, Applet on-Century-Crofts (Meredith), New York). Aktiveringen af komplementkomponenter fører til frembringelsen af en gruppe faktorer, herunder kemotaktiske peptider, som medierer den betændelse, som er forbundet med komplementafhængige sygdomme. Den sekventielle 30 aktivering af komplementkaskaden kan ske ad den klassiske vej, som involverer antigen-antistof-komplekser, eller ad en alternativ vej, som involverer erkendelsen af visse celle-vægspolysaccharider. De af aktiverede komplementproteiner mediererede aktiviteter omfatter lyse af målceller, kemotaxi, 35 opsonisering, stimulering af vaskulære og andre, glatte muskelceller og funktionelle afvigelser, såsom degranulering I DK 175699 B1 2 af mastceller, forøget permeabilitet af små blodkar, dirigeret vandring af leukocyter og aktivering af B-lymphocyter og makrophager (H.N. Eisen, 1974, Immunology, Harper & Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland, side 512).

5 Under proteolytiske kaskadetrin frigives biologisk aktive peptidfragmenter, anaphylatoxinerne C3a, C4a og C5a (se WHO Scientific Group, 1977, WHO Tech. Rep. Ser. 606, 5, ; og deri angivne litteraturhenvisninger) fra den tredie (C3), j fjerde (C4) og femte (C5) native komplementkomponent (T.E.

10 Hugli, 1981, CRC Crit. Rev. Immunol. 1, 321; H. Bult og A.G. Herman, 1983, Agents Actions 13, 405).

; C3b/C4b-komplementreceptoren (CR1).

Den humane C3b/C4b-receptor, betegnet CR1, er til 15 stede på erythrocyter, monocyter/macrophager, granulocyter, 3-celler, visse T-celler, folliculære, dendritiske miltceller og glomerulære podocyter (D.T. Fearon, 1980, J. Exp. Med.

152, 20, J.G. Wilson et al., 1983, J. Immunol. 131, 684; M.

Reynes et al., 1985, J. Immunol. 135, 2687; M.C. Gelfand et 20 al., 1976, N. Engl. J. Med. 2 95, 10; M.D. Kazatchkine et > al., 1982, Clin. Immunol. Immunopathol. 27:170). CR1 binder specifikt C3b, C4b og iC3b. En opløselig form af receptoren er blevet fundet i plasma, som ligandbindende aktivitet og samme molekylvægt som membranassocieret CR1 (S.H. Yoon og 25 D.T. Fearon, 1985, J. Immunol. 134, 3332). CR1 binder C3b

og C4b, som er blevet covalent knyttet til immunkomplekser og andre komplementaktivatorer, og konsekvenserne af disse I

vekselvirkninger afhænger af den celletype, som bærer recep- I

toren (D.T. Fearon og W.W. Wong, 1983, Ann. Rev. Immunol. I

3 0 1, 243) . Erythrocyt-CRl binder immunkomplekser for transport ‘ I

til leveren (J.B. Cornacoff et al., 1983, J. Clin. Invest. I

71, 236; M.E. Medof et al., 1982, J. Exp. Med. 156; 1739). I

CRl på neutrophiler og monocyter internaliserer bundne kom- I

plekser enten ved adsorptiv endocytose via overtrukne porer I

35 (D.T. Fearon, et al., 1981, J. Exp. Med. 153, 1615; D.R. I

Abrahamson og D.T. Fearon, 1983, Lab. Invest. 48, 162) eller I

• I

DK 175699 B1 3 ved phagocytose efter aktivering af receptoren af phorboles-tere, kemotaktiske peptider eller proteiner, som er til stede i den ekstracellulære grundmasse, såsom fibronectin og laminin (S.L. Newman et al., 1980, J. Immunol. 125, 2236; 5 S.D. Wright og S.C. Silverstein, 1982, J. Exp. Med. 156, 1149; S.D.. Wright et al., 1983, J. Exp. Med. 158, 1338). Phosphorylering af CR1 kan spille en rolle ved opnåelsen af phagocytisk aktivitet (P.S. Changelian og. D.T. Fearon, 1986,.

J. Exp. Med. 163, 101). Funktionen af CR1 på B-lymphocyter 10 er mindre afgrænset, selv om behandling af disse celler med antistof mod CRi har forøget deres reaktion på suboptimale doser af kermesbærmitogen (M.R. Daha et al., 1983, Immuno-biol. 164, 227 (sammendrag)). CRI på folliculære, dendritiske celler kan tjene en antigenpræsentationsrolle (G.G.B. Klaus

Il 15 et al., 1980, Immunol. Rev. 53, 3).

ί CRI kan også inhibere den klassiske og alternative vej C3/C5-konvertaser og virke som en cofaktor for spaltningen af C3b og C4b af faktor I, hvilket antyder, at CRI også j har komplementregulerende funktioner ud over at tjene som 20 en receptor (D.T. Fearon, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

76, 5867; K. Iida og V. Nussenzweig, 1981, J. Exp. Med.

153, 1138). Ved den alternative vej til komplementaktivering er det bimolekylære kompleks C3b,Bb et C3-aktiverende enzym (konvertase). CRI (og faktor H, ved højere koncentrationer) 25 kan binde til C3b og kan også fremme dissocieringen af C3b,-Bb. Desuden gør dannelse af C3b,CRl (og C3b,H) C3b følsomt for irreversibel, proteolytisk inaktivering af faktor I, hvilket resulterer i dannelsen af inaktiveret C3b (iC3b).

Ved den klassiske vej til komplementaktivering er komplekset 30 C4b,2a C3-konvertasen. CRI (og C4-bindende protein, C4bp, ved højere koncentrationer) kan binde til C4b og kan også fremme dissocieringen af C4b,2a. Bindingen gør C4b følsom for irreversibel, proteolytisk inaktivering af faktor I ved spaltning til C4c og C4d (inaktiverede komplementproteiner) .

35 CRi er et. glycoprotein sammensat af en enkelt polypep- tidkæde. Der er blevet fundet fire allotypiske former af H DK 175699 B1 ' CRl, som afviger i molekylvægte med størrelser på ca. 40.000- ! -50.000 dalton. De to mest almindelige former, F- og S-allo- 1 H typerne, også betegnet A- og B-allotyperne, har molekylvægte H på hhv. 250.000 og 290.000 dalton (T.R. Dykman et al., 1983, 5 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 1698, W.W. Wong et al., H 1983, J. Clin. Invest. 72, 685), og de to sjældnere former har molekylvægte på 210.000 og over 290.000 dalton (T.R.

Dykman et al., 1984, J. Exp. Med. 159, 691; T.R. Dykman et.

H al., 1985, J. Immunol. 134, 1787). Disse forskelle repræsen- 10 terer tilsyneladende variationer i polypeptidkæden i CRl snarere end. glycosyleringstilstand, fordi de ikke ophæves ved behandling af renset receptorprotein med endoglycosidase F (W.W. Wong et al., 1983, J. Clin. Invest. 72, 685), og de er blevet iagttaget, når' receptorallotyper biosyntetiseres 15 i nærværelse af tunicamycin (D.M. Lublin et al., 1986, J.

Biol. Chem. 261, 5736). Alle fire CRl-allotyper har C3-bin-H dende aktivitet (T.R. Dykman et al., 1983, Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 80, 1698; W.W. Wong et al., 1983, J. Clin. In- j vest. 72, 685; T.R. Dykman et al., 1984, J. Exp. Med. 159, 20 691,- T.R. Dykman et al., 1985, J. Immunol. 134, 1787).

H Det er blevet vist, at to ikke-overlappende restrik- H tionsfragmenter af CRl-cDNA krydshybridiserer under betingel- H ser med høj strenghed (W.W. Wong et al., 1985, Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 82, 7711). Begge cDNA-sonder hybridiserer 25 også til multiple restriktionsfragmenter af genom-DNA, hvoraf det meste er fælles for begge sonder (id.). Eksistensen af gentagne kodesekvenser i CRl er blevet bekræftet ved se- kvenssammenligninger (L.B. Klickstein et al., 1985, Comple- ment 2, 44 (sammendrag)). Desuden er det blevet vist, at 30 CRl-genet har gentagne, mellemliggende sekvenser, ved at I der er blevet påvist krydshybridisering af en genomsonde, som mangler kodesekvenser, til flere genomrestriktionsfrag- I menter (W.W. Wong et al., 1986, J. Exp. Med. 164, 1531).

I Endvidere har DNA fra et individ med den større S-allotype 35 haft et yderligere restriktionsfragment, som hybridiserer til denne genomsonde, når der sammenlignes med DNA fra et 5 DK 175699 B1 individ med F-allotypen, hvilket antyder, at duplikering af genomsekvenser er sket i forbindelse med CR1-allelen med højere molekylvægt (id.) [ Det er blevet vist, at CR1 har homologi til komple- 5 mentreceptor type 2 (CR2) (J.J Weis, et al., 1986, Proc.

' Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643). j j Unormaliteter af CR1 ved human sygdom.

i j Formindsket ekspression af CR1 på erythrocyter hos : 10 patienter med systemisk lupus erythematosus (SLE) er blevet rapporteret af forskere fra adskillige geografiske regioner, herunder Japan (Miyakawa et al., 1981, Lancet 2, 493-497;

Minota et al., 1984, Arthr. Rheum. 27, 1329-1335), USA (Iida et al., 1982, J. Exp. Med. 155, 1427-1438; J.G. Wilson et 15 al., 1982, N. Engl. J. Med. 307, 981-986) og Europa (Walport ! et al., 1985, Clin. Exp. Immunol 59, 547; Jouvin et al., 1986, Complement 3, 88-96; Holme et al., 1986, Clin. Exp.

Immunol. 63, 41-48). Taget som en gruppe har patienter et gennemsnitligt antal receptorer pr. celle, som er 50-60% af 20 antallet hos normale populationer. En tidlig rapport har i bemærket, at CR1-antallet på erythrocyter varierer omvendt med sygdomsaktiviteten, idet de laveste antal indtræder under perioder med de kraftigste manifestationer af SLE, og højere antal iagttages under perioder med bedring hos samme 25 patient (Iida et al., 1982, J. Exp. Med. 155, 1427-1438).

CR1-antallet har også vist sig at korrelere omvendt med serumniveauer af immunkomplekser, med serumniveauer. af C3d og med mængderne af erythrocytbundet C3dg, hvilket måske genspejler optagelse af komplementaktiviterende immunkomplek-30 ser og afsætning på erythrocyten som en "uskyldig tilskuer" (Ross et al., 1985, J. Immunol. 135, 2005-2014; Holme et al., 1986, Clin. Exp. Immunol. 63, 41-48; Walport et al., 1985, Clin. Exp. Immunol 59, 547) . En patient med SLE, som mangler CR1 på erythrocyter, har vist sig at have et auto-35 antistof mod CR1 (Wilson et al., 1985, J. Clin. Invest. 76, 182-190). Nedsatte titere af anti-CRl-antistoffet er faldet

I DK 175699 B1 I

I

sammen med forbedring af patientens' kliniske tilstand og I

med delvis reversering af receptorunormaliteten. Anti-CRl- I

antistof er blevet påvist hos to andre SLE-patienter (Cook I

I et al., 1986, Clin. Immunol. Immunopathol. 38, 135-138). I

H 5 For nylig er erhvervet tab af erythrocyt-CR1, når aktiv SLE I

H og hæmolytisk anæmi sætter ind, blevet påvist ved iagttagelse

H af det hurtige tab af receptoren fra transfuserede erythro- I

I cyter (Walport et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 69, 501- I

I 507) I

I 10 Det relative tab af CR1 fra erythrocyter er også I

blevet iagttaget hos patienter med infektioner af humant I

immunomangelvirus (HIV) (F.A. Tausk et al., 1986, J. Clin. I

Invest. 78, 977-982) og med lepromatøs spedalskhed (F.A. I

I Tausk et al., 1985, J. Invest. Dermat. 85, 58s-61s). I

I 15 Unormaliteter i komplementreceptorekspression ved I

I SLE er ikke begrænset til erythrocyt -CR1. Det er blevet I

H vist, at der forekommer relative mangler på totalt celle- I

I CR1 hos neutrophiler og plasmamembran-CRl i B-lymphocyter I

I hos SLE-patienterne (Wilson et al., 1986, Arthr. Rheum. 29, I

I 20 739-747). I

I - Hos patienter med SLE-nephritis af type IV mistes H

I alt påviseligt CRl-antigen fra podocyter, medens CRl-ekspres- I

I sion på glomerulære podocyter ved mindre strenge former af I

SLE-nephritis og ved ikke-SLE-typer af proliferativ nephri- I

25 tis, herunder membranoproliferativ glomerulonephritis af H

I typerne I og II, ikke afviger fra den normale (Kazatchkine H

I et al., 1982, J. Clin. Invest. 69, 900-912; Emancipator et H

I al., 1983, Clin. Immunol. Immunopathol. 27, 170-175). Patien- I

ter med SLE-nephritis af type IV har imidlertid ikke et I

I 30 mindre antal erythrocyt-CR1 end SLE-patienter med andre H

I typer af nyrelupus eller uden nephritis (Jouvin et al., I

I 1986, Complement 3, 88-96). I

I Komplementaktivering in vivo opregulerer CRl-ekspres- I

I sionen ved plasmamembranen på neutrophiler (J. Lee et al., H

I 35 1984, Clin. Exp. Immunol. 56, 205-214; F.D. Moore, Jr. et H

I al., 1986, N. Engl. J. Med. 314, 948-953). I

DK 175699 B1 7

Opfindelsen angår også opløselige CR1-nucleinsyre-sekvenser og fragmenter deraf omfattende 70 nucleotider og deres kodede peptider eller proteiner omfattende 24 aminosyrer. Opfindelsen angår ligeledes ekspressionen af CR1-5 protein og fragmenter deraf. CRl-nucleinsyrerne og -protei-* nerne har anvendelse ved diagnose eller terapi af sygdomme, som involverer komplementaktivitet, og forskellige betændel-i ses- og immunsygdomme.

j Ved specifikke udførelsesformer for den foreliggende 10 opfindelse, som er beskrevet detaljeret i eksemplerne i nedenstående afsnit, er der også beskrevet kloning, nucleo-tidsekvens og afledt aminosyresekvens hos en CRl-cDNA af fuld længde og fragmenter deraf. Ekspressionen af CRl-prote-inet og fragmenter deraf er også beskrevet. Der opnås eks-15 pression af CR1-proteinet og dets fragmenter, som indeholder bindingssteder for C3b og/eller C4b, og som udviser cofaktoraktivitet for faktor I.

Også beskrevet i eksemplerne nedenfor er produktionen og rensningen af opløselige CR1-molekyler, og det er vist, 20 at disse molekyler er terapeutisk anvendelige til behandlingen af betændelsesreaktioner og ved formindskelse af størrelsen af myocardial infarct og forhindringen af reperfusions-skader.

25 3.1. Definitioner.

Ad2-MLP = adenovirus 2, sen hovedpromotor, C = komplement, C3(ma) = methylaminbehandlet C3, C4bp = C4-bindingsprotein, 30 CMV = cytomegalovirus, CR1 = komplementreceptor type 1, C3b/C4b-receptoren, CR2 = komplementreceptor, type 2, DCFDA = dichlorfluorescindiacetat, 35 HPLC = væskechromatografi med høj ydeevne, iC3b = inaktiveret C3b,

DK 175699 B1 I

I i

LHR = lang, homolog gentagelse, I

H mAb = monoklonalt antistof, I

H PAGE = polyacrylamidgelelektrophorese, I

H RPAR = omvendt, passiv Arthrus-reaktion I

5 SCR = kort, samstemmende gentagelse, I

sCRl = opløseligt CR1-molekyle. I

Beskrivelse af tegningen. I

Fig. 1 viser nucleotid- og aminosyresekvensen i hele I

10 CRl-koderegionen. Sekvensen begynder med det første nucleotid I

efter octamer EcoRI-linkeren i klon XT109.1. Nucleotid nr. I

1531 i denne sekvens er det første nucleotid 5' i forhold I

til nucleotid nr. 1 af den i fig. 3 viste sekvens. Den I

streng, som svarer til mRNA, er vist med den afledte amino- I

I 15 syresekvens vist neden under. Den formodede signalsekvens, I

som kodes af nucleotidnumrene 28-147, er vist i kantet paren- ' I

I tes. I

Fig. 2 viser et restriktionskort over 5,5 kb human I

I CRl-cDNA. Den kraftige sorte linie angiver cDNA, og restrik- I

I 20 tionsstederne er H, Hindlll; B, BamHI; R, EcoRI; P, PstI; I

I A, Apal, S, SacI; G, Bglll; K, Kpnl. De cDNA-kloner, ud fra I

hvilke sekvensen er afledt, er vist under kortet. Pilene I

angiver retningen og udstrækningen af sekvensanalyse ved

I dideoxynucleot idskædeafslutningsmetoden. cDNA-kloner er I

25 blevet orienteret på basis af restriktionskort og overlap- I

pende sekvensidentitet. I

I Fig. 3 viser en nucleotidsekvens på 5,5 kb af human ... I

I CRl-cDNA. Den streng, som svarer til mRNA, er vist, og base I

nr. 1 (svarende til base nr. 1532 i fig. 1) er den første H

I 30 base efter EcoRI-linkeren i den klon, som ligger mest i 5'-

I retningen. Stopcodonen er understreget. Sekvensen på 110 bp I

I i indramningen er fundet mellem nucleotiderne 147 og 148 I

I (pil) og antages at repræsentere en del af en intervenerende I

I sekvens. I

I 35 Fig. 4 viser pletmatrixanalyse af nucleotidsekvensen I

I på 5,5 kb i human CRl-cDNA. En plet er blevet afbildet, I

DK 175699 B1 ' 9 hvis der har været et sammenfald på mindst 40 bp ud af 90 bp. Den mørke linie, som deler kvadratet diagonalt, angiver sekvensens identitet med sig selv. De to yderligere, parallelle, mørke linier 1,35 og 2,5 kb fra identitetslinien 5 repræsenterer to direkte, lange, homologe tandemgentagelser (LHR) på hver især 1,35 kb. De seks lysere, brudte linier mellem de to LHR svarer til korte, samstemmende gentagelser på ca. 0,2 kb. De korte, samstemmende gentagelser (SCR) strækker sig 0,4 kb ud over de lange, homologe gentagelser.

10 Fig. 5 viser den afledte aminosyresekvens i human CR1. Kver rest er vist i énbogstavkoden (A.L. Lehninger, 1975, Biochemistry, 2. udg., Worth Publishers, Inc., New York, side 72) . Resterne i de lange, homologe gentagelser er blevet afbildet for at illustrere deres homologi. Alle 15 resterne i LHR-B er vist, og der er kun angivet en rest for LHR-C og LHR-D, hvor den er, forskellig fra den i LHR-B. En hydropatiprofil er afbildet under COOH-terminus i proteinet for at illustrere den sandsynlige transmembranregion.

En strækning på fire positivt ladede rester umiddelbart 20 efter den hydrofobe sekvens har en linie over sig. Sekvensen på 6 aminosyrer med 67% homologi til stedet for proteinkinase C-phosphorylering i den epidermale vækstfaktorreceptor er understreget. Et skematisk diagram af CRl-proteinet er vist over sekvensen. (TM) transmembranregion, (Cyt) cytoplasmisk 25 region, (3'UT) 31-ikke-translateret sekvens.

Fig. 6 A viser en afbildning af SCR'er i CR1. Gentagelserne er nummereret 1-23 fra NH2-terminal til COOH-ter-minal. Mellemrum er blevet indført for at maksimere placeringen på linie. Blokkene repræsenterer ikke-variable rester, 30 og de lodrette pile angiver stillinger med aminosyrebevarel-se. En rest bedømmes som bevaret, hvis den, eller en konservativ ombytning, er til stede i mindst halvdelen af disse SCR'er. Den vandrette del angiver en SCR, som også er blevet sekvenseret fra CRl-genomklon 2.38, og som kodes af en enkelt 3 5 exon.

Fig. 6 B viser restriktionskort, sekvenseringsstrategi

I DK 175699 B1 I

I I

I og delvis sekvens i genomklon X2.38. Restriktionsstederne I

I er: (B) BamHI, (S) Sad, (E) EcoRV, (K) Kpnl, (P) Pstl. Den I

vandrette pil viser retning og udstrækning af sekvensering, I

H og de lodrette pile angiver exon-intron-grænserne. I

I 5 Fig. 7 viser en afbildning af den samstemmende sekvens I

i SCR'er i proteiner, som vides at have denne struktur. . I

H Mellemrum er indført for at maksimere placeringen på linie. j I

En rest bedømmes som bevaret som i fig. 5, bortset fra de I

· proteiner, som kun har en eller to SCR'er, hvori en rest er I

I 10 bevaret, hvis den er til stede i mindst halvdelen af de I

I andre proteiner. De brudte linier svarer til ikke-bevarede I

stillinger. De understregede dele af CR2 og C2b angiver, at I

I der ingen sekvensinformation er blevet publiceret i denne

I region for disse proteiner. Indramningerne angiver de ikke- I

15 -variable halvcystiner. Nummeret til højre for sekvensen I

repræsenterer det antal SCR'er, som er anvedt til frembrin- I

gelse af den samstemmende sekvens. Proteinforkortelserne I

I og de litteratursteder for sekvensdata, som er anvendt til I

bestemmelse af de samstemmende sekvenser, er: (CR1) komple- I

20 mentreceptor type 1, (H) faktor Η {T. Kristensen et al., I

1986, J. Immunol. 136, 3407), (C4bp) C4-bindingsprotein I

I (L.P.Chung et al., 1985, Biochem. J. 230, 133), (CR2) komple- I

I mentreceptor type 2 (J.J. Weis, et al., 1986, Proc. Natl. I

I Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643), (Ba) proteolytisk fragment I

I 25 af faktor B (B.J. Morley og R.D.Campbell, 1984, EMBO J. 3, I

I 153), (C2b) proteolytisk fragment af C2 (J. Gagnon, 1984,

I Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 306, 301), (Clr I

I r-underenhed af Cl (S.P. Leytus et al., 1986, Biochemistry H

I 25, 4855), {Xlllb) b-underenhed af faktor XIII (A. Ichinose I

I 30 et al., 1986, Biochemistry 25, 4633), (S2GP1) β2-glycoprotein I

I I (J. Lozier et al., 1984, Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A. I

I 81, 3640), (Hap) haptoglobin (A. Kurosky et al., 1980, Proc. I

I Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 3388), (IL-2-R) interleukin-2- I

I receptoren (W.J. Leonard et al., 1985, Science 230, 633). I

I 35 En stjerne angiver, at en ufuldstændig sekvens er til rådig- I

I hed. I

11 DK 175699 B1

Fig. 8 viser et skematisk diagram af den foreslåede struktur af humant CR1. Den COOH-terminale, cytoplasmiske region er på højre side af lipiddobbeltlaget. 30 SCR'er er j- opstillet lineært på den ekstracellulære side af plasmamem- ! 5 branen. Klammerne angiver LHR'er. Indsatsen er en forstørrel- • se af en enkelt SCR til illustration af den tredobbelte i sløjfestruktur.

Fig. 9 viser et restriktionskort over indsætningen af det plasmid, pBSABCD, som koder humant CR1. Indgivet 10 inde i den indramning, som afbilder regionen indeholdende kodesekvensen, er de 9 fragmenter af 8 cDNA-kloner, som er I blevet ligateret til dannelse af CR1-konstruktionen. Klam merne angiver stillingerne for hhv. LHR-A, -B, -C og -D. Linierne under neden indramningen repræsenterer stillingen 15 for de nyisolerede 5'-cDNA-kloner. Restriktionsstederne er: A, Apal; B, BamHI; G, Bglll; H, Hindlll; K, kpnl; M, BSpMII; P, PstI; R, EcoRI; S, SacI.

Fig. 10 viser den afledte aminosyrésekvens i de 51-cDNA-kloner, som koder de syv SCR'er i LHR-A og en afbildning 20 af denne sekvens sammen med de tilsvarende SCR'er i LHR-B, -C og -D. De fire cysteiner, som er bevaret i hver enkelt SCR, er understreget. For LHR-B, -C og -D er en rest kun vist, hvor den er forskellig fra resten i LHR-A.

Fig. 11 viser restriktionskort over ekspressionsplas-25 miderne piABCD og pMTABCD. PmMT og Pcmv repræsenterer de øjeblikkelige, tidlige promotorer for hhv. musemetallothio-nein og cytomegalovirus.

Fig. 12 viser analyse ved fasekontrastmikroskopi (plader a og c) og immunofluorescensmikroskopi (plader b 30 og d) af COS-celler transficeret med hhv. piABCD (plader a og b) og CDM8-vektor alene (plader c og d) og indirekte farvet med YZ1 monoklonalt anti-CRl-antistof og fluorescein-mærket gede-anti-muse-F(ab1)2·

Fig. 13 viser analyse af C3b- og C4b-binding af COS-35 celler, som eksprimerer rekombinant-CRl. COS-celler transficeret med piABCD (plader a og c) eller med CDM8-vektoren

I DK 175699 B1 I

I

I alene (plader b og d) er blevet inkuberet med EAC4b(lim),- I

3b (plader a og b) eller med EAC4b (plader c og d) og under- I

I søgt for dannelsen af rosetter ved fasekontrastmikroskopi. I

Fig. 14 viser analyse af rekombinant-CRl eksprimeret I

Hi 5 af transficerede COS-celler ved SDS-PAGE. COS-celler trans- I

^H

H ficeret med hhv. CDM8-vektoren alene (kolonner 1 og 4) og I

H med piABCD (kolonnerne 2 og 5) og erythrocyter fra et individ I

H roed F- og S-allotyperne af CR1 (kolonnerne 3 og 6) er blevet I

H overflademærket med Detergentlysater af cellerne im- I

H 10 munoadsorberes sekventielt med ,,Sepharose®-UPC10" (kolonnerne I

H ! 1-3) og "Sepharose®-YZl" (kolonnerne 4-6), og eluaterne I

H analyseres ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser I

H og ved autoradiografi. I

Fig. 15 viser spaltning af 125I-C3(ma) af faktor li I

I 15 nærværelse af immunoimmobiliseret rekombinant-CRl. Replikat- I

I prøver 12^I-C3(ma)' behandles med faktor I nærværelse af I

I faktor H (kolonne 1) , "Sepharose®-UPC10" i forvejen inkuberet I

I med lysatet af COS-celler transficeret med CDM8-vektoren . I

I . alene (kolonne 2), "Sepharose®-UPC10" i forvejen inkuberet I

I 20 med lysatet af piABCD-transficerede COS-celler (kolonne 3), I

"Sepharose®-YZl" i forvejen inkuberet med lysatet af CDM8- I

I transf icerede COS-celler (kolonne 4) samt 6 /iliter (kolonne I

I 5) , 12 eliter (kolonne 6) og 25 ^liter (kolonne 7) "Sepha- I

I ,rose®-YZl", som er blevet forinkuberet med lysatet af piABCD- I

· 25 -transficerede COS-celler. Prøver af 12^I-mærket C3(ma) I

I j behandles også i fravær af faktor I med 25 /xliter "Sepha- I

I ' rose®-YZl" som i forvejen er blevet inkuberet med lysatet I

I af piABCD-transficerede COS-celler (kolonne 8) . Efter reduk- I

I tion analyseres 125I-C3(ma) ved SDS-PAGE og autoradiografi. I

I 30 Fig. 16 viser de cDNA-konstruktioner, som koder CR1- I

I -udeladelsesmutanterne. Stillingerne for de cDNA-segmenter, I

I som koder de fire LHR’er er vist ved klammerne over piABCD- I

-konstruktionen af fuld længde, hvorpå der er vist de re- I

I striktionssteder, som er anvendt til fremstilling af udela- I

I 35 delsesmutanterne. De cDNA-restriktionsfragmenter, som bliver I

I tilbage i hver enkelt af mutanterne, er vist ved de ubrudte H

13 DK 175699 B1 linier. Restriktionsstederne er: A, Apal; B, Bsml; E, BstEII; P, Pstl.

Fig. 17 viser en sammenligning åf rekombinantudeladel-sesmutanter af CR1 med F- og S-allotyperne af CRl af vildty-5 pen. Detergentlysater af 123I-overflademærkede erythrocyter ·. (kolonnerne 1 og 7) COS-celler transficeret med hhv. CDM8- -vektoren alene (kolonnerne 2 og 8) , piABCD (kolonnerne 3 og 9), piBCD (kolonnerne 4 og 10) , piCD (kolonnerne 5 og 11) og piD (kolonnerne 6 og 12) er blevet imtnunoudfældet 10 med hhv. "Sepharose®"-UPC10"-anti-levan-antistof (kolonnerne 1-6), monoklonalt ”Sepharose®-YZl"-anti-CRl-antistof (kolonnerne 7-11) og kanin-anti-CRl-antistof og "Sepharose®"-protein A (kolonne 12). Eluaterne er blevet underkastet SDS--PAGE under reducerende betingelser og autoradiografi.

15 Fig. 18 viser spaltning af 125I-C3(ma) af faktor I i nærværelse af COS-celler, som eksprimerer CRl i fuld længde og udiadelsesmutanter af CRl. Replikatprøver af 125I-C3(ma) er blevet inkuberet med COS-celler transficeret med hhv.

CDM8-vektoren alene (kolonnerne 1 og 7), piABCD (kolonnerne 20 2 og 8) , piAD (kolonnerne 3 og 9) , piBD (kolonnerne 4 og 10) , piCD (kolonnerne· 5 og 11) og piD (kolonnerne 6 og 12) i fravær (kolonnerne 1-6) eller nærvær (kolonnerne 7-12) af faktor I. Prøver af 12^l-C3(ma) er også blevet inkuberet med hhv. faktor H og faktor I (kolonne 13) og med faktor I 25 alene (kolonne 14). Efter reduktion er -*-25l-C3 (ma) blevet analyseret ved SDS-PAGE og autoradiografi.

Fig. 19 viser en skematisk model, som afbilder de typer af SCR'er, som udgør hver LHR i CRl, og de forudsagte steder, som bestemmer specificiteterne af receptoren for 30 C3b og C4b. De sekundære bindingsspecificiteter af disse er vist ved parenteserne.

Fig. 20 viser et skematisk diagram, som illustrerer de DNA-regioner, som bliver tilbage i de opløselige CR1-DNA-konstruktioner. Regionerne i CRl-cDNA af fuld længde 35 er vist ved rammerne langs toppen af figuren.

Fig. 21 viser et skematisk diagram, som illustrerer

I DK 175699 B1 I

I

hovedelementerne i pTCS-rækken af ekspressionsvektorer. I

Fig. 22 viser et diagram over ekspressionsvektoren I

pTCSgpt. Polyadenyleringsstedet er fra muse-Ig-kappa-se- I

kvenser^(NBRF-nucleindatabaseaccessionsnummer Kcms, bp 1306- I

5 1714); Ad2 MLP- og tripartitregionerne er fra Ad2-sekvensen I

(NBRF-nucleindatabaseaccessionsnummer Gdad2, bp 5791-6069); \ I

Den tidlige SV40 promotor er fra SV40-genomet (NBRF-nuclein- I

H j databaseaccessionsnummer GSV40W). gpt-genet, ampici11ingenet I

og bakterieoprindelsen til replikation er fra vektoren I

I 10 pSV2gpt (ATCC accessionsnummer 37145). I

I Fig. 23 viser 4-20%'s SDS-PAGE af antistofaffinitets- I

H renset sCRl. Ikke-reducerende (kolonnerne 1, 2 og 3) og I

reducerende (kolonnerne 4, 5 og 6) betingelser. Kolonnerne I

1 og 2 : molekyl vægt smaerkestof fer; kolonnerne 3 og 5: udgangs- I

I 15 materiale fra ovenstående cellekultur; kolonnerne 4 og 6: I

sCRl renset ved antistofaffinitetschromagrafi. I

Fig. 24 viser kationbytter-HPLC-elueringsprofilen. I

Elueret protein overvåges ved absorption ved 280 nm (y-akse) . I

Absorptionen af både gennemstrømningen (0-100 minutter) og I

20 den eluerede sCRl (150-165 minutter) er begge uden for måle- I

stokken, x-aksen repræsenterer elueringstiden i minutter. I

I Fig. 25 viser 4-20%'s gradient-SDS-PAGE af kation- I

I og anionbytter-HPLC-renset sCRl. SDS-polyacrylamidgeler I

køres under ikke reducerende betingelser. Kolonne 1 er en I

H 25 . portion af ovenstående bioreaktorvæske; kolonne 2 er en I

I portion af ovenstående bioreaktorvæske dialyseret imod ka- I

tion-HPLC-udgangspuffer; kolonne 3 er en portion af den I

I eluerede sCRl-spids fra en kat ionbyt ter-HPLC-kolonne; kolonne I

I 4 er en portion af sCRl-spidsen fra kationbytter-HPLC-kolon- I

I 30 nen dialyseret i udgangspuffer for anion-HPLC; kolonnerne 5 I

og 6 er portioner af to forskellige fraktioner af elueret I

I sCRl fra anion-HPLC. I

I Fig. 26 viser C5a-tilskyndelse af et oxygenudbrud i I

I humane neutrophiler. Efter et C5a-tilskyndet oxygenudbrud I

I 35 bliver DCFDA oxideret og svagt fluoresceret. Fluorescensin- I

I tensiteten, som bestemt ved strømcytometri, er målt på x- I

15 DK 175699 B1 aksen, og antallet af celler er målt på y-aksen. Plade a viser profil og passage for cellerne; plade b er 0 minutter efter C5a-tilsætning; plade c 1 minut; plade d 2 minutter; plade e 3 minutter; plade f 4 minutter; plade g 20 minutter.

5 Denne DCFDA-afprøvning giver en følsom indikation for C5a.

Fig. 27 viser, at aktivering af humant komplement i nærvær af sCRl udviser nedsat C5a-aktivitet ved DCFDA-afprøv-ningen. Plade a ustimulerede celler; plade b, kontrol uden sCRl, som udviser en høj grad af fluorescens; plade c DCFDA-10 afprøvning i nærvær af sCRl, som udviser en nedgang på 75% i fluorescensintensitet, y-aksen er antallet af celler, og x-aksen er fluorescensintensitet.

Fig. 28 viser inhibering af den klassiske vej C5a-og C3a-produktion i humant serum ved hjælp af sCRl. Lignende 15 profiler er iagttaget for både antistofaffinitetsrenset og HPLC-renset sCRl. - j i

Fig. 29 viser inhibering af komplementmedieret hæmo-lyse ved hjælp af rekombinant-sCRl. Lignende profiler er iagttaget for både antistofaffinitetsrenset og HPLC-renset 20 sCRl.

Fig. 30 viser den grove morphologi af RPAR i sCRl-behandlede (til venstre) og ubehandlede (til højre) rotter.

(a) Begge rotter har fået en intravenøs injektion af ovalbumin efterfulgt af en intradermal injektion af en blanding 25 af enten sCRl (venstre rotte) eller PBS (højre rotte) med anti-ovalbumin, rent (venstre sted); anti-ovalbumin, en % : fortynding (midterstedet) eller kanin-IgG (højre sted). 1

Injektionerne er gennemført som dobbeltforsøg; top- og bundrækkerne har givet identiske resultater. Den rotte, som har 30 fået sCRl, har næppe synlige ændringer, medens den ubehandlede rotte har udviklet fulde symptomer på RPAR. (b) Den dermale overflade af hudbiopsier fra (a). Biopsien fra den ubehandlede rotte (til højre) har udviklet en tydeligt synlig læsion, medens biopsien fra den sCRl-behandlede rotte (til 35 venstre) har vist normal morphologi.

Fig. 31 viser lysmikroskopi af hudbiopsier fra sCRl-

II

DK 175699 B1 j I

behandlede (a) og ubehandlede (b) rotter, (a) Der iagttages I

perivaskulær akkumulering af polymorphonucleare og mononucle- I

are celler, men der ses imidlertid ingen ekstensiv infiltre- I

ring af neutrophiler eller extravasation af erythrocyter. I

5 (b) Der identificeres ekstensiv infiltrering af' polymor- I

phonucleare celler og extravasation af erythrocyter. I

I en specifik udførelsesform angår opfindelsen oplø- I

selige CRl-molekyler og ekspressionen, rensningen og anven- I

delsen deraf. Som her anvendt skal udtrykket "opløselige I

10 CRl-molekyler" betyde dele af CRl-proteinet, som, i modsæt- I

ning til de native CRl-proteiner, ikke eksprimeres på cel- I

leoverfladen som membranproteiner og praktisk taget mangler I

en transmembranregion. Ved en foretrukket udførelsesform I

udskilles de opløselige CRl-molekyler af en celle, hvori de I

15 eksprimeres. I

Ved specifikke udførelsesformer for den foreliggende |

opfindelse, som er detaljeret beskrevet i nedenstående eksem- I

pelafsnit, beskrives kloningen og det komplette nucleotid | og den afledte aminosyresekvens i CRl-cDNA af fuld længde | 20 og af fragmenter deraf samt ekspressionen af de kodede CR1- | produkter. Ekspressionen af CR1 og fragmenter deraf, som | har bindingssteder for C3b og/eller C4b, og som inhiberer |

cofaktoraktivitet for faktor I, er også beskrevet. Opfindel- I

sen er yderligere illustreret ved produktionen og rensningen I

25 af opløselige, afkortede CRl-molekyler. I specifikke ek- I

sempler er det vist, at sådanne molekyler er terapeutisk I

anvendelige ved nedsættelse af betændelse og ved formindskel- I

se af størrelsen af myocardial infarct og ved forhindring af I

reperfusionsskader. I

30 I

Isolering af CRl-genet. I

Den komplette kodesekvens i CRl-genet og dens afledte I

aminosyresekvens er vist i fig. 1. I

Enhver human celle kan potentielt tjene som nuclein- I

35 syrekilden for den molekylære kloning af CRl-genet. Isole- I

ring af CRl-genet indebærer isoleringen af de DNA-sekvenser, I

Η

I DK 175699 B1 I

som koder et protein, som udviser CR1-associeret struktur, I

egenskaber eller aktiviteter, f.eks. binding af C3b eller I

, C4b eller immunkomplekser, modulering af phagocytose, im- I

munstimulering eller -formering og regulering af komplement. I

5 DNA kan fås ved standardmetoder, som er kendte på området, I

ud fra klonet DNA (f.eks. et DNA-"bibliotek"), ved kemisk I

syntese, ved cDNA-kloning eller ved kloning af genom-DNA I

eller fragmenter deraf, renset fra den ønskede, humane celle, I

se f.eks. T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A I

10 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring I

Harbor, New York; D.M. Glover (udg.), 1985, DNA' Cloning: A I

Practical Approach, MRL Press, Ltd.,.Oxford, GB, bind I, I

II) . Celler, som kan tjene som kilder for nucleinsyre til I

cDNA-kloning af CR1-genet, omfatter, men er ikke begrænset I

15 til monocyter/makrophager, granulocyter, B-celler, τ-celler, I

folliculære, dentritiske miltceller og glumerulare podocyter. I

Kloner stammende fra genom-DNA kan indeholde regulerende I

og intron-DNA-regioner ud over kodende regioner, medens I

kloner stammende fra cDNA kun vil indeholde exonsekvenser. I

i 20 Uanset kilden bør CR1-genet klones molekylært ind i en egnet I

vektor til formering af genet. I

Ved den molekylære kloning af genet fra genom-DNA I

frembringes der DNA-fragmenter, hvoraf nogle vil kode det I

ønskede CRl-gen. DNA kan spaltes ved specifikke steder ved I

25 anvendelse af forskellige restriktionsenzymer. Alternativt kan man anvende DNAse i nærvær af mangan til fragmentering af DNA, eller DNA kan opskæres fysisk, f.eks. ved sonikering.

Derefter kan de lineære DNA-fragmenter adskilles efter størrelse ved standardteknik, herunder, men ikke begrænset til 30 agarose- og polyacrylamid-gelelektrophorese og kolonnechro-matografi.

Når først DNA-fragmenterne er frembragt, kan identifikation af det specifikke DNA-fragment indeholdende CR1-35 -genet gennemføres på en række måder. Hvis der f.eks. er en mængde af et CRl-gen eller dets specifikke RNA eller et

I· I

DK 175699 B1 18

fragment deraf til rådighed, og det kan renses og mærkes, I

kan de frembragte DNA-fragmenter screenes ved nucleinsyrehy- I

bridisering til den mærkede sonde (W. Benton og R. Davis, I

1977, Science 196, 180; M. Grunstein og D. Hogness, 1975, I

5 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961). De DNA-fragmenter, I

som har væsentlig homologi til sonden, vil hybridisere. I

Hvis en renset, CRl-specifik sonde ikke er til rådighed, kan I

der som sonde anvendes nucleinsyrefraktioner beriget på CR1 I

som en indledende udvælgelsesproces. Som et eksempel kan I

10 der anvendes den sonde, som repræsenterer B-celle-cDNA, I

hvorfra budskaber eksprimeret af fibroblaster er blevet I

subtraheret. Det er også muligt at identificere det hen- I

sigtsmæssige fragment ved én eller flere restriktionsenzym- I

digereringer og sammenligning af fragmentstørrelser med I

I 15 dem, som forventes ifølge et kendt restriktionskort, hvis I

et sådant er til rådighed. Yderligere udvælgelse på basis I

af genets egenskaber eller de fysiske, kemiske eller im- I

, munologiske egenskaber af dets eksprimerede produkt, som I

j beskrevet i det følgende, kan anvendes efter den indledende I

20 udvælgelse. I

CR1-genet kan også identificeres ved mRNA-udvælgelse I

ved nucleinsyrehybridisering efterfulgt af translation in I

vitro. Ved denne metode anvendes der fragmenter til isolering I

af komplementære mRNA'er ved hybridisering. Sådanne. DNA- I

25 fragmenter kan repræsentere til rådighed værende, renset I

CR1-DNA eller DNA, som er blevet beriget på CR1-sekvenser. I

Immunoudfældningsanalyse eller funktionelle afprøvninger I

.(f.eks. for C3b- eller C4b-binding, fremme af phagocytose I

eller immunostimulering eller komplementregulering) af pro- I

30 dukterne fra translationen in vitro af de isolerede mRNA'er I

identificerer mRNA og derfor de komplementære DNA-fragmenter, I

som indeholder CR1-sekvenserne. Desuden kan specifikke mRNA'- I

er udvælges ved adsorption af polysomer isoleret fra celler I

til immobiliserede antistoffer, som er specifikt rettet I

35 imod CRl. En radiomærket CRl-cDNA kan syntetiseres ved anven- I

delse af den udvalgte mRNA (fra de adsorberede polysomer) I

DK 175699 B1 I

19 I

som et templat. Den radiomærkede mRNA feller cDNA kan derefter , I

anvendes som sonde til identifikation af CR1-DNA-fragmenter- i I

ne blandt andre genom-DNA-fragmenter. ; I

Alternativer til isolering af CR1-genom-DNA omfatter, I

5 men er ikke begrænset til, kemisk syntese af selve gensekven- I

sen ud fra en kendt sekvens eller omdannelse af cDNA til I

den mRNA, som koder CRl-genet. F.eks. kan som ovenfor be- ' I

skrevet RNA for cDNA-kloning af CRl-genet isoleres fra cel- : I

ler, som omfatter, men ikke er begrænset til monocyter/makro- I

10 phager, granulocyter, B-celler, T-celler, dendritiske celler

I og podocyter. Ved en foretrukket udførelsesform kan tonsilare I

celler tjene som kilden for mRNA til cDNA-kloning (se neden- I

stående afsnit 6.1.2.). Andre metoder er mulige og inden I

for opfindelsens rammer. I

15 Det identificerede og isolerede gen kan derefter I

indsættes i en hensigtsmæssig kloningsvektor. Et stort antal I

vektor-værts-systemer, som er kendt på området, kan anvendes. I

Mulige vektorer omfatter, men er ikke begrænset til, plas- I

mider eller modificerede vira, men vektorsystemet skal være I

20 foreneligt med den anvendte værtscelle. Sådanne vektorer I

omfatter, men er ikke begrænset til, bakteriophager, såsom I

lambda-derivater, eller plasmider, såsom PBR322- eller pUC- I

plasmid eller CDM8-plasmid (B. Seed, 1987, Nature 329, 840- I

842) eller derivater deraf. Rekombinantmolekyler kan ind- I

25 føres i værtsceller via f.eks. transformation, transfektion, infektion eller elektroporation.

; Ved en alternativ metode kan CRl-genet identificeres og isoleres efter indsættelse i en egnet kloningsvektor, ved en "haglgevær"-metode. Berigelse på CRl-genet, f.eks. ved 30 størrelsesfraktionering, kan foretages før indsættelse i kloningsvektoren.

CRl-genet indsættes i en kloningsvektor, som kan anvendes til transformation, transfektion eller infektion af hensigtsmæssige værtsceller, således at der skabes mange 35 kopier af gensekvenserne. Ved en specifik udførelsesform kan kloningsvektoren være CDM8-vektoren, som kan anvendes

I DK 175699 B1 I

til opnåelse af ekspression i en pattedyrværtscelle. Indsæt- I

teisen i en kloningsvektor kan f.eks. opnås ved ligatering I

af DNA-fragmentet ind i en kloningsvektor, som har komplemen- I

: tære, kohæsive termini. Hvis de komplementære restriktions- I

{ 5 steder, som er anvendt til fragmentering af DNA, imidlertid I

' ikke er til stede i kloningsvektoren, kan enderne af DNA- I

molekylerne modificeres enzymatisk. Alternativt kan ethvert I

ønsket sted frembringes ved ligatering af nucleotidsekvenser I

(linkere) på DNA-termini, og disse ligaterede linkere kan I

10 udgøres af specifikke, kemisk syntetiserede oligonucleotider, , I

som koder restriktionsendonucleaseerkendelsessekvenser. Ved I

en alternativ metode kan den spaltede vektor og CR1-genet I

modificeres ved homopolymerhaledannelse. I

Identifikation af det klonede CRl-gen kan gennemføres I

15 på en række måder baseret på egenskaberne af selve DNA eller I

alternativt på de fysiske, immunologiske eller funktionelle I

egenskaber, af dets kodede protein. F.eks. kan DNA selv påvi- I

ses ved plaque- eller koloninucleinsyrehybridisering til I

mærkede sonder (W. Benton og R. Davis, 1977, Science 196, I

20 180; M. Grunstein og D. Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. I

Sci. U.S.A. 72, 3961). Alternativt kan tilstedeværelsen af I

CR1-genet påvises ved afprøvninger baseret på egenskaber I

af dets eksprimerede produkt. Der kan f.eks. udvælges cDNA- I

-kloner eller DNA-kloner, som hybridudvælger de rigtige I

j 25 mRNA'er, som producerer ét protein, som f.eks. har tilsvaren- I

j de eller identisk, elektrophoretisk vandring, isoelektrisk I

i fokuseringsopførsel, proteolytiske digereringskort, C3b- I

og/eller C4b- og/eller immunkompleksbindingsaktivitet, kom- I

plementreguleringsaktivitet, virkninger på phagocytose eller I

30 immunstimulering eller antigenegenskaber som kendt for CR1. I

Ved anvendelse af et antistof mod CR1, kan CR1-proteinet I

identificeres ved binding af mærket antistof til de kloner, I

som formodes at syntetisere CR1, ved en metode af ELISA- I

-typen (enzymbundet immunosorbentafprøvning). I

35 Ved specifikke udførelsesformer muliggør transforma- I

tion af værtsceller med rekombinant-DNA-molekyler, som inkor- I

DK 175699 B1 ( i i | 21 porerer det isolerede CRl-gen, cDNA eller syntetiseret DNA-sekvens, skabelse af mange kopier af genet. Genet kan således opnås i store mængder ved dyrkning af transformanter, isole- 1 ring af rekombinant-DNA-molekylerne fra transformanterne 5 og, hvor dette er nødvendigt, genvinding af det indsatte gen fra den isolerede rekombinant-DNA.

Ved en særlig udførelsesform kan CRl-cDNA-kloner i en CDM8-vektor transficeres ind i COS-celler (abenyre) til ekspression i stor målestok under kontrol af cytomegalovirus -10 promotoren (se nedenstående afsnit 8).

Hvis slutmålet er at indsætte genet i virusekspressionsvektorer, såsom vacciniavirus eller adenovirus, kan det rekombinant-DNA-molekyle, som inkorporerer CR1-genet, modificeres således, at genet er flankeret af virussekvenser, 15 som tillader genetisk rekombination i celler inficeret med viruset, således at genet kan indsættes i virusgenomet.

Efter at den CRl-DNA-holdige klon er blevet identificeret, dyrket og høstet, kan dens DNA-indsætning karakteriseres som beskrevet i nedenstående afsnit 5.4.1.

20 Når den genetiske struktur af CR1-genet er kendt, er det muligt at manipulere strukturen til optimal anvendelse ved den foreliggende opfindelse. F.eks. kan promotor-DNA--ligateres 5' i forhold til den CRl-kodende sekvens ud over eller i stedet for den native promotor til tilvejebringelse 25 af forøget ekspression af proteinet. Ekspressionsvektorer, som eksprimerer CR1 -udeladelsesmutanter, kan også fremstilles til tilvejebringelse af ekspression af afgrænsede fragmenter af CRl-sekvensen (se nedenstående eksempelafsnit). Ved en speciel udførelsesform kan der konstrueres udeladelsesmutan-30 ter, som koder fragmenter af CR1-proteinet, som udviser den ønskede C3b- og/eller C4b-bindingsaktivitet (se nedenstående afsnit 9), f.eks. LHR-A til binding af C4b eller LHR-C til binding af C3b. Ved en foretrukket udførelsesform kan en ekspressionsvektor, som koder et CRl-molekyle med en udela-35 delse af transmembranregionen, anvendes til produktion af et opløseligt CRl-molekyle (se nedenstående eksempelafsnit

I DK 175699 B1 I

I i

11-14). Mange manipuleringer er mulige og inden for rammerne I

af den foreliggende opfindelse.

Ekspression af det klonede CRl-gen. I

5 Den nucleotidsekvens, som koder for CR1-proteinet I

(fig. 1) eller en del deraf, kan indsættes i en hensigtsmæs- I

sig ekspressionvektor, dvs. en vektor, som indeholder de I

nødvendige elementer til transkriptionen og translationen I

af den indsatte, proteinkodende sekvens. De nødvendige tran- ; I

10 skriptions-og translationssignaler kan også tilføres af det

native CRl-gen og/eller dets flankerende regioner. En mang- I

foldighed af værts-vektor-systemer kan anvendes til ekspri- : I

mering af den proteinkodende sekvens. Disse omfatter, men I

er ikke begrænset til, pattedyrcellesystemer inficeret med I

H 15 virus (f.eks. vacciniavirus eller adenovirus), insektcel- I

lesystemer inficeret med virus (f.eks. baculovirus), mikro- I

organismer, såsom gær, indeholdende gærvektorer, eller bak-

terier transformeret med bakteriophag-DNA, plasmid-DNA eller I

I cosmid-DNA. Ekspressionselementerne i disse vektorer vari- I

20 erer i styrke og specificiteter. Afhængigt af det anvendte I

værts-vektor-system kan der anvendes en vilkårlig af en række I

egnede transkriptions- og translationselementer. Når der .

klones i pattedyrcellesystemer, kan der f.eks. anvendes H

promotorer isoleret fra genomet i pattedyrceller eller fra . I

H 25 vira, som vokser i disse celler (f.eks. adenovirus, menneske- I

abevirus .40, cytomegalovirus). Promotorer produceret af I

rekombinant-DNA eller ved syntetisk teknik kan også anvendes I

I til tilvejebringelse af transkription af de indsatte sekven- I

I ser. I

I 30 Specifikke initieringssignaler er også nødvendige I

I I til effektiv translation af indsatte, proteinkodende sekven- I

I ser. Disse signaler omfatter ATG-initieringscodonen og til- H

I stødende sekvenser. I de tilfælde, hvor hele CR1-genet, I

I herunder dets egen initieringscodon og tilstødende sekvenser, I

35 indsættes i de hensigtsmæssige ekspressionsvektorer, kan I

I det være unødvendigt med yderligere translationskontrolsig- I

I DK 175699 B1 23 naler. I de tilfælde, hvor der kun indsættes en del af den CRl-kodende sekvens, skal der imidlertid tilvejebringes exogene translationskontrolsignaler, herunder ATG-initie-i- ringscodonen. Initieringscodonen skal ydermere være i fase i 5 med læserammen i de proteinkodende sekvenser for at sikre translation af hele indsætningen. Disse exogene translations-. kontrolsignaler og initieringscodoner kan være af meget forskellig oprindelse, både naturlig og syntetisk.

En vilkårlig af de metoder, som tidligere er beskrevet 1 10 for indsættelsen af DNA-fragmenter i en vektor, kan anvendes til konstruktion af ekspressionsvektorer indeholdende et I chimert gen bestående af hensigtsmæssige transkriptions/- translationskontrolsignaler og de proteinkodende sekvenser.

Disse metoder kan omfatte teknikken med rekombinant-DNA in 15 vitro og synteseteknik og rekombinationer in vivo (genetisk rekombination).

Et opløseligt CR1-molekyle kan produceres véd anvendelse af rekombinant-DNA-teknik til udeladelse af de DNA-sekvenser, som koder CR1-transmembranregionen (se nedenstå-20 ende afsnit). Som vist nedenfor er evnen til ekspression af et opløseligt CR1-molekyle ikke begrænset til en bestemt genetisk modifikation af CRl-nucleinsyresekvensen. Når blot den nucleinsyresekvens, som koder en væsentlig del af CR1-transmembranregionen, udelades, kan der opnås opløselige 25 CR1-konstruktioner.

Ekspressionsvektorer indeholdende opløselige CR1-genindsætninger kan identificeres ved 3 almene metoder: (a) DNA-DNA-hybridisering, (b) nærvær eller fravær af "mærke-stof "-genfunktioner og (c) ekspression af indsatte sekvenser.

30 Ved den første metode kan tilstedeværelsen af et fremmed gen indsat i en ekspressionsvektor påvises ved DNA-DNA-hybridisering ved anvendelse af sonder, som omfatter sekvenser, som er homologe til det indsatte CRl-gen. Ved den anden metode kan rekombinant-vektor/værts-systemet identificeres 35 og udvælges baseret på nærværet eller fraværet af visse "mærkestof"-genfunktioner (f.eks. thymidinkinaseaktivitet,

I DK 175699 B1 I

resistens mod antibiotika, transformationsphenotype, occlu- I

sionslegemedannelse i baculovirus) forårsaget af indsættel- I

sen af fremmede gener i, vektoren. Hvis f.eks. CRl-genet I

j indsættes i mærkestofgensekvensen i vektoren, kan rekombi- I

j 5 nanter indeholdende CRl-indsætningen identificeres ved fra- I

; været af mærkestofgenfunktionen. Ved den tredie metode kan I

rekombinantekspressionvektorer identificeres ved afprøvning I

af det fremmede genprodukt eksprimeret af rekombinanten. I

Sådanne afprøvninger kan være baseret på de fysiske, immuno- ' I

10 logiske eller funktionelle egenskaber af genproduktet. I

I Når først et specielt rekombinant-DNA-molekyle er I

i identificeret og isoleret, kan der anvendes adskillige meto- I

der til dets formering. Når først et egnet værtssystem og I

vækstbetingelser er etableret, kan rekombinantekspressions- I

15 vektorer formeres og fremstilles i større mængde. I

Ved en speciel udførelsesf orm, som er detaljeret I

beskrevet i eksemplerne på opfindelsen, kan CDM8-vektorer I

med en sCRl-cDNA-indsætning transficeres ind i COS-celler, I

hvori sCRl-cDNA-indsætningen eksprimeres til produktion af I

20 sCRl-proteinet. Ved en anden speciel udførelsesform, som er I

detaljeret beskrevet i nedenstående eksempelafsnit, kan I

CDM8-vektorer med en sCRl-cDNA-indsætning svarende til en I

del af sCRl-koderegionen transficeres ind i COS-celler, hvor I

sCRl eller fragmentet eksprimeres. Ifølge et andet eksempel I

25 i det følgende kan afkortede, opløselige CRl-molekyler eks- I

primeres i pattedyrceller ved anvendelse af ekspressionsvek- I

torer, såsom de pTCS-vektorer, som er beskrevet i afsnit I

11.3.1. Som ovenfor forklaret omfatter de anvendelige eks- I

pressionsvektorer, uden at være begrænset dertil, følgende I

30 vektorer eller deres derivater: human- eller dyrevira, såsom I

vacciniavirus eller adenovirus, insektvira, såsom baculovi- I

rus, gærvektorer, bakteriophagvektorer (f.eks. lambda) og I

plasmid- og cosmid-DNA-vektorer for blot at nævne nogle få. I

Desuden kan der udvælges en værtscellestamme, som I

35 modulerer ekspressionen af de indsatte sekvenser eller modi-

ficerer og behandler det chimere genprodukt på den specielt I

DK 175699 B1 25 i ønskede måde. Ekspression fra visse promotorer kan forøges i nærværelse af visse tilskyndere.Derfor kan ekspressionen af det genetisk konstruerede CR1-protein kontrolleres. Endvidere har forskellige værtsceller karakteristiske og speci-5 fikke mekanismer for den translationelle og posttranslatio-nelle behandling og modifikation af proteiner. Hensigtsmæssige cellelinier eller værtssystemer kan udvælges til sikring af den ønskede modifikation og behandling af det heterologe, eksprimerede protein. F.eks. kan ved en udførelsesform eks-10 pression i et bakteriesystem anvendes til produktion af et ! uglycosyleret CRl-protein med den i fig. 1 viste, afledte aminosyresekvens. Ekspression i gær vil producere et glyco-; syleret produkt. Ved en anden udførelsesform kan pattedyr- COS-celler anvendes til sikring af "nativ" glycosylering af 15 det heterologe CRl-protein-. Endvidere kan forskellige vek-tor/værts-ekspressionssystemer påvirke behandlingsreaktioner, såsom proteolytiske spaltninger, i forskellig udstrækning.

Mange sådanne, på forskellig måde behandlede CRl-proteiner, kan produceres og falder inden for rammerne af den forelig-20 gende opfindelse.

Ved en foretrukket udførelsesform. for opfindelsen kan produktion af opløselige CRl-molekyler i stor målestok gennemføres som beskrevet nedenfor.

25 Idenfikation oc rensning af det eksprimerede genprodukt.

Når først en rekombinant, som eksprimerer sCRl-genet, er identificeret, skal genproduktet analyseres. Dette kan opnås ved afprøvninger baseret på produktets fysiske, immunologiske eller funktionelle egenskaber.

30 sCRl-proteinerne kan isoleres og renses ved stan dardmetoder, herunder chromatografi, (f.eks. ionbytnings-, affinitets- og større lseskolonnechromatograf i, højtryksvæske-chromatografi), centrifugering, forskellig opløselighed eller ved vilkårlig anden standardteknik til rensningen af 35 proteiner.

Ved et foretrukket aspekt for opfindelsen, som er

I DK 175699 B1 I

beskrevet detaljeret i nedenstående eksempler, kan store I

mængder opløselig CR1 renses ved metoder, som indebærer I

HPLC (se afsnit 12.2 f.f.}. Som nedenfor beskrevet kan pro- I

duktion af renset CRl-i stor målestok opnås ved anvendelse I

5 af et ekspressionsystem, som producerer opløselig CR1 som I

udgangsmateriale, således at kravet om opløseliggørelse af I

membranbundet CR1 med detergenter elimineres. Nedsættelse I

af kalvefosterserumkoncentrationerne i bioreaktorkulturerne I

og/eller anvendelsen af alternative kulturmedier i disse I

10 kulturer eliminerer behovet for fjernelse af høje koncentra- I

tioner af udefra kommende proteiner fra det opløselige, I

CRl-holdige udgangsmateriale under efterfølgende rensning. I

Enten kation-HPLC eller en kombination af kation-HPLC efter- I

fulgt af anionbytter-HPLC kan anvendes til rensning ved I

15 dette foretrukne aspekt. Praktisk taget ren, opløselig CR1 I

i højt udbytte kan derfor opnås i kun ét eller to trin. I

Når først et sCRl-protein produceret af en rekom- I

binant er identificeret, kan produktets aminosyresekvens I

alternativt udledes ud fra nucleotidsekvensen i det chimere I

20 gen, som er indeholdt i rekombinanten. Som resultat heraf I

kan proteinet syntetiseres ved kemiske standardmetoder, som I

er kendte på området (se f.eks. M. Hunkapiller et al., 1984, I

Nature 310, 105-111) . I

Ved specielle udførelsesformer for opfindelsen omfat- I

25 ter sådanne sCRl-proteiner, hvad enten de er produceret ved I

rekombinant-DNA-teknik eller ved kemiske syntesemetoder, I

uden dog at være begrænset hertil, dem, der som en primær I

aminosyresekvens indeholder hele eller en del af aminosyre- I

sekvensen i alt væsentligt som vist i fig. 1, herunder ænd- I

30 rede sekvenser, hvori funktionelt ækvivalente aminosyre- I

rester indgår i stedet for rester i sekvensen, hvilket resul- I

terer i en tavs ændring. F.eks. kan én eller flere aminosyre- I

rester i sekvensen være erstattet af en anden aminosyre med I

en tilsvarende polaritet, som virker som et funktionelt I

35 ækvivalent, hvilket resulterer i en tavs ændring. Ikke-kon- I

servative ombytninger kan også resultere i funktionelt ækvi- I

27 DK 175699 B1 valente proteiner.

Ved en udførelsesform kan erstatninger for en aminosyre i sekvensen udvælges fra andre medlemmer af den klasse, hvortil aminosyren hører. De ikke-polære (hydrophobe) amino-5 syrer omfatter f.eks.· alanin, leucin, -isoleucin, valin, prolin, phenylalanin, tryptophan og methionin. De polære, neutrale aminosyrer omfatter glycin, serin, threonin, cyste-in, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De 10 negativt ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyre. Inden for opfindelsens rammer falder ligeledes CR1-proteiner, som er modificeret på forskellig måde under eller efter translation, f.eks. ved glycosylering eller proteolytisk spaltning.

15 I et éksempel på opfindelsen, som er detaljeret be skrevet i det følgende, er det blevet vist, at klonet rekom-binant-CRl eksprimeret af transficerede celler ikke kan skelnes fra F-allotypen af erythrocyter ved SDS-PAGE (fig.

14) , at det kan mediere bindingen af fåreerythrocyter, som 20 bærer enten C4b eller C3b, og at det kan reproducere ligandspecificiteten i CR1 (fig. 13), og at det udviser cofaktoraktivitet ' for faktor I for spaltning af α-polypeptidet i C3 (ma) (fig. 15) .

25 Struktur af CRl-oenet og -proteinet.

Strukturen af CR1-genet og -proteinet kan analyseres ved forskellige metoder, som er kendte på området, herunder de i det følgende beskrevne, men ikke begrænset hertil.

30 Genetisk analyse.

Den klonede DNA eller cDNA svarende til CR1-genet kan analyseres ved metoder, som omfatter, men som ikke er begrænset til, Southern-hybridisering (E.M. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98, 503-517), Northern-hybridisering (se f.eks.

35 Freeman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 4094-4098), restriktionsendonucleasekortlægning (Maniatis

I DK 175699 B1 I

H 28 I

I il

et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold : I

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) og I

DNA-sekvensanalyse. Strengheden af hybridiseringsbetingel- I

H serne for både Southern- og Northern-hybrid!sering kan mani- |

H 5 puleres til sikring af påvisning af nucleinsyrer med den , I

ønskede grad af beslægtethed til den specifikt anvendte j I

H CRl-sonde. F.eks. kan hybridisering under betingelser med : I

lav strenghed med en sonde indeholdende CR1-gensekvenser, I

som koder LHR-B og LHR-C, anvendes til påvisning af CR2- - I

10 nucleinsyresekvenser. I

Restriktionsendonucleasekortlægning kan anvendes til I

grov bestemmelse af den genetiske struktur af CRl-genet. I

Ved en speciel udførelsesform kan spaltning med restriktions- I

enzymer anvendes til udledning af det restriktionskort, som I

15 er vist i fig. 2. Restriktionskort stammende fra restrik- I

I tionsendonucleasespaltning kan bekræftes ved DNA-sekvensana- I

lyse. I

DNA-sekvensanalyse kan gennemføres ved enhver teknik, I

som er kendt på området, herunder, men ikke begrænset til, I

20 Maxam-Gilbert-metoden (A.M. Maxam og W. Gilbert, 1980, Meth. I

I Enzymol. 65, 499-560), Sanger-dideoxykædeafslutningsmetoden I

(F. Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, I

5463) eller af en automatisk DNA-sekvensator (f.eks. fra

Applied Biosystems, Foster City, CA) . cDNA-sekvensen for I

I 25 CRl-genet omfatter sekvensen i alt væsentligt som vist i fig.

I 1 og beskrevet i nedenstående afsnit. I

I Proteinanalvse. -I

I Aminosyresekvensen i CRl-proteinet kan frekomme ved I

I 30 udledning ud fra DNA-sekvensen eller alternativt ved direkte I

sekvensering af proteinet, f.eks. med en automatisk aminosy- I

resekvensator. Aminosyresekvensen for et repræsentativt H

I CRl-protein omfatter en sekvens i alt væsentligt som vist i I

I fig. 1 og detaljeret beskrevet i nedenstående afsnit 6. Som I

35 beskrevet nedenfor er hele kodesekvensen i F-allotype-CRl I

I blevet klonet, og efter fraspaltning af signalpeptidet på I

29 DK 175699 B1 41 aminosyrer indeholder den modne receptor 1998 aminosyrer, herunder et ekstracellulært domæne på 1930 rester, som danner 30 SCR'er, hvoraf 28 er organiseret i LHR-A,’ -B, -C og -D (fig. 10), et enkelt membranomspændende domæne på 25 amino-5 syrer og et relativt kort, cytoplasmisk domæne på 43 aminosyrer.

t

Blandt de C3/C4-bindende proteiner, som indeholder i flere SCR'er, er CR1 særegent, ved at det har grupper af SCR'er organiseret i LHR'er. Sammenligning af de fire LHR'er 10 i CR1 afslører, at de hver især er sammensat af fire typer af SCR'er: typerne a, b, c og d (fig. 19). F.eks. er se kvenserne SCR-1 og -2 i LHR-A kun 62%, 62% og 57% identiske med de to første SCR'er i hhv. LHR-B, -C og -D. SCR-3 til SCR-7 afviger imidlertid kun i en enkelt stilling fra de j 15 tilsvarende SCR'er i LHR-B, og SCR-3 og -4 afviger kun i tre stillinger fra dem i LHR-C (fig. 10) . Derfor er nogle SCR'er i LHR-A af type "a" også til stede i LHR-B og -C. De første to SCR'er i LHR-B, som afviger fra dem i LHR-A, er 99% identiske med de tilsvarende SCR'er i LHR-C, således at j 20 LHR-B og -C deler SCR af type "b" i disse stillinger. Den j femte, sjette og syvende SCR i LHR-C er 77% identisk med SCR’er af type "a" i LHR-A og -B i disse stillinger, og de betragtes som SCR'er af type "c". Den første til den fjerde SCR i LHR-D er relativt særegen og er type "d", medens den 25 femte til den syvende SCR er ca. 93% identisk med den type "c", som findes i LHR-C.

CRl-proteinsekvensen kan yderligere karakteriseres ved hjælp af en hydrophilicitetsanalyse (T. Hopp og K. Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 3824). En hydrophili-30 citetsprofil kan anvendes til identifikation af de hydrophobe og hydrophile regioner i CRl-proteinet og de tilsvarende regioner i den gensekvens, som koder sådanne regioner. En hydrophilicitetsprofil for COOH-terminus i CRl-proteinet er vist i fig. 5.

35 Sekundær strukturanalyse (P. Chou og G. Fasman, 1974,

Biochemistry 13, 222) kan også foretages til identifikation

I DK 175699 B1 I

af regioner i CR1, som antager specifikke, sekundære struk- I

turer. I

Andre metoder til strukturanalyse kan også anvendes. I

Disse omfatter, men er ikke begrænset til røntgenstrålekry- I

5 stallografi (A. Engstom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11, 7- I

13) og computermodeller (R. Fletterick og M. Zoller, (udg.), I

1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, i Current I

Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor I

Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). I

CR1-beslægtede derivater, analoge og peptider. I

Produktionen og anvendelsen af derivater, analoge og I

peptider beslægtet med sCRl er ligeledes forudset og falder I

inden for opfindelsens rammer. Sådanne derivater, analoge I

15 eller peptider,, som har den ønskede immunogenicitet eller I

antigenicitet, kan f.eks. anvendes ved immunoafprøvninger, I

til immunisering eller terapeutisk. Sådanne molekyler, som I

bibeholder en ønsket sCRl-egenskab, f.eks. binding af C3b I

eller C4b, regulering af komplementaktivitet eller fremme I

20 af immunstimulering eller phagocytose, kan anvendes som I

tilskyndere for en sådan egenskab. I

De sCRl-beslægtede derivater, analoge og peptider I

j ifølge opfindelsen kan fremstilles ved forskellige metoder, I

som er kendt på området. De manipuleringer, som resulterer I

1' 25 i deres produktion, kan forekomme på gen- eller proteinnive- I

i auet. F.eks. kan det klonede sCRl-gen modificeres ved en I

vilkårlig af talrige strategier, som er kendt på området I

(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory I

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, I

30 New York). CRl-sekvensen kan spaltes på hensigtsmæssige I

steder med én eller flere restriktionsendonucleaser, om I

ønsket efterfulgt af yderligere enzymatisk modifikation, I

isoleres og ligateres in vitro (se nedenstående afsnit). I

Ved produktionen af det gen, som koder et derivat, en analog I

35 eller et peptid beslægtet med sCRl, må der drages omsorg I

for, at det sikres, at det modificerede gen forbliver i I

31 DK 175699 B1 samme translationelle læseramme som sCRl, uden afbrydelse af translationelle stopsignaler, i den genregion, hvor den ønskede, CR1-specifikke aktivitet kodes.

Desuden kan sCRl-genet muteres in vitro eller in vivo 5 til skabelse og/eller ødelæggelse af translations-, initierings- og/eller termineringssekvenser eller til skabelse af variationer i koderegioner og/eller dannelse af nye restrik-tionsendonucleasesteder eller ødelæggelse af i forvejen eksisterende steder for at lette yderligere modifikation 10 in vitro. Enhver teknik til mutagenese, som er kendt på området, kan anvendes, herunder, men ikke begrænset til, steddirigeret mutagenese in vitro (C. Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253, 6551) og anvendelse af "TAB®"-linkere (Pharmacia).

115 Manipuleringer af sCRl-sekvensen kan også foretages

på proteinniveauet. En vilkårlig af talrige kemiske modifi- I

kat ioner kan gennemføres ved hjælp af kendt teknik, herunder, men ikke begrænset til, f.eks. specfik kemisk spaltning ved hjælp af cyanogenbromid, trypsin, chymotrypsin, papain, V8-20 protease, NaBH4, acetylering, formylering, oxidation, reduktion og metabolisk syntese i nærværelse af tunicamycin.

Desuden kan analoge og peptider med relation til CRi syntetiseres kemisk. F.eks. kan et peptid svarende til en del af sCRI, som medierer den ønskede aktivitet (f.eks. C3b-25 og/eller C4b-binding, immunstimulering eller komplementregulering) , syntetiseres ved anvendelse af en DNA-syntetisa-tor.

Anvendelser af CRI.

30 Afprøvninger og diagnose.

CRI-proteiner, analoge, derivater og· undersekvenser ! deraf har anvendelser ved afprøvninger og i diagnostika. De j molekyler ifølge opfindelsen, som udviser den ønskede CRI- ! egenskab eller -funktion, kan anvendes til afprøvning af en 35 sådan egenskab eller funktion. P.eks. kan sCRl-proteiner eller fragmenter deraf, som udviser binding af C3b og/eller

I DK 175699 B1 I

C4b, i frie og/eller i komplekse former, anvendes ved af- "I

prøvninger til måling af mængden af sådanne stoffer i en I

prøve, f.eks. et legemsfluidum fra en patient. I

Ved en specifik udførelsesform kan sCRl eller en I

5 sCRl-udeladelsesmutant eksprimeret på celleoverfladen (f.eks. I

de i nedenstående afsnit beskrevne), som har evnen til at I

binde C3b (se f.eks. tabel II, nedenstående afsnit 9), iC3b I

eller C4b (se f.eks. tabel II), anvendes ved afprøvninger I

til måling af niveauerne af hhv. C3b, iC3b eller C4b i en I

10 prøve. Ved en anden udførelsesform kan der anvendes et sCRl- I

protein eller et fragment deraf, som er konstrueret ved I

rekombinant-DNA-teknologi, således at det mangler en trans- I

membransekvens og derfor udskilles. I

Ved en speciel udførelsesform kan der fæstes lid til I

15 en sådan måling af C3b og/eller C4b som et tegn på komple- I

mentaktivitet, og den kan være værdifuld ved diagnosen af I

betændelses- og immunsystemsygdomme. Sådanne sygdomme omfat- I

ter, men er ikke begrænset til vævsskader på grund af trauma I

fremkaldt af forbrænding eller myocardial infarct, respirato- I

2 0 risk nødsyndrom hos voksne (choklunge), autoimmunsygdomme, - . I

såsom rheumatoid arthritis, systemisk lupus erythematosus, I

og andre sygdomme eller sygdomstilstande, som involverer ; I

uønskelig eller uhensigtsmæssig komplementaktivitet (se I

f.eks. P.A. Miescher og H.J. Muller-Eberhard, udg., 1976, I

25 Text Book of Immunopathology, 2. udg., bind I og II, Grune I

and Stratton, New York; A.L. Sandberg, 1981, i Cellular I

Functions in Immunity and Inflammation, J.J. Oppenheim et I

al., udg., Elsevier/North Holland, New York, side 373; R.B. I

Conrow et al., 1980, J. Med. Chem. 23, 242; J.F. Regal og I

30 R.H. Pickering, 1983, Int. J. Immunopharmacol. 5, 71; H.S. I

Jacobs, 1980, Arch. Pathol. Lab. Med. 104, 617). I

CR1-proteinet og fragmenter deraf indeholdende en I

epitop har anvendelser ved afprøvninger, herunder, men ikke I

begrænset til immunoafprøvninger. De immunoafprøvninger, I

35 som kan anvendes, omfatter, men er ikke begrænset til konkur- I

rerende og ikke-konkurrerende afprøvningssystemer ved anven- I

DK 175699 B1 I

I33 I

delse af sådanne teknikformer som radioimmunoafprøvninger,

ELISA (enzymbundet immunosorbentafprøvning), "sandwich"- I

immunoafprøvninger, præcipitinreaktioner, geldiffusionspræci- I

pitinreaktioner, immunodiffusionsafprøvninger, agglutine- I

5 ringsafprøvninger, komplementfikseringsafprøvninger, im- I

munoradiometriske afprøvninger, fluorescensimmunoafprøvnin- I

ger, protein-A-immunoafprøvninger og immunoelektrophoreseaf- I

prøvninger, for blot at nævne nogle få. I

sCRl-gener og beslægtede nucleinsyresekvenser og I

10 -undersekvenser kan anvendes ved hybridiseringsafprøvninger. I

Sådanne hybridiseringsafprøvninger kan anvendes til overvåg- I

ning af betændelses- eller immunreaktioner forbundet med i I

CR1-ekspression til diagnose af visse sygdomstilstande, som I

er forbundet med ændringer i CR1-ekspression, til bestemmelse I

15 af CRl-allotypen hos en patient og til påvisning af tilstede- I

værelsen og/eller ekspressionen af CR1-genet og beslægtede I

gener (f.eks. CR2). I

Terapi. I

20 sCRl-proteinet og fragmenter, derivater og analoge I

deraf kan være terapeutisk værdifulde ved moduleringen af I

funktioner, som medieres af CR1. Sådanne funktioner omfatter, I

men er ikke begrænset til f.eks. binding af C3b og/eller C4b, i fri eller kompleks form, fremme af phagocytose, kom-25 piementregulering og immunstimulering. Effektive doser af CR1-proteinerne og beslætede molekyler ifølge opfindelsen har terapeutisk værdi for mange af de sygdomme eller sygdomstilstande, som er forbundet med sådanne funktioner, såsom immun- eller betændelsessygdomme (f.eks. dem, som er 30 beskrevet ovenfor i afsnit 5.6.1). F.eks. kan sCRl eller fragmenter deraf og beslægtede molekyler, som udviser den ønskede aktivitet, have terapeutiske anvendelser ved in-hiberingen af komplement ved hjælp af deres evne til at virke som cofaktor for faktor I, fremme den irreversible 35 inaktivering af komplementkomponenterne C3b eller C4b (D.T.

Fearon, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 5867; K.

I I DK 175699 B1 ; I

I I

Iida og V. Nussenzweig, 1981, J. Exp. Med. 153, 1138) og/- I

H eller ved hjælp af evnen til inhibering af de alternative I

eller klassiske C3- eller C5-konvertaser. N I

H Ved en specifik udførelsesform for opfindelsen kan I

H 5 der konstrueres en ekspressionsvektor til podning af et I

H CR1-molekyle, som mangler transmembranregionen (f.eks. ved I

H udeladelse af carboxyterminalen til argininet, som kodes af I

H den mest C-terminale SCR), hvilket resulterer i produktionen I

H af et opløseligt CRl-fragment. Ved en udførelsesform kan et I

H 10 sådant fragment bibeholde evnen til binding af C3b og/eller I

C4b, i fri eller i kompleks form. Ved en særlig udførelses- I

H form kan et sådant opløseligt sCRl-protein ikke mere udvise I

cofaktoraktivitet for faktor I. Det opløselige CR1-produkt I

kan indgives in vivo til en patient, således at den opløse- I

15 lige CR1 effektivt kan udkonkurrere bindingen af C3b og/eller I

C4b til den native celleoverflade CR1, hvorved celleoverflade I

CR1-cofaktoraktivitet for faktor I blokeres, og komplement- I

aktiviteten forøges. I

Efter at C3b er blevet covalent knyttet til partikler I

20 og opløselige immunkomplekser, har inaktiveringen af C3 ved I

proteolytisk behandling til iC3b og C3dg to biologiske kon- I

sekvenser: for kraftig aktivering af komplementsysternet via I

I forstærkningsvejen forhindres, og dannelsen af ligander, I

H kan kan engagere andre receptorer end CR1, forhindres. iC3b I

25 -fragmentet kan ikke binde faktor B, således at omdannelse I

til denne tilstand blokerer yderligere komplementaktivering I

via forstærkningssløjfen i den alternative vej. iC3b kan I

imidlertid bindes af CR1 og CR3, de to komplementreceptorer, I

I som medierer phagocytose af myelomonocytiske celler. Derfor I

I 30. er den primære, biologiske konsekvens af omdannelse af C3b I

I til iC3b ophør af komplementaktivering uden indgreb i CR1- I

og CR3-medieret clearance af det C3-overtrukne kompleks. I I

I modsætning hertil skaber den yderligere omdannelse af iC3b I

I til C3dg et fragment, som kun vekselvirker med CR2 og ikke I

I 35 med CR1 og CR3 . Denne omstændighed begrænser komplementafhæn- I

I gig binding af det C3dg-bærende kompleks til celletyper, I

I DK 175699 B1 : I

H

som eksprimerer CR2, hvilket omfatter B-lymphocyter, fol- I

liculære, dendritiske celler og måske epithelceller i huden, I

og nedsætter eller udelukker vekselvirkning med phagocytiske I

i- celletyper. Den biologiske konsekvens af dette ændrede mon- I

5 ster for celleassociering ville være målretning af de C3dg- I

-bærende komplekser til celler, som er involveret i den I

tilførende fase af immunreaktionen, snarere end til celler, I

I som er involveret i clearance og nedbrydning af partikler I

! og komplekser. Derfor kan CR1-molekyler anvendes terapeutisk I

10 ikke alene til påvirkning af clearanceprocessen, men også I

ved målretningen af komplekser til de CR2-bærende celletyper, I

som deltager i antigenpræsentation og antistofproduktion. I

Ved en alternativ udførelsesform kan et sCRl-protein I

\ eller et fragment deraf, som kan binde C3b eller C4b, og/- I

15 eller bibeholder evnen til inhibering af de alternative I

eller klassiske C3- eller C5-konvertaser, eller som bibehol- I

der cofaktoraktivitet for faktor I, anvendes til fremme af I

I komplementinaktivering. Ved en sådan ud føre Ise s form kan I

j CR1-proteinet eller fragmentet være værdifuldt ved behandling I

1 20 af sygdomstilstande, som indebærer uønskelig eller uhen- I

sigtsmæssig komplementaktivitet (f.eks. choklunge, vævsska- I

der på grund af forbrænding eller iskæmiske hjertetilstande, I

autoimmune sygdomme eller betændelsestilstande).

Ved en specifik udførelsesform, som er detaljeret 25 beskrevet i nedenstående afsnit, kan der eksprimeres et opløseligt CRl-molekyle, som bibeholder en ønsket, funktionel aktivitet, f.eks. som vist ved evnen til inhibering af klassisk, komplementmedieret hæmolyse, klassisk C5a-pro-duktion, klassisk C3a-produktion eller neutrophilt, oxidativt 30 udbrud in vitro. Ved en speciel udførelsesform kan et sådant opløseligt sCRl-molekyle f.eks. anvendes til nedsættelse af betændelse og dens skadelige virkninger eller til formindskelse af størrelsen af myocardial infarct eller forhindring af reperfusionsskader. Sådanne sCRl-molekyler, som er an-35 vendelige til terapi in vivo, kan afprøves ved forskellige modelsystemer, som er kendt på området, herunder, men ikke I DK 175699 B1

Η I

begrænset til den omvendte, passive Arthrus-reaktion (se I

senere afsnit) og en rottemodel af myocardial infarct (se I

senere afsnit). I

Ved en anden udførelsesform for opfindelsen kan et I

5 fragment af sCRl eller en analog eller et derivat deraf, for I

hvilket det er vist, at det inhiberer en ønsket CR1-egenskab i I

eller -funktion, anvendes til forhindring eller behandling I

af sygdomme eller sygdomstilstande forbundet med denne funk- I

H tion. I

H 10 Forskellige afleveringssystemer er kendte og kan I

H anvendes til· aflevering af sCRl og beslægtede molekyler, I

H f.eks. indkapsling i liposomer eller ekspression ved hjælp I

H af hæmatopoietisk stamcelleafkom ved genterapi. Andre metoder j I

H til indføring omfatter, men er ikke begrænset til intrader- I

15 male, intramuskulære, intraperitoneale, intravenøse, subcu- I

tane, intranasale og orale veje. I

Eksempel: Kloning og sekvensering af den humane C3b/C4b- I

receptor (CR1). I

20 I de følgende, detaljerede eksempler er der beskrevet I

kloningen og nucleotidsekvensen af 5,5 kilobasepar (kb) af I

CRl-koderegionen (L.B. Klickstein et al., 1987, J. Exp. Med. I

I 165, 1095-1112). I

I Ti overlappende CRl-cDNA-kloner, som spænder over I

’ 25 5,5 kb, isoleres fra et tonsilbibliotek og sekvenseres helt I

eller delvist. En enkelt, lang, åben læseramme, som begynder I

ved 5'-enden af klonerne, og som strækker sig 4,7 kb med I

I strømmen til en stopcodon, er blevet identificeret. Denne I

I sekvens repræsenterer ca. 80% af kodesekvensen for F-al- I

30 lotypen af CR1 på anslået 6 kb. Tre direkte, lange, homologe I

I tandemgentagelser (LHR'er) på 450 aminosyrer er blevet iden- I

I tificeret. Analyse af sekvenserne i tryptiske peptider har I

I givet bevis for en fjerde LHR i F-allotypen i CR1. Aminosyre- j I

I identiteten mellem disse LHR'er varierer fra 70% mellem den I

I 35 første og den tredie gentagelse til 99% mellem de 250 NH2- I

I -terminale aminosyrer i den første og den anden gentagelse. I

DK 175699 B1 I

I Hver LHR omfatter 7 korte, samstemmende gentagelser (SCR1er) I

på 60-70 aminosyrer, som ligner SCR'er i andre C3/C4-bindende I

proteiner, såsom komplementreceptor af type 2, faktorer B I

og H, C4-bindende protein og C2 . To yderligere SCR'er satrroen- I

5 knytter disse LHR'er til et enkelt domæne på 25 aminosyrer, I

som spænder over membranen, og derfor indeholder F-allotypen I

i CR1 sandsynligvis mindst 30 SCR1er, hvoraf 23 er blevet I

sekvenseret. Hver SCR forudsiges at danne en tredobbelt I

sløjfestruktur, hvori de fire bevarede halvcystiner danner I

10 disulfidbindinger. Den lineære afbildning af 30 SCR'er som I

halvfast struktur ville strække sig 1140 Ångstrøm ud fra I

plåsmamembranen og kunne lette vekselvirkningen af CR1 med I

C3b og C4b placeret inden i mellemrummene i immunkomplekser I

og mikroorganismecellevægge. Det COOH-terminale, cytoplasmi- I

15 ske domæne på 43 rester indeholder en sekvens på seks amino- I

syrer, som er homolog til sekvensen i den epidermale vækst- I

faktorreceptor, som phosphoryleres af proteinkinase C. I

Materialer og metoder. I

20 Isolering oa sekvens i trvptiske CR1-peptider. I

CR1 renses fra vaskede, humane erythrocytmembraner I

ved sekventiel "Matrex Red A"- og "YZ-l"-monoklonal anti- I

stofaffinitetschromatografi (W.W. Wong et al., 1985 J. Im- I

munol. Methods 82, 303). Tryptiske peptider fremstilles og I

25 isoleres ved sekventiel gradient-HPLC og isokratisk HPLC

med omvendt fase (væskechromatografi med høj ydeevne) som beskrevet (W.W. Wong et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 82, 7711). Tryptisk peptidanalyse gennemføres med en 470A proteinsekvensator (Applied Biosystems, Inc., Foster 30 City, CA) , og analyse af hver enkelt nedbrydningscyklus opnås ved anvendelse af en 120 PTH-aminosyreanalysator (Applied Biosystems, Inc.).

Isolering af cDNA-kloner og qenomkloner.

35 Et cDNA-bibliotek konstrueres i Xgtll ud fra human tonsil-poly (A)+-RNA som beskrevet (W.W. Wong et al., 1985, I* DK 175699 B1

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7711). Ved RNA-plethybri-disering er tonsildonoren homozyg for F-allelen i CR1 (id.). cDNA udvælges på en agarosegel, således at den omfatter fraktioner mellem 2 og 7 kb før kloningstrinnene. Begyndel-5 seskompleksiteten af biblioteket er 4,5 x 10® rekombinanter pr. 100 ng cDNA, og biblioteket forstærkes i Escherichia coli, stamme Y1088. Biblioteket screenes (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) med 10 CRl-sonder, CR1-1 (ATCC accessionsnummer 57330 (E. coli indeholdende CRl-1-plasmid), 57331 (renset CR1-1-DNA)) og CR1-2 (W.W. Wong et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

82, 7711), som er blevet radiomærket til en specifik ak- j tivitet på 2-8 x 108 cpm^g ved indskæringstranslation.

I 15 Hybridisering gennemføres i 50%'s formamid, 5x SSC (lx SSC:

i I

15 mM natriumcitrat, 150 mM natriumchlorid), ved 43°C, og filtrene vaskes ved 60°C i 0,2 x SSC, betingelser, som ikke tillader påvisningen af CR2-cDNA-kloner (J.J.Weis, et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643). Positive 20 kloner plaquerenses to gange før restriktionskortlægning og DNA-sekvensanalyse.

Et genombibliotek konstrueres i EMBL-3 med fragmenter på 15-20 kb produceret ved delvis digerering af human leuko-cyt-DNA med Sau3AI. Begyndelseskompleksiteten er 1,2 x 10®, 25 og biblioteket forstærkes i E. coli, stamme P2392. Biblioteket screenes også med cDNA-sonderne CR1-1 og CR1-2 (W.W.

Wong et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7711).

DNA-sekvensanalvse.

30 Restriktionsfragmenter af cDNA-klonerne underklones ind i M13mpl8 eller M13mpl9 og sekvenséres ved dideoxynucleo-tidkædeafslutningsmetoden (F. Sanger et al., 1977, Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463). Nogle kloner sekvenseres helt eller delvis, ved at der først skabes ordnede udeladel-35 sesmutanter ved anvendelse af exonuclease III (S. Henikoff, 1984, Gene 28, 351). Hver region sekvenseres på begge stren- 39 DK 175699 B1 i ge, og i de fleste tilfælde sekvenseres hver region på M13--underkloner konstrueret. ud fra to uafhængigt isolerede , cDNA-kloner (fig. 2). Sekvensdata analyseres med pakken fra

University of Wisconsin Genetics Computer Group (Madison, 5 WI). i i i

Resultater.

i Nucleotidsekvens i CRl-genet.

! Et størrelsesudvalgt tonsil-cDNA-bibliotek screenes 10 med CR1-1- og CR1-2-sonderne opnået fra CRl-cDNA-klonen . AT8.3 (W.W. Wong et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

i 82, 7711). Femten positive phager identificeres ud af 1,5 x 106 rekombinanter; og tretten af disse repræsenterer særegne I kloner. Ti er blevet restriktionskortlagt og sekvenseret 15 helt eller delvis ved dideoxynucleotidkædeafslutningsmetoden.

cDNA-klonerne er blevet afbildet på basis af en overlappende sekvensidentitet (fig. 2) og har vist sig at spænde over 5,5 kb (fig. 3). En enkelt, lang, åben læseramme, som begynder ved 5'-enden af klonerne, og som strækker sig 4,7 kb med i 20 strømmen til en stopcodon, er blevet identificeret. Kodese kvensen for CR1 i dette bibliotek forventes at være 6 kb, baseret på en anslået molekylvægt på 220.000 Dalton for den ikke-glycosylerede receptor (W.W. Wong et al., 1983, J.

Clin. invest. 72, 685). Derfor spænder disse kloner over 25 ca. 80% af den anslåede kodesekvens.

Kloner T49.1 og T55.1 indeholder kodesekvenser ved deres 5'-ender, hvilket antyder, at yderligere 5'-kodende og ikke-kodende sekvenser endnu mangler at blive identificeret. I 3'-regionen indeholder de overlappende kloner T8.2, 30 Ϊ43.1 og T87.1 transmembranregionen og den cytoplasmiske region kodet af en identisk sekvens i hver klon. Den klon, som strækker sig længst i retningen 3', T8.2, indeholder 807 bp ikke-translateret sekvens uden en poly(A)-sekvens.

Klon T8.3 indeholder en udeladelse på 91 bp af nucleotiderne 35 1406-1497, og klonen T40.1 indeholder en udeladelse på 9 bp af nucleotiderne 1498 til 1507 i forhold til de sekvenser,

I DK 175699 B1 I

I

H som findes i klonerne T6.1 og T55.1. Disse udeladelser fore- : I

kommer i regioner med sekvenser, som er homologe til 5'- I

H splejsningssteder og kan eventuelt repræsentere splejsnings- \ I

H fejl i mRNA. Klonerne T49.1 og T55.1 indeholder en indsætning j I

5 på 110 bp mellem nucleotiderne 147 og 148 i den åbne læseram- ! I

H me (fig. 3).. Denne sekvens bedømmes til at være en del af I

en intron, fordi den ikke hybridiserer til pletter af tonsil- I

H -poly(A)+-RNA, den indeholder et 5'-splejsningssted (R. I

Breathnach et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, I

10 4853) (fig. 3), den er flankeret af cDNA-sekvenser i CR1- I

-genomkloner, og den skifter læserammen. Klon T9.4 indeholder ! I

ved 3’-enden 0,88 kb af en intervenerende sekvens, som ikke : I

hybridiserer til pletter af tonsil-poly(A)+-RNA. ; I

H 15 Analyse af nucleotid- og aminbsvresekvensen i CR1. I

Pletmatriksanalyse af nucleotidsekvensen i CR1 (fig. I

3) har afsløret to typer af interne homologier (fig. 4). I

Den første type af intern homologi er repræsenteret ved de I

I kraftige, ubrudte linier, som angiver tilstedeværelsen af I

20 tre direkte, yderst homologe tandemgentagelser på 1,35 kb. I

Disse nucleotidsekvenser koder de lange, homologe gentagelser I

I (LHR'er) i CR1. Den anden type gentagelse er repræsenteret I

ved de brudte, parallelle linier, som angiver regioner med I

I mindre homologi. Disse sekvenser optræder for hver 190-210 I

I 25 nucleotider og koder de korte, samstemmende gentagelser I

I (SCR1er) i CR1. I

I Den aminosyresekvens, som afledes ud fra cDNA-sekven- I

I sen, er vist i fig. 5, og de tre LHR'er betegnet LHR-B, I

I LHR-C og LHR-D er afbildet for at vise deres homologi. LHR- I

I 30 B strækker sig fra rest 1 til rest 438, LHR-C svarer til I

I resterne 43 9-891, og LHR-D strækker sig fra rest 892 til I

I 1341. Resterne 451-694 i LHR-C er 99% identiske med resterne I

I 1-244 i LHR-3, men kun 61% identiske med de tilsvarende I

I rester i LHR-D. I modsætning hertil er resterne 695-891 i I

I 35 LHR-C 91% identiske med resterne 1148-1341 i LHR-D, men kun I

I 76% identiske til den tilsvarende region i LHR-B. Derfor I

41 I

DK 175699 B1 I

ser LHR-C ud til at være et hybrid, som omfatter sekvenser, . I

som er mest homologe til den første halvdel af LHR-B og til I

Iden anden halvdel af LHR-D. Disse LHR'er efterfølges af to I

·. SCR'er, som ikke gentages, et hydrofobt segment på 25 rester I

5 og en COOH-terminal region på 43 aminosyrer uden nogen se- I

kvenshomologi til SCR'er (fig. 5). I

CR1-kodesekvensen på 1,3 kb placeret 5' repræsenterer I

en fjerde LHR, LHR-A (se fig. 1 og nedenstående afsnit 7) . I

' Denne konklusion er blevet understøttet af analyse af tryp- I

10 tiske peptider i erythrocyt-CRl. Ti tryptiske peptider har I

sekvenser, som er identiske med de aminosyresekvenser, som I

afledes ud fra cDNA-klonerne (tabel I). I

I DK 175699 B1

Η 42 I

Η I Tabel I I

Tryptiske CRl-peptider fundet i den.afledte aminosyresekvens* I

H 5 I

Peptid Aminosyresekvens Restnumre i den I

nummer afledte sekvens I

10 66 VDFVCDEGFQLKGS-A 330-345’ I

28 GAASL----QG-WSPEAP 732-749, 1,185- I

1,202 I

49 ............IFC-NP-AIL 805-826, 1,258- I

15 1,279 I

35 CQALNKWEPELPSCSR 228-243, 678-693 I

41c DKDNFS PGQEVFY S CE PGYDLR 260-281 I

20 I

34b AV-YTCDPHPDRGTSFDLIGESTIR 393-417 I

44d VCQPPPEILHG 694-704, 1,147- I

1,157 I

25 I

54d VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ 152-179, 602-629 I

57b YECRPEYYGRPFS 19-31, 469-481 I

I 30 39b LIGHSSAECILSGNAA 85-100 I

* Tryptiske peptider fra human erythrocyt-CRl fundet i den I

afledte aminosyresekvens. Nummerintervallerne i kolonnen til I

i højre angiver placeringen af peptidet i den afledte aminosy- I

35 resekvens. Hver.enkelt streg i peptiderne 66, 28 og 49 an- I

giver, at multiple rester er blevet identificeret ved denne I

cyklus. Stregen i peptid 34b angiver, at der i denne cyklus I

I ikke er identificeret nogen rest. I

DK 175699 B1 I

43 I

Hver LHR omfatter syv SCR'er på 60-70 aminosyrer, I

som karakteriserer familien C3- og C4-bindende proteiner I

(C4 bp) (fig. 6A) . Maksimal homologi mellem de 23 SCR'er i I

CRl er iagttaget ved indføring af mellemrum i afbildningen I

5 af sekvenserne (fig. 6A). Alt i alt er 29 af de gennemsnit- I

ligt 65 rester i hver gentagelse bevaret. Der er seks rester, I

som er til stede i alle SCR'er: de fire halvcystiner, som I

I er i tilsvarende, relative stillinger, hvilket antyder, at I

de hver især kan være involveret i en kritisk disulfidbin- I

10 ding, og tryptophanet og det andet glycin efter det andet I

halvcystin (fig. 6A) . Sekundær strukturanalyse af sekvenserne I

mellem de ikke-varierende halvcystiner ved anvendelse af I

algoritmen ifølge Chou og Fasman (P. Chou og G. Fasman, 1974, I

Biochemistry 13, 222) har forudsagt høj sandsynlighed for I

15 dannelse af β-drejning og lav sandsynlighed for dannelse af I

α-spiral. Sekvensanalyse af to CRl-genomkloner, 2.38 (fig. I

6B) og 2.46, viser, at SCR-14 (fig. 6A) kodes af en enkelt I

exon, og at COOH-terminus i SCR-23 svarer til enden af en I

exon. Derfor kan SCR'er i CRl eventuelt kodes af separate I

20 , exoner, således som det er blevet vist for SCR'er i faktor I

B (R.D. Campbell og D.R. Bentley, 1985, Immunol. Rev. 87, I

19) og i IL-2-R (W.J. Leonard et al., 1985, Science 230, I

Den samstemmende sekvens i CRl-SCR'er er blevet sam- I

.25 menlignet med SCR'er i de andre medlemmer af den superfami- I

lie, som har denne karakteristiske struktur (fig. 7). Disse I

medlemmer omfatter ikke alene proteiner med C3/C4-bindings-funktion, CR2 (J.J. Weis, et al., 1986, Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 83, 5639-5643), C4bp (L.P. Chung et al., 1985, 30 Biochem. J. 230, 133), faktor Η (T. Kristensen et al., 1986, J. Immunol. 136, 3407), faktor B (B.J. Morley og R.D.Campbell, 1984, EMBO J. 3, 153); J. E. Mole et al., 1984, J.

Biol. Chem. 259, 3407), og C2 (D.R. Bentley og R.R. Porter, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1212; J. Gagnon, 35 1984, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 306, 301), men også de proteiner, som ikke vides at have denne funktion, I DK 175699 B1 44 l | såsom interleukin-2-receptoren (W.J. Leonard et al., 1985,

Science 230, 633), -glycoprotein I (J. Lozier et al., 1984, Proc. Natl. , Acad. Sci. U.S.A. 81, 3640), Clr (S.P.'

Leytus et al., 1986, Biochemistry 25, 4855), haptoglobin-α- | 5 -kæde (A. Kurosky et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

77, 3388) og faktor XHIb (A. Ichinose et al., 1986, Biochemistry 25, 4633). Halvcystinresterne er ikke-variable i SCR'er i alle proteiner, bortset fra haptoglobin, som mangler i det tredie halvcystin. Tryptophanet er også ikke-variabelt 10 med undtagelse af den femte SCR i &2-glycoprotein I og to af gentagelserne i faktor xilib. Andre rester, som er bevaret, men ikke til stede i hver enkelt SCR, har tilbøjelighed til at danne klynger omkring halvcystinerne. Der er kun én fri thiolgruppe i faktor B og C2 (D.L. Christie og J. Gagnon, 15 1982, Biochem. J. 201, 555; C. Parkes et al., 1983, Biochem. j J. 213, 201), og i SCR'er i S2“91ycoProte;*-n 1 er det første halvcystin disulfidbundet til det tredie og det andet til det fjerde (J. Lozier et al., 1984, Proc. Natl., Acad. Sci.

U.S.A. 81, 3640).

,20 I den afledte aminosyresekvens i CR1 er der sytten potentielle steder for N-bundne oligosaccharider, og de er alle i den ekstracellulære region (fig. 6A) . Molekylvægtforskelle mellem CRl syntetiseret i nærvær og fravær af tunica-mycin (D.M. Lublin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261, 5736) 25 og analyse af glucosaminindholdet (R.B. Sim, 1985, Biochem.

J. 232, 883) antyder tilstedeværelsen af kun 6-8 N-bundne, komplekse oligosaccharider, hvilket viser, at ikke alle potentielle steder er anvendt. F.eks. er asparaginet ved rest 263 i den afledte aminosyresekvens (fig. 5) blevet 30 identificeret i peptid 41c (tabel I), hvilket viser fravær af glycosylering på dette sted. I modsætning hertil svarer den uidentificerede aminosyre i peptid 34b sandsynligvis til et glycosyleret asparagin ved rest 395.

De eneste, ikke-gentagne CRl-sekvenser, som er identi-35 ficeret i cDNA på 5,5 kb, er placeret i den COOH-terminale region. En sekundær strukturanalyse af denne region har

45 . I

DK 175699 B1 I

identificeret et enkelt segment på 25 rester, som formodent- I

lig spænder over membranen, og som har stærk hydrofob karak- I

ter og et højt potentiale for ar-spiral dannelse (fig. 5) . I

Denne sekvens efterfølges øjeblikkeligt af fire positivt I

5 ladede rester, et karakteristikum for mange membranproteiner. I

Den formodet cytoplasmiske region i CR1 omfatter 43 rester I

og indeholder en sekvens på 6 aminosyrer, VHPRTL, som er I

homolog til sekvensen VRKRTL, et sted for phosphorylering I

af proteinkinase C i den epidermale vaekstfaktorreceptor . I

10 {EGF) og det oncogene erbB-produkt (T. Hunter et al., 1984, I

Nature 311, 480; R.J. Davis og M.P. Czech, 1985, Proc. Natl. I

Acad. Sci. U.S.A. 82, 1974). Der er ingen tyrosinrester i I

Iden cytoplasmiske region i tonsil-CRl.’ I

15 Diskussion. I

Ca. 80% af den primære struktur af F-allotypen af I

CR1 er blevet opnået ved sekvensering af overlappende cDNA- I

kloner. Det mest usædvanlige strukturtræk ved CR1, som er I

iagttaget ved denne analyse, er tilstedeværelsen af direkte I

20 tandem-LHR'er på 450 aminosyrer, hvoraf fire forudsiges at I

forekomme i den F-allotype af CR1, som har en anslået poly- I

peptidkædelængde på 2000 rester (W.W. Wong et al., 1983, J. I

Clin. Invest. 72, 685; R.B. Sim, . 1985, Biochem. J. 232, I

883) . Tre af disse LHR'er er blevet klonet og· sekvenseret, 25 medens bevis for eksistensen af den fjerde er tilvejebragt ved analysen af tryptiske peptider. Hver LHR udgøres af syv SCR'er, som er de grundlæggende .strukturelementer i andre C3/C4-bindende proteiner. Bevarelsen af de fire halvcystiner pr. SCR, den sandsynlige involvering af første og tredie 30 samt andet og fjerde halvcystin i disulfidbindinger (J.

Lozier et al., 1984, Proc. Natl., Acad, Sci. U.S.A. 81, ! 3640) og tilstedeværelsen af bevarede aminosyrer, såsom prolin, glycin og asparagin, som hyppigt findes i S-snoninger (G.D. Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37, l) fører 35 til det forslag, at en SCR danner en tredobbelt sløjfestruktur opretholdt ved hjælp af disulfidbindinger {fig. 8).

H DK 175699 B1 ^R Denne rolle for halvcystinresterne understøttes af den erken- ^R delse, at mildt trypsinbehandlet CR1 (R.B. Sim, 1985, Bio- ^R chem. J. 232, 883) og faktor H (R.B. Sim og R.G. DiScipio, .1982, Biochem. J. 205, 258) vandrer som intakte molekyler, 5 når de analyseres ved SDS-polyacrylamid-gelelektrophorese ^R (PAGE) under ikke-reducerende betingelser og som flere tryp- ^R tiske fragmenter efter reduktion.

II Det er forudsagt, at denne række dobbeltgentagne ^R SCR'er danner en aflang struktur (fig. 8) , således som det ^R 10 er blevet foreslået for faktor H og for hver underenhed i ^R humant C4bp (R.B. Sim og R.G. DiScipio, 1982, Biochem. J.

205, 258; K. Whaley og S. Ruddy, 1976, J. Exp. Med. 144, 1I 1147; B. Dahlback et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

H 80, 3461) . Elektronmikroskopiske studier af underenhederne I

H 15 i C4bp har vist dimensioner på 300 x 30 Angstrom (B. Dahlback et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 3461). Da

H hver underenhed er sammensat af otte SCR'er (L.P. Chung et I

al., 1985, Biochem. J. 230, 133), beregnes en individuel I

SCR til at være 38 x 30 Angstrom. Idet det antages, at SCR'er H 20 i CR1 har tilsvarende dimensioner, og at F-allotypen har 30 H SCR'er, kunne receptoren strække sig så meget som 1140 Ång-

H strom ud fra cellemembranen. I overensstemmelse med denne I

H forudsigelse af CR1-strukturen er den tidligere erkendelse, I

at ferritinmærket antistof bundet til CR1 på neutrophiler I

25 hyppigt er 500 Angstrom fra det ydre blad af plasmamembranen I

(D.R. Abrahamson og D.T. Fearon, 1983, Lab. Invest. 48, I 162) . En sådan aflang struktur af CR1 ville lette veksel-

virkningen mellem receptorbærende celler med C3b, som er 1 I

covalent bundet til relativt utilgængelige steder inden i I

R 30 immunkomplekser og mikroorganismecelleoverflader. I

I Den erkendelse, at SCR er det vigtigste, og måske I

R det eneste, ekstracytoplasmiske element i CR1 tilvejebringer I

I strukturbevis for et tæt slægtsskab mellem receptoren og I

I faktor H og C4bp, to plasmaproteiner, som udelukkende eller I

I 35 overvejende er sammensat af SCR'er (L.P. Chung et al., 1985, I

Biochem. J. 230, 133; T. Kristensen et al., 1986, J. Immunol. I

i DK 175699 B1 47 136, 3407) . CR1 er til at begynde med blevet isoleret som et erythrocytmembranprotein med faktor H-agtig aktivitet efter detergentopløseliggørelse (D.T. Fearon, 1979, Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 5867), og det viste sig senere 5 at have de regulerende funktioner i faktor H og C4bp, når det sidder på plasmamembranen (K. Iida og V. Nussenzweig, 1981, J. Exp. Med. 153, 1138) . Ved analyse af den iboende strukturpolymorphi hos CR1, faktor H og C4bp har det vist sig, at de gener, som koder disse tre proteiner, er linket 10 (R. de Cordoba et al., 1985, J. Exp. Med. 161, 1189), og det er fornylig ved hybridisering in situ og ved analysen af somatiske cellehybrider blevet vist, at stedet for denne bindingsgruppe og for den strukturelt beslægtede receptor CR2 er på den lange arm i chromosom 1, bånd q32 (J.H. Weis 15 et al., 1987, J. Immunol. 138, 312). Før nærværende studiu-m har det eneste bevis for et strukturslægtskab mellem disse ' proteiner været en signifikant lighed i deres aminosyresam- mensætninger (W.W. Wong et al., 1985, J. Immunol. Methods I 82, 303). Derfor udgør den her omhandlede erkendelse af j 20 mindst 23 SCR'er i CRi den direkte og formelle påvisning af ! strukturslægtskab af receptoren med faktor H og C4bp (L.P.

Chung et al., 1985, Biochem. J. 230, 133; T. Kristensen et al., 1986, J. Immunol. 136, 3407), proteiner med tilsvarende funktioner, og med Ba- og C2b-framgenterne i faktor B og C2 .

25 (B.J. Morley og R.D.Campbell, 1984, EMBO J. 3, 153; J. E.

Mole et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 3407), og C2 (D.R.

Bentley og R.R. Porter, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

81, 1212; J. Gagnon, 1984,. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B

Biol. Sci. 306, 301), komponenter som danner enzymatiske 30 komplekser med hhv. C3b og C4b. SCR findes imidlertid også i adskillige ikke-komplementproteiner (R.D. Campbell og D.R. Bentley 1985, Immunol. Rev. 87, 19; J. Lozier et al., 1984, Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A. 81, 3640; S.P. Leytus et al., 1986, Biochemistry 25, 4855; A. Kurosky et al., 35 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 3388; A. Ichinose et al., 1986, Biochemistry 25, 4633) (fig. 7), hvilket viser,

I DK 175699 B1 I

I i

H at de ikke nødvendigvis repræsenterer en C3/C4-bindingsstruk- I

tur. I

H Blandt de proteiner, som har SCR'er, er CR1 særegent I

ved at have denne grundlæggende struktur og genetiske enhed I

5 organiseret i strukturenheden LHR af højere orden. Analyse I

af et BamHI-fragment på 14,5 kb fra genom-DNA, som er forbun- I

det med ekspression af S-allotypen, har antydet, at mindst I

én gentaget genomenhed i CR1 er et forlænget segment af DNA . I

indeholdende de exoner, som koder mindst fem SCR'er og deres I

I 10 flankerende introner (W.W. Wong et al., 1986, J. Exp. Med. I

164, 1531). Disse studier har også antydet, at S-allelen I

indeholder en yderligere kopi af denne genomenhed sammenlig- I

net med det antal, som er til stede i F-allelen. Denne iagt- I

tagelse tillader kombineret med et tryptisk peptidkortlæg- I

I 15 ningsstudium (M.W. Nickells et al., 1986, Mol. Immunol. 23, I

661) og den her omhandlede erkendelse, at en LHR repræsente- I

rer et peptid på ca. 40-50 kD at forudsige tilstedeværelsen I

i S-allotypen (290 kD) af en yderligere LHR i forhold til I

anslået fire LHR'er i F-allotypen (molekylvægt 250.000 dal- I

I 20 ton). I

Foruden at tilvejebringe bevis for duplikeringsbegi- I

I venheder antyder sekvenserne i LHR'er også, at omdannelses- I

I begivenheder er sket inden i CRl-genet. LHR-B og -D er 67% I

I identiske til hverandre over hele deres længde, medens LHR- H

25 -C er 99% identisk med LHR-B i de fire NH2-terminale SCR'er I

I og 91% identisk med LHR-D i de tre COOH-terminale SCR'er. H

I Denne organisation kunne ikke være indtrådt ved en enkelt I

I rekombinationsbegivenhed mellem identiske stamalleler i -

I oprindelsen til dette hybrid-LHR. Snarere kan dette hybrid- H

I 30 -LHR være opstået ved genomdannelse (M. Atchison og Μ. H

I Adesnik, 1986, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2300), ved I

I hvilken sekvenser i et LHR-C-forstadium er blevet erstattet I

I af sekvenser, som er til stede i LHR-B eller LHR-D. Den H

I næsten komplette identitet og præcise placering på linie af H

I 35 homologe sekvenser i disse LHR'er (fig. 5) kan eventuelt H

I også være blevet opretholdt ved hjælp af en mekanisme, som H

i DK 175699 B1 i involverer genomdannelse. Analyse af udstrækningen af homo-logi mellem intervenerende sekvenser af disse segmenter i CR1-genet, som koder disse LHR’er, burde fastslå, om genomdannelse eller udvælgelse baseret på funktionelle begrænsnin-5 ger har begrænset sekvensdivergensen strengt.

Selv om et tidligere studium har antydet, at CR1 er monovalent (J.G. Wilson et al., 1982, N. Engl. J. Med. 307, 981-986), kunne hver LHR eventuelt repræsentere et enkelt C3b/C4b-bindingsdomæne, hvilket ville gøre receptoren mono-10 valent og tilpasset til bindingen af komplekser, som bærer flere molekyler af C3b og C4b. Eventuelt kunne adskilte LHR’er eventuelt være ansvarlige for binding åf hhv. C3b og . .

C4b (se nedenstående afsnit 9), hvilket tilvejebringer en strukturbasis for kombinationen af faktor H- og C4bp-ak-15 tiviteter i CR1. Endelig kan LHR'er i CR1 eventuelt repræsentere strukturdomæner, som tjener til at strække CR1 ud fra plasmamembranen, som antydet ved den foreslåede strukturmodel (fig. 8), og SCR'er ved den NH2-terminale region binder C3b og C4b, således som det har vist sig for faktor H (R.B. Sim 20 og R.G. DiScipio, 1982, Biochem. J. 205, 258; J. Alsenz et al., 1984, Biochem. J. 224, 389).

Aktivering af proteinkinase C ved hjælp af phorboles-tere tilskynder phosphorylering af CR1 i neutrophiler, mono-cyter og eosinophiler (P. S. Changelian og D.T. Fearon, 1986, 25 J. Exp. Med. 163, 101), og det cytoplasmiske CRl-domæne på 43 aminosyrer har en sekvens, som er homolog til et sted, som phosphoryleres af proteinkinase C i den epidermale vækstfaktorreceptor (T. Hunter et al., 1984, Nature 311, 480; R.J. Davis og M.P. Czech, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

30 82, 1974). Denne cytoplasmiske sekvens, som er blevet fundet i tre uafhængige kloner fra tonsilbiblioteket, er imidlertid mest sandsynligt den fra B-celle-CRl, som ikke phosphoryleres efter aktivering af proteinkinase C (P.S. Changelian og D.T. Fearon,.1986, J. Exp. Med. 163, 101).

I DK 175699 B1 50

Eksempel: CR1-51-cDNA-sekvenser indeholder en fjerde, lang, homolog gentagelse.

Analyse af en delvis cDNA-sekvens i CR1 har afsløret en struktur, hvori tre LHR'er, LHR-B, LHR-C, LHR-D, på 450 5 aminosyrer hver især udgøres af 7 korte, samstemmende1 gentagelser (SCR) på 65 aminosyrer karakteristiske for C3/C4-bindingsproteiner (se ovenstående afsnit 6). I det foreliggende eksempel beskrives kloningen af og nucleotidsekvensen i en fjerde, aminoterminal LHR, LHR-A (L.B. Klickstein et 10 al., 1987, Complement 4:180) ved sekvenseringen af 5'-cDNA--kloner. Analyse af LHR-A har afsløret, at den er 99% homolog til LKR-B i de fem 3'-SCR'er, men kun 61% homolog i de to 5'-SCR'er.

15 Materialer og metoder.

Konstruktion af et cDNA-bibliotek.

Et selektivt primet cDNA-bibliotek, λHH, konstrueres ud fra 3 μg poly(A)+-RNA renset fra DMSO-tilskyndede celler som beskrevet (J.M. Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18, 20 5290; H. Aviv og P. Leder, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 69, 14 08,- F.M. Ausubel et al., 1987, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) med følgende modifikationer. LK35.1, et 35-mer oligonucleotid, 5'--TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG TGGGG-31, anvendes i stedet 2 5 for oligo (dT) ^2-18' °9 ^Ci α^Ρ-dCTP tilsættes under syntesen af den anden streng. En trediedel af denne cDNA klones ind i Xgtll, og et cDNA-bibliotek konstrueres ud fra human tonsil-poly(A)+-RNA som beskrevet i ovenstående afsnit 6.1.2. Der fås 750.000 uafhængige rekombinanter.

30

Isolering af kloner, sonder oa DNA-sekvensanalyse.

De sonder, som anvendes til screening af cDNA-biblio-teker er CR1-1 (W.W. Wong et al., 1985, Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 82, 7711) (ATCC accessionsnummer 57331), CR-2 3 5 (W.W. Wong et al., supra), CR1-4 (W.W. Wong et al., 1986, J. Exp. Med. 164, 1531) og CR1-18, et Sau3AI-fragment på

I DK 175699 B1 I

252 bp ud fra EcoRI-fragmentet på 0,5 kb af cDNA-klon XH3.1 j I

svarende til nucleotiderne i 101-352 i fig. 1. Under betin- I

gelser med høj strenghed hybridiserer CR1-18 kun til cDNA- I

kloner, som koder enten den NH2-terminale SCR i LHR-A eller I

5 signalpeptidet. Indsætningerne af cDNA-klonerne sekvenseres j I

ved dideoxynucleotidteknikken {F. Sanger et al., 1977, Proc. ! I

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463), efter at fragmenter er . I

underklonet ind i M13mpl8 og M13mpl9 (C. Yanisch-Perron et I

al., 1985, Gene 28, 351). I

Resultater. I

Et specifikt primet Xgtll-cDNA-bibliotek, XHH, som I

indeholder 7,5 x 105 rekomibinanter, præpareres med cDNA I

syntetiseret ud fra poly(A)+-RNA fra DMSO-tilskyndet HL-60- I

15 celler. Disse celler eksprimerer kun F-allotypen i CR1 (D.M. I

Lublin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261, 5736), som forud- I

siges at have fire LHR'er (M.A. Lapata et al., 1984, Nucl. I

Acids Res. 12, 5707). Primeren, LK35.1, er en antisense-35- I

-mer svarende til nucleotiderne 896-930 i den delvise cDNA- I

20 sekvens af CR1, som er vist i fig. 3. Det er blevet vist, I

at dette oligonucleotid hybridiserer til LHR-B, LHR-C og I

LHR-D under betingelserne for omvendt transkription. 250 positive kloner er blevet identificeret i en pletning af 3,8 x 105 ikke-forstærket rekombinantphag screenet med en 25 blanding af CR1-cDNA-sonderne CR1-1 og CR1-4. 38 positive kloner pilles ud og plaquerenses. Southern-pletter af EcoRI--digereret DNA fra disse kloner screenes med 23-mer oligonu-cleotidet KS23.1, 5'-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-31, svarende til nucleotiderne 763-785 i den delvise CR1-cDNA-sekvens i 30 fig. 3. Denne sonde hybridiserer under betingelser med høj strenghed ved et enkelt sted i den sekvens, som koder LHR-B, men ikke til sekvenser, som koder LHR-C eller LHR-D.

Indsætningen af klonen XH7.1 (fig. 9) indeholder 3 EcoRI-fragmenter på 1,0 kb, 0,9 kb og 0,4 kb, og de største frag-35 menter hybridiserer til KS23.1, hvilket viser, at denne klon indeholder sekvenser, som koder for 3'-5/7 i LHR-A og H DK 175699 B1

Η I

hele LHR-B. Denne erkendelse bekræfter, at LHR-A er yderst I

homolog til LHR-B. Klon XH3.1 {fig. 9) indeholder et enkelt I

KS23.1-positivt EcoRI-fragment på 1,0 kb og 5'-fragment på I

0,5 kb, som hybridiserer svagt med CR1-4 ved hej strenghed. I

5 Det antages, at denne klon indeholder den yderligere 5'- I

-sekvens, som kompletterer LHR-A, herunder SCR'er -1 og -2 I

H og 0,1 kb af sekvensen imod strømmen. Ingen af de tilbagevæ- I

H rende 36 kloner, som alle hybridiserer med CR1-1, er blevet I

H påvist med sonden CR1-18, et Sau3AI-fragment på 252 bp fra I

H 10 EcoRI-fragmentet på 0,5 kb i klon XH3.1, som ikke hybridise- I

H rer til sekvenser, som koder LHR-B, C eller D. I

DNA-sekvensanalyse af XH3.1 har afsløret, at den I

H åbne læseramme fortsætter til 5'-enden af cDNA, hvilket I

viser, at klonen ikke strækker sig til translationsstartste- I

15 det. Derfor er cDNA-bibliotekerne XHH og XS2T blevet screenet I

igen med sonden CR1-18 til identifikation af én klon fra I

hver, hhv. XH10.3 og XT109.1. De EcoRI-fragmenter i disse I

kloner, som hybridiserer med CR1-18, er blevet sekvenseret, I

og det samme er indsætningerne fra klonerne XH3.1 og XH7.1. I

20 Den sammensatte sekvens er vist i fig. 1, således at det I

nucleotid, som følger efter nr. 1531 i fig. 1, er nucleotidet I

nr. 1 i fig. 3. De overlappende sekvenser af cDNA-klonerne I

I fra HL-60- og tonsilbiblioteket er identiske. I

Umiddelbart imod strømmen i LHR-A indeholder klonerne I

I 25 XH10.3 og XT109.1 identiske, formodede, hydrofobe lederse- I

I kvenser {G. Von Heijne, 1986, Nucl. Acids Res. 14, 4683), I

I som koder 41 aminosyrer, herunder en ATG, som matcher den I

sammenhæng NNA/GNNATGG, som er foreslået for eukaryotiske I

I translationsinitieringssteder (fig. 10) (M. Kozak, 1986, I

I 30 Cell 44, 283) . En anden ATG, placeret seks codoner imod I

I strømmen fra den udvalgte ATG og netop med strømmen fra en I

I stopcodon i ramme, matcher dårligt til denne samstemmende I

I sekvens. De første .tre aminosyrer, i denne ledersekvens fra I

CR1, MGA, er de samme som dem, som er rapporteret for CR2. I

I 3 5 Sekvenserne i disse to kloner afviger imod strømmen i forhold I

I til ATG, og sekvensen fra klon XH10.3 antages at repræsentere I

i DK 175699 B1 i i i en del af en intervenerende sekvens, således som det er blevet beskrevet for andre CRl-cDNA-kloner i ovenstående afsnit 6.

Det er forudsagt (G. Von Heijne, 1986, Nucl. Acids 5 Res. 14, 4683), at signalpeptidasespaltningen sker mellem

glycin-46 og glutamin-47, hvilket antyder, at den blokerede NH2-terminus i CR1 (W.W. Wong et al., 1985 J. Immunol. Methods 82, 303, V.Μ. Holeis et al., 1986, Complement 3, 63) kan skyldes tilstedeværelsen af et pyrrolidonamid. De første 10 to SCR’er i den NH2-terminale LHR-A indeholdt i disse kloner er 61% identisk med den tilsvarende region i LHR-B, medens SCR'er 3-7 i LHR-A er 99% identiske med de tilsvarende SCR'er i LHR-B (fig. 10). Sammenligning af LHR-A med LHR-C afslører, I

at kun den tredie og den fjerde SCR i hver er yderst homolog 15 (99% identisk). LHR-A og -D har kun 68% total identitet med en maksimal identitet på 81% mellem sjette SCR i hver LHR. Fuldstændiggørelse af 5'-cDNA-sekvensen i CR1 viser derfor, at F-allotypen er sammensat af 2039 aminosyrer, herunder et signalpeptid på 41 aminosyrer, fire LHR'er på hver syv SCR'-20 er, to yderligere, COOH-terminale SCR'er, en transmembranregion på 25 rester og et cytoplasmisk domæne på 43 aminosyrer. Der er 25 potentielle, N-bundne glycosyleringssteder.

Diskussion.

25 Den primære struktur af NH2-terminus og signalpeptidet i F-allotypen af CR1 er blevet afledt ved isoleringen og sekvenseringen af 5'-cDNA-kloner. Den kraftigt gentagne natur af CR1-sekvensen har gjort udviklingen af en hensigtsmæssig strategi til præpareringen og identificeringen af 30 cDNA-kloner, som koder denne region af receptoren, kritisk.

Et cDNA-bibliotek er blevet fremstillet, ved at der som primer er anvendt et 35-mer oligonucleotid, som vides at hybridisere til LHR-B, -C og -D under betingelser for omvendt transkription, og den mulighed er blevet taget i be-35 tragtning, at denne primer eventuelt også kunne hybridisere til LHR-A, om hvilken det er blevet forudsagt, at den er H DK 175699 B1 yderst homolog til LHR-B (se ovenstående 6) . Hensigtsmæssige" ^R cDNA-kloner er blevet identificeret ved anvendelsen af et andet oligonucleotid, KS23.1, som kun hybridiserer til LHR- ^R -B under strenge betingelser, hvorved sandsynligheden for ^R 5 at finde 5'-cDNA-kloner forøges. Der er fundet to kloner, ^R som omfatter næsten hele den resterende sekvens i CR1, og ^R et Sau3AI-fragment af en af disse, CR1-18, har en sekvens, II som er tilstrækkelig særegen til at tillade dens anvendelse ^B ved identifikationen af de resterende 5'-kloner (fig. 9,10).

^B 10 En sonde på 250· bp fra 5'-regionen af LHR-A, CR1-18, ^R . hybridiserer ikke alene til CR1-transskriptioner på 7,9 og ^R 9,2 kb, men også til en transskription på 2 kb i huuman ^B tonsil-RI-JA under strenge betingelser. Denne krydshybridise- H rende mRNA iagttages ikke med CRl-cDNA-sonder fra andre }

15 LHR'er eller ved Northern-pletter af RNA fra dimethylsulf- I

H oxid-tilskyndede HL-60-celler og HSB-2-T-lymfoblastoidceller. I

H CR1 indeholder således sekvenser, som er homologe til to j H yderligere B-celleproteiner, et, som kodes af denne nyer- kendte mRNA, og CR2.

I 20 i H Eksempel: Ekspression af human rekombinant-CRl.

Som ovenfor beskrevet er der blevet isoleret humane CR1-cDNA-kloner, som spænder over 7,0 kb, og som indeholder en åben læseramme, som koder 2039 aminosyrer (fig. l). Den 25 foreslåede forstadiumform for receptoren indeholder et sig- I nalpeptid på 41 aminosyrer, fire lange, homologe gentagelser I (LHR'er) af 450 aminosyrer, idet hver LHR udgøres af syv I korte, samstemmende gentageler (SCR'er), to COOH-terminale I SCR’er på 65 aminosyrer, et transmembrandomæne på 25 amino- I 30 syrer og en cytoplasmisk region på 43 aminosyrer. CRl-F-al- I lotypen indeholder således 30 SCR'er. Den NH2-terminale R LHR, LHR-A (se ovenstående afsnit 7) , er 61% identisk med I den tilsvarende region i LHR-B i de to første SCR'er og 99% I identisk i de fem COOH-terminale SCR'er. Restriktionsfrag- I 35 menter af otte CRl-cDNA-kloner er blevet splejset til en I konstruktion af fuld længde på 6,9 kb og placeret med strøm- DK 175699 B1

I men i en musemetallothioneinpromotor eller en cytomegalovi- I

ruspromotor og transficeret ind i L-celler (tnus) eller COS- I

-celler (abe). Rekombinant-celleoverflade-CRl er blevet I

påvist ved indirekte radioimmunoafprøvning og immunofluor- I

5 escens. Intet antigen har kunnet påvises på celler, som kun I

^ er transficeret med stamvektoren (CR1“). Immunoudfældning I

af transficerede, overflade-125I-mærkede COS-celler (abe) I

ved hjælp af monoklonalt anti-CR1-antistof og’ analyse ved I

hjælp af ikke-reducerende natriumdodecylsulfat-polyacrylamid- I

10 gelelektroforese (SDS) har givet et bånd med en molekylvægt I

på 190.000 dalton, som vandrer sammen med F-allotypen fra I

humane erythrocyter. Ekspressionen af rekombinant-CRl-ant igen I

med den korrekte molekylvægt (L.B. Klickstein et al., 1988, I

FASEB J. 2, A1833) giver bevis for, at denne cDNA indeholder I

15 hele kodesekvensen i human CR1. I

Konstruktion af plasmidet pBSABCD, som indeholder hele I

CR1 - kodesekvensen._;_ I

Her er beskrevet konstruktionen af plasmid pBSABCD, I

20 en vektor, som koder CR1-proteinet af fuld længde (SCR1er I

Indsætningen på 2,3 kb fra cDNA-klonen λΤ8.2 (L.B. I

Klickstein et al., 1987, J. Exp. Med. 165, 1095; se oven- I

stående afsnit 6) er blevet underklonet ind i pUC18 som et I

25 EcoRI-fragment, således at 5’-enden støder op til Hindlll- I

-stedet i plasmidpolylinkeren. Dette plasmid betegnes pl88.2. I

pl88.2 opskæres med Apal og Hindlll, og det store fragment på 4,7 kb, som indeholder CRl-sekvensen fra SCR 26 gennem, den 3 ' -utranslaterede region plus vektorsekvenser, gelrenses.

30 Indsætningen fra cDNA-klon XT50.1 (L.B. Klickstein et al., 1987, J. Exp. Med. 165, 1095; se ovenstående afsnit 6) underklones som et EcoRI-fragment ind i M13mpl8. Denne phag kaldes 18R50.1. DNA fra den replikative form af denne klon opskæres med Hindlll og Apal, og fragmentet på 1,45 35 kb, som indeholder CRl-SCR’er 18-25, isoleres, ligateres til fragmentet på 4,7 kb fra pl88.2, og ligateringen trans- H DK 175699 B1 M formeres ind i E. coli DH5a. Dette plasmid kaldes p8.250.1.

H EcoRI-fragmenterne på 0,75 kb og 0,93 kb fra cDNA-klo- nen ΛΤ8.3 (W.W. Wong et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 22, 7711) underklones ind i plasmid pBR327. Disse 5 underkloner kaldes henholdsvis pCRl-1 og pCRl-2 og indeholder henholdsvis SCR'er 11-14 og SCR'er 17-21. EcoRI-indsætnings gerne renses fra hver af dem. pCRl-1-fragmentet på 0,75 kb

H digereres med Smal, og digereringen ligateres til pUCl8-DNA

opskåret med EcoRI og Smal. En underklon, pl81-l.l, med en 10 indsætning på 0,5 kb svarende til SCR'er 12-14 isoleres. Fragmentet på 0,93 kb af pCRl-2 digereres med Hindlll og ligateres til pUC19 opskåret med EcoRI og Hindlll, og der isoleres en underklon, pl91-2.1, som indeholder en indsætning på 0,27 kb indeholdende SCR 17.

15 cDNA-klonen XT6.1 (se ovenstående af snit 6; L.B.

Klickstein et al., 1987, J. Exp. Med. 165, 1095; W.W. Wong et al., 1987, J. Exp. Med. 164, 1531) digereres med EcoRI, H og fragmentet på 0,37 kb svarende til CRl-SCR'er 15 og 16 un- derklones ind i pBR322. Denne klon kaldes pCRl-4. Klon pl8- 20 -1-1.1 opskæres med EcoRI og Seal, og fragmentet på 1,4 kb isoleres. Klon pl91-2.1 (L.B. Klickstein et al., 1987, J.

Exp. Med. 165, 1095; se ovenstående afsnit 6) digereres med H EcoRI og Seal, og fragmentet på 2,0 kb isoleres, ligateres til fragmentet på 1,4 kb fra pi81-1.1, og blandingen trans- 25 formeres ind i E. coli DH5a. Det resulterende plasmid kaldes pl-11-2. Plasmid pl-11-2 digereres med EcoRI, og indsæt- ningsfragmentet på 0,37 kb fra pCRl-4 indsættes ved ligate- ririg. Det resulterende plasmid anvendes til transformation I af E. coli DH5a.

30 Der udvælges en underklon, som indeholder et BamHI- I -Hindlll-fragment på 0,39 kb.. Dette plasmid kaldes pl42 og I indeholder CRl-SCR'er 12-17. EcoRI-Hindlll-indsætningsfrag- mentet på 3,5 kb fra p8.250.1 overføres til pGEM3b. Dette I plasmid kaldes pG8.250.1. Hindlll-fragmentet på 1,2 kb fra I 35 pl42 renses og ligateres til pG8.250.1, som er blevet opskå- I ret med Hindlll. Der udvælges en underklon, som indeholder

DK 175699 B1 I

I en PstI-Apal-indsætning på 2,4 kb, således at den korrekte I

orientering udvælges. Dette plasmid kaldes pCD og indeholder I

CR1-sekvenser fra SCR 12 til 3'-enden. I

cDNA-klonen λ5'7.ΐ (L.B. Klickstein et al., sept. I

5 1987, Complement 4, 180; se ovenstående afsnit 7) opskæres I

med PstI, og fragmentet på 1,35 kb svarende til SCR’er 6-12 " I

isoleres og ligateres til PstI-opskåret pCD. Blandingen I

transformeres, og der udvælges en underklon, som indeholder I

HindiII-fragmenter på 1,35 kb og 1,1 kb. Denne klon kaldes I

10 pBCD. I

cDNA-klonen X5'3.1 (L.B. Klickstein et al., 1987, I

Complement 4, 180; se ovenstående afsnit 7) opskæres med I

EcoRI, og digereringen ligateres til ScoRI-opskåret pUC18. I

Der isoleres en underklon, p3.11-l, som indeholder en ind- I

15 sætning på 1,0 kb svarende til SCR'er 3-7, hvilken indsætning I

gelrenses. cDNA-klonen Χ5Ί0.3 (L.B. Klickstein et al., 1987, I

Complement 4, 180; se ovenstående afsnit 7) opskæres med I

EcoRI, og indsætningen på 0,63 kb indeholdende SCR'er 1 og ί I

2 underklones ind i pUC18. Denne klon kaldes plO.3.5. Plasmid I

20 plO.3.5 digereres delvist med EcoRI, og et fragment på 3,4 I

kb svarende til et lineært plasmid isoleres og ligateres I

med fragmentet på 1 kb fra p3.11-l. Der udplukkes en under- I

klon, pLA, som indeholder et PstI-fragment på 1,3 kb på det korrekte indsættelsessted og i den korrekte orientering.

25 cDNA-klonen XT109.4 (L.B. Klickstein et al., 1987,

Complement 4, 180,- ,se ovenstående afsnit 7) digereres med EcoRI og underklones ind i pUC18. Der udvælges en underklon, som indeholder et EcoRI-fragment på 0,55 kb svarende til den 5'-utranslaterede region gennem ledersekvensen og 30 SCR'er 1 og 2 . Plasmidet pl09.4 opskæres med PstI og BspMII, og et fragment på 3,0 kb indholdende vektoren, ledersekvensen og SCR 1 isoleres. Fragmentet ligateres til et Pstl--BspMII-fragment på 0,81 kb fra pLA, som indeholder SCR'er 2-5. Dette nye plasmid kaldes pNLA. Plasmidet pNLA digereres 35 delvist med EcoRI og digereres fuldstændigt med PstI, og et EcoRI-PstI- fragment på 1,1 kb indeholdende CR1-sekvensen I DK 175699 B1 58 fra ledersekvensen gennem SCR 5 isoleres og ligateres til "pBluescript KS+H (Stratagene, San Diego, CA) til placering af et Xhol-sted på 5'-siden af cDNA. Dette plasmid kaldes pXLA.

5 Plasmidet pBCD opskæres med EcoRV og digereres derefter delvist med PstI, og et PstI-EcoRV-fragment på 6,0 kb .

indeholdende CRl-sekvensen fra SCR 6 gennem den 3'-utransla- i terede region isoleres og ligateres til PstI- + .Smal-dige-reret pXLA. Det resulterende bakterieekspressionsplasmid, 10 som indeholder hele CR1-cDNA-kodesekvensen, kaldes pBSABCD.

Konstruktion og afprøvning af plasmid piABCD, en pattedyrekspressionsvektor indeholdende hele CR1-kodesekvensen^_ 15 Plasmidet pBSABCD digereres med Xhol og NotI, og

indsætningen ligateres med strømmen fra CMV-promotoren i I

fragmentet på 4,4 kb i ekspressionsvektoren CDM8 (B. Seed, I

1987, Nature 329, 840-842), som også er blevet opskåret med I

disse restriktionsenzymer. Den resulterende konstruktion I

20 betegnes piABCD (fig. 11). Alternativt ligateres Xhol-NotI- I

-fragmentet på 6,9 kb med strømmen fra metallothioneinpromo- I

teren i ekspressionsvektoren pMT.neol, som også er blevet I

opskåret med disse restriktionsenzymer. Den resulterende I

konstruktion betegnes pMTABCD (fig. 11). I

25 Fåreerythrocyter sensibiliseret med kaninantistof I

(EA) og begrænsede mængder af C4b [EAC4b(lim)l og 12000 cpm I

125I-C3b pr. celle (EAcC4b(lim),3b] præpareres ved sekventiel I

behandling af EAC4b(lim) (Diamedix) med Cl, C2 og ^2^I-C3 I

efterfulgt af inkubering i 60 minutter ved 37°C i gelatine- I

30 veronalpufret saltopløsning indeholdende 40 mM EDTA. Alter- ,- I

nativt knyttes methylaminbehandlet C3 [C3(ma)J covalent til I

fåre-E (erythrocyter) behandlet med 3-(2-pyridyldithio)- I

-propionsyre-N-hydroxysuccinimid-ester (Sigma) (J.D. Lambris I

et al., 1983, J. Immunol. Methods 65, 277). EAC4b præpareres I

35 med renset C4 (C.H. Hammer et al., 1981, J. Biol. Chem. I

256, 3995). I

DK 175699 B1

I Både piABCD og pMTABCD transficeres ved DEAE-dextran- I

I -metoden (diethylaminoethyl) ind i COS-celler (abe). Rekom- I binant-CRl påvises på overfladen af de transficerede celler I ved immunofluorescens ved anvendelse af det monoklonale I r- 5 anti-CR1-antistof YZ-1 og ved immunoudfældning af 125I-mær- I kede celler efterfulgt af ikke-reducerende SDS-PAGE, hvilket I afslører ,et protein med en mobilitet identisk med den for I CR1 immunoudfældet fra humane erythrocyter fra en donor, I som er homozygøs for F-allotypen (W.W. Wong et al., 1983, I 10 J. Clin. Invest. 72, 685), og ved dannelse af rosetter med I fåreerythrocyter overtrukket med C3b (D.T. Fearon, 1980, J.

I Exp. Med. 152, 20). De identiske, elektroforetiske mobili- I teter af de native proteiner og rekombinant-CRl-proteinerne I bekræfter, at CR1-F-allotypen indeholder SCR'er 1-30.

15 Desuden cotransficeres muse-L-celler ved DEAE-dextran- I -metoden (F.M. Ausubel et al., 1987, Current Protocols in I Molecular Biology, J.G. Seidman og K. Struhl udg., John

Wiley & Sons, New York; B. Seed, 1987, Nature 329, 840-842) I ved dobbeltforsøg med 0, 2 eller 4 μg af enten piABCD eller I 20 pMTABCD og 2 ^g pXGH5, et reporterplasmid, som dirigerer ekspressionen af væksthormon (R.F. Selden et al., 1986,

Mol. Cell. Biol. 6, 3173). Cellerne høstes efter 2 døgn og afprøves for ekspression af CR1 ved binding af YZl-mono- klonalt anti-CRl-antistof. Der er en dosis-reaktion-relation 25 mellem rekombinantplasmid-DNA og ekspression af CR1-antigen (tabel II).

I DK 175699 B1 60

Tabel II

Dosisreaktion af rekombinant-CRl og human væksthormon i cotransficerede L-celler.

YZl-Anti- 5 -CRl-mAB Vækst-

Plade pXGH5 pMTABCD piABCD RIA* hormon nummer (μg) (μg) {μg) (cpm) (ng/ml) 12 0 0 1444 120 102 2 0 2 6058 130 3 20 2 6531 140 420 4 10620 180 52 0 4 9898 80 6 22 0 3111 180 .

15 7 2 2 0 2747 160 824 0 3547 160 9 2 4 0 3337 140 * Til radioimmunoafprøvning (RIA) inkuberes dobbeltprøver 20 af 3 x 105 transf icerede celler i 0,1 ml phosphatpufret saltopløsning indeholdende 1% okseserumalbumin og 0,02% natriumazid ved 0°C i 60 minutter med 3 ^g/ml YZ-l-IgGl--anti-CRl {P.S. Changelian et al., 1985, J. Immunol. 134, 1851). Cellerne vaskes og resuspenderes i 0,1 ml puffer 25 indeholdende 1-2 /iCi/ml 12^i-f{ab')2-gede-anti-muse-IgG eller 12^I-protein A. Efter 1-2 timer ved 0°C vaskes cellerne og afprøves for 125I.

Plasmidet piABCD dirigerer ekspressionen af næsten 30 tre gange mere CR1-antigen end pMTABCD. Væksthormonkoncentrationen i kulturmediet varierer med mindre end to gange med undtagelse af plade 5. Yderligere forsøg har afsløret, at piABCD dirigerer den forbigående ekspression af tre gange mere CRl-antigen i COS-celler end i L-celler.

35 CRl-antigen er til stede i klynger på overfladen af de transficerede COS-celler, når de vurderes ved en direkte immunofluorescens af celler farvet med YZl-anti-CRl-mAB (fig. 12). Denne fordeling af rekombinant-CRl på COS-celler | ligner den fra CR1 af vildtype på humane leukocyter (D.T.

40 Fearon, et al., 1981, J. Exp. Med. 153, 1615).

Molekylvægten af rekombinant-CRl bestemmes ved over- DK 175699 B1

61 I

fladeiodering af COS-celler transficeret med piABCD, im- I

munoudfældning af cellelysater med "Sepharose®-YZl", SDS-PAGE I

og autoradiografi. Rekombinant-CRl har en molekylvægt på I

190.000 ureduceret, hvilket er ækvivalent til molekylvægten I

5 af F-allotypen og mindre end S-allotypen i erythrocyt-CRl I

(fig. 14). I

C3b-bindings og C4b-bindingsfunktionen af rekombinant- I

-CR1 er blevet afprøvet ved dannelse af rosetter mellem de I

transficerede COS-celler og EAC4b eller EAC4B(lim),3b. Ved I

10 31 separate transfektioner binder 5-50% COS-celler trans- I

ficeret med plasmidet piABCD fem eller flere EAC4b eller I

EAC4b(lim), 3b (fig. 13). De COS-celler, som eksprimerer I

CR1, danner ikke rosetter med EAC4b(lim),3bi, selv om dette I

mellemprodukt faktisk danner rosetter med Raji B-lymfobla- I

15 stoidceller, som eksprimerer CR2. I

I Ekspression af CR1-fragmenter. I

Ekspressionsvektorer, som koder en del af CRl-kode- I

sekvensen (udeladelsesmutanter), konstrueres som nedenfor I

20 beskrevet og viser sig at eksprimere deres respektive CR1- I

-indsætninger, når de transformeres ind i COS-celler. CR1- I

-fragmenterne eksprimeres som celleoverfladeproteiner. I

i I

Konstruktion af udeladelsesmutanterne piBCD, piABD, 25 piACD, piAD, piBD. PiCD οσ piD.___

Konstruktionen af disse udeladelsesmutanter gennemføres ved at drage fordel af tilstedeværelsen af et enkelt ·

BsmI-sted i en homolog stilling nær ved aminoterminus i hver af de fire lange, homologe CR1-gentagelser (LHR'er) 30 og fraværet af BsmI-steder andetsteds i CRl-cDNA og "Blue- script"-vektor (Stratagene, San Diego, CA).

10 μg af plasmidet pBSABCD digereres delvist med 50 enheder af restriktionsenzymet Bsml i 45 minutter, og dige-reringen fraktioneres ved agarosegelelektroforese. Der renses 35 DNA-fragmenter på 8,55 kb, 7,20 kb og 5,85 kb, som svarer til lineære segmenter i stamplasmidet, som mangler henholds- H DK 175699 B1 vis 1, 2 eller 3 LHR'er. Hvert af disse tre fragmenter li-gateres til sig selv, og ligateringerne anvendes separat H til transformation af kompetent E. coli DH5a til ampicillin- resistens.

H 5 Fragmentet på 8,55 kb skabes som konsekvens af spalt- H ningen af pBSABCD ved to tilstødende BsmI-steder, og der er således tre mulige produktpiasmider efter ligatering, pBCD, pACD eller pABD, hvor de store bogstaver repræsenterer de j LHR'er, som er tilbage i plasmidet. Disse kan skelnes ved 10 restriktionskortlægning med Smal. DNA fremstilles ud fra 12 kolonier, digereres med Smal og adskilles ved agarosegel-elektroforese. Fem kloner har to Smal-fragmenter på 2,5 kb og 6,1 kb svarende til udeladelsen af kodesekvensen i LHR-A og således repræsenterende pBCD. Tre kloner har et enkelt 15 lineært fragment på 8,5 kb svarende til pACD. Fire kloner har to Smal-fragmenter på 1,2 kb og 7,4 kb, hvilket er for-ventet. for udeladelsen af kodesekven i LHR-C under produktion af pABD. Indsætningen på 5,6 kb i hver af disse tre konstruk-

H tioner gelrenses efter dobbeltdigerering med Xhol og NotI

H 20 og ligateres til ekspressionsvektoren CDM8, som er blevet H gelrenset efter digerering med samme restriktionsenzymer. E.

H coli DK1/P3 transformeres med ligateringsblandingerne, og DNA fremstilles ud fra fem kolonier af hver. Tilstedeværelsen af den udeladte CRl-cDNA-indsætning i ekspressionsvektoren 25 er blevet vist i hvert enkelt tilfælde ved SacI-digerering, som afslører de forventede to fragmenter på 4,20 kb og 5,75 kb. Disse plasmider er blevet kaldt piBCD, piACD og piABD.

Fragmentet på 7,20 kb fra den delvise digerering af pBSABCD er en konsekvens af Bsml-digerering ved tre tilstø- 30 dende steder eller, ækvivalent i forhold til det store frag- H ment, ved to steder med et enkelt uopskåret sted imellem I sig, og der er således to mulige produkter, som kan opnås I efter transformation, pAD og pCD. Disse skelnes ved dob- beltdigerering med Xhol og PstI, hvilket giver to fragmenter I 35 på 1,0 og 6,2 kb, hvor der er tale om pAD, og et lineært I fragment på 7,2 kb for pCD. Indsætningen på 4,2 kb fra hvert I DK 175699 B1 af disse plasmider gelrenses efter dobbeltdigerering med Xhol og NotI og underklones ind i CDM8 som ovenfor. Tilstedeværelsen af den udeladte CRl-cDNA i ekspressionsvektoren vises ved dobbeltdigerering med PstI og Bglll. Klonen piAD har 5 fragmenter på 2,4 kb og 6,2 kb, medens piCD har et enkelt fragment på 8,6 kb.

Fragmentet på 5,85 kb fra BsmI-digereringen af pBSABCD repræsenterer et produkt af komplet digerering, og en enkelt klon, pD, fås efter transformation af E. coli DH5a. Dette 10 bekræftes ved dobbeltdigerering med HindiII og Bglll, hvilket giver de forventede fragmenter på 3,7 kb og 2,2 kb. Indsætningen på 2,9 kb i klonen gelrenses efter dobbeltdigerering med Xhol og NotI og ligateres til ekspressionsvektoren som ovenfor. Hindlll-digerering af den resulterende piD-klon 15 giver det forventede fragment på 7,3 kb, en Xhol- + Bglll--dobbeltdigerering giver fragmenter på 2,2 kb og 5,1 kb, og en SacI-digerering resulterer i de forventede fragmenter på 1,5 kb og 5,8 kb.

Plasmidet pBD fremstilles ved delvis Bsml-digerering 20 af pBCD. Det lineære fragment på 7,2 kb svarende til spaltningen af to tilstødende Bsml-steder gelrenses, selvligateres som ovenfor, og E. coli DH5a transformeres til ampicillin-resistens. pBD identificeres ved tilstedeværelsen, af fragmenter på 1,2 kb og 6,0 kb efter Smal-digerering. Indsætnin-25 gen på 4,2 kb renses efter dobbeltdigerering med Xhol og NotI og overføres til CDM8 som ovenfor. Klonen piBD bekræftes ved iagttagelse af de forventede fragmenter på 0,8 kb og 7,8 kb efter Hindlll-digerering.

COS-celler, som forbigående eksprimerer henholdsvis 30 piABCD-, piBCD-, piCD- og piD-konstruktionerne, overflademærkes med 125i 0g immunoudfældes med anti-CRl-antistof. Ved SDS-PAGE efter reduktion vandrer produktet fra piABCD-kon-struktionen sammen med F-allotypen i CRl, medens udeladelsesmutanterne viser trinvise formindskelser på ca. 45.000 35 dalton, hvilket angiver udeladelsen af henholdsvis 1, 2 og 3 LHR'er {fig. 17) .

II

DK 175699 B1 |

Konstruktion af udeladelsesmutanter piPl, piEl, piE2, I

piE-2, piUl, piU-2 og piA/D.___ I

Plasmidet piABCD digereres fuldstændigt med BstEII, I

og de to fragmenter på 1,35 kb (en dublet) og 8,6 kb gelren- I

5 ses, blandes og ligateres, og E.-.coli DK1/P3 transformeres I

til ampicillin- og tetracyclinresistens. Kolonier screenes I

ved hybridisering med CRl-cDNA-sonden CR1-4 (se ovenstående I

afsnit 8.1), og stærkt positive kloner plukkes ud og screenes I

yderligere ved digerering med Smal. piEl identificeres ved I

10 tilstedeværelsen af to fragmenter på 2,7 kb og 7,3 kb, og I

piE-2 identificeres ved hjælp af et enkelt lineært fragment I

på 10,0 kb. piE-2 identificeres som en svagt CRl-4-positiv I

klon, som indeholder et enkelt Smal-fragment på 8,6 kb. I

Plasmidet piPl fås ved fuldstændig digerering af I

15 piABCD med PstI og gelrensning af det store fragment på I

10,0 kb. Dette fragment ligateres, og E. coli DK1/P3 trans- I

formeres med blandingen. Det resulterende plasmid, piPl, I

indeholder et enkelt Smal-fragment på 10,0 kb. I

Plasmiderne piUl og piU-2 fremstilles ved først at I

20 transformere dem--stammen GM271/P3 med plasmidet pXLA og I

isolere DNA. Denne DNA dobbeltdigereres med Stul og NotI, I

og fragmentet på 3,3 kb gelrenses. Plasmidet pBSABCD dige- I

reres delvist med Nsil, og de resulterende 3'-udhæng på I

fire baser fjernes ved behandling med Klenow-fragmentet af |

25 E. coli DNA-polymerase I. Derefter digereres DNA til fuld- I

stændiggørelse med NotI, og fragmenter på 5,4 kb og 4,0 kb | gelrenses. Disse ligateres til StuI-Notl-fragmentet på 3,3 | kb fra pXLA, og ligateringsblandingen anvendes til transfor- | mation af E. coli DH5a til ampicillinresistens. Kolonier | 30 screenes ved hybridisering til CRl-cDNA-sonden CRl-4, og | positive kloner efterprøves yderligere ved restriktionsdi- | gerering med Hindlll, hvilket giver tre fragmenter på 0,8 | kb, 1,3 kb og 6,5 kb for pUl og to fragmenter på 0,8 kb og | 6,5 kb for pU-2. Den Stul-afstumpede Nsil-splejsning bekræf- | 3 5 tes at være i ramme ved DNA-sekvensering af disse plasmider. |

Indsætningerne i pUl og pU-2 på henholdsvis 5,6 kb og 4,2 |

I DK 175699 B1 I

kb gelrenses efter Xhol- og NotI-dobbeltdigerering og liga- I

teres til ekspressionsvektoren CDM8 som ovenfor beskrevet. I

Strukturene -af klonerne, piUl og piU-2, er blevet bekræftet I

ved restriktionsdigerering med Xhol + PstI, hvilket giver I

5 de forventede to fragmenter på 1,2 kb og 8,8 kb for piUl og I

et lineært fragment på 8,7 kb for piU-2. I

Plasmidet piA/D fremstilles ved først at digerere I

piABCD med PstI til fuldstændiggørelse. Derefter digereres I

Pstl-digereringen delvist med Apal, og 3'-udhængene fjernes I

10 med Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I. DNA frak- I

tioneres derefter ved agarosegelelektroforese, og fragmentet I

på 7,5 kb isoleres, ligateres og anvendes til transformation I

af E. coli DK1/P3 til ampicillin- og tetracyclinresistens. I

Konstruktionen bekræftes ved dobbeltdigerering med Kpnl + I

15 SacI, hvilket giver de forventede fire fragmenter på 0,8 I

kb, 1,5 kb, 1-, 7 kb og 3,3 kb. I

Eksempel: Identifikation af C3B- og C4b-bindingsdomæner. I

Afprøvninger og resultater. I

20 Plasmiderne piABCD, piAD, piCD og piD, som indeholder I

den eller de LHR'er, som er betegnet med de store bogstaver I

i deres navne, transformeres ind i COS-celler, som anvendes I

ved afprøvninger til vurderingen af evnen hos deres kodede I

CR1-fragmenter til binding af C3b eller C4b. Bindingsafprøv-25 ninger er blevet gennemført ved iagttagelse af erythrocyt--rosetdannelse som et resultat af binding af C3b- eller C4b-overtrukne, røde blodlegemer af COS-celler, som ekspri-merer et CR1-molekyle af fuld længde eller en CR1-udeladelsesmutant på deres celleoverflade (forbigående ekspression).

30 Transficerede celler, 1-4 x 106/ml, inkuberes med C3- eller C4-bærende erythrocyter, 2-6 x 108/ml, i 0,02 ml i 60 minutter ved 20°C. Den procentdel af de transficerede celler, som danner rosetter, vurderes mikroskopisk, idet en trans-ficeret celle bedømmes som en roset, hvis der er mindst 35 fire adhærerende erythrocyter. Resultaterne er vist i tabel III.

I DK 175699 B1 Η

H Tabel III

Dannelse af rosetter mellem COS-celletransfektanter, som eksprimerer rekombinantformer af CR1- og fåre-erythrocyter, som bærer C3(ma) eller C4(ma) % Transfektanter, som danner rosetter % Transfektanter, som fluorescerer med anti-CRl COS-celle- 10 transfektant EC3(ma)* EC4(ma)** H piABCD 109 (3)*** 62 (2) piAD 8 " 107 " piBD 107 12 " piCD .127 " 32 " 15 piD 0 0 " I piA/D 11 (2) 83 (2) piE-2 1 (1) 102 (1) * Antallet af C3(ma) pr. erythrocyt er henholdsvis 60.000, 20 350.000 og 900.000 i de tre forsøg, som anvender dette H mellemprodukt.

H ** Antallet af C4(ma) pr. erythrocyt er henholdsvis 160.000 H og 140.000 i de to forsøg, som anvender dette mellempro- H dukt.

25 *** Antal forsøg.

Ved hvert af tre separate forsøg er det mængdeforhold af COS-celler, som eksprimerer den piABCD-konstruktion af fuld længde, som danner rosetter med EC3 (ma) , mage til den 30 brøkdel, som har en påviselig rekombinantreceptor, som vur- deret ved immunofluorescens ved anvendelse af enten YZl-mo- I noklonalt anti-CRl-antistof eller kanin-anti-CRl-antiserum H (tabel III). I modsætning hertil danner celler, som ekspri- I merer piD, ikke rosetter, hvilket angiver, at et eller flere I 35 C3-bindingssteder må ligge i eller kræve tilstedeværelsen af I LHR-A, -B eller -C. Det er blevet vist, at et sted er til I stede i både LHR-B og -C ved påvisning af, at celler, som I eksprimerer enten piBD- eller piCD-konstruktionerne, danner

I rosetter med EC3(ma). Celler, som eksprimerer piAD, piA/D

I 40 eller piE-2, har ikke en ækvivalent C3-bindingsfunktion. Da DK 175699 B1 67 piE-2-konstruktionen kun afviger fra piCD ved at have SCR-1 og -2 i LHR-A i stedet for de to første SCR'er i LHR-C, må funktionen af C3-bindingsstedet i LHR-C kræve disse ΝΗ2-1:βΓ-minale SCR'er.

5 Det mængdeforhold af COS-celler, som eksprimerer den piABCD-rekombinant af fuld længde, som danner rosetter med EC4(ma), er mindre end den brøkdel, som danner rosetter med EC3 (ma), hvilket måske genspejler færre C4 (ma) pr. erythrocyt (tabel III) eller færre C4-bindingssteder pr. receptor.

10 Udeladelsesmutanter, som har hele eller en del af LHR-A, piAD-, piA/D- og piE-2-konstruktionerne, binder EC4(ma) bedre, end udeladelsesmutanterne, piBD og piCD, gør, og piD mangler denne funktion. C4-bindingsstedet i CR1 ligger derfor primært i LHR-A, selv om sekundære steder kan være til stede 15 i LHR-B og -C. Den forbedrede rosetdannelsesevne hos piE--2-konstruktionen i forhold til piCD antyder, at SCR-1 og -2 i LHR-A er involveret i C4-bindingsstedet.

Radioimmunoafprøvning af binding af YZl-monoklonalt anti-CRl-antistof har vist signifikant optagelse af COS-cel-20 ler, som eksprimerer piABCD-, piAD-, piBD- og piCD-konstruk-tionerne (tabel IV) . Celler transficeret med piD eller piA/D, som udgøres af de fem NH2-terminale SCR'er i LHR-A og de tre COOH-terminale SCR'er i LHR-D, binder ikke YZl-anti-CRl-- antistof, selv om produkterne af disse konstruktioner binder 25 polyklonalt anti-CRl-antiserum (tabel IV) . YZl-epitopen er derfor gentaget i LHR-A, -B og -C, er ikke til stede i de NH2-terminale SCR'er i LHR-A og er ikke til stede eller er utilgængelig i LHR-D.

I DK 175699 B1 I

Tabel IV i I

Binding af monoklonalt og polyklonalt anti-CRl-antistof I

til COS-celletransfektanter, som eksprimerer rekombi^ I

nantformer af CR1 I

Bundet Bundet I

COS-celle- monoklonalt polyklonalt I

transfektant YZl-antistof♦ kaninantistof* I

piABCD 2362 12277 I

10 piAD 2879 19891 I

piBD 3646 21922 I

piCD 2189 19926 I

piA/D 410 23052 I

piD 404 16386 I

15 CDMS 428 4886 I

* Dobbeltprøver af 3 x 105 transficerede celler inkuberes i I

0,1 ml phosphatpufret saltopløsning indeholdende 1% ok- I

seserumalbumin og 0,02% natriumazid ved 0°C i 60 minutter I

20 med 3 μg/ml YZ-1-IgGl-anti-CRl-mAb (P.S. Changelian et I

al., 1985, J. Immunol. 134, 1851), eller med 90 //g/ml I

kanin-IgG-anti-CRl-antistof. Cellerne vaskes oq resuspen- I

deres i 0,1 ml puffer indeholdende 1-2 /iCi/ml 12^I-F{ab'>2" I

gede-anti-muse-IgG eller 125I-protein A. Efter 1-2 timer I

25 ved 0°C vaskes cellerne og afprøves for 125I. De viste I

værdier er gennemsnittet af dobbeltbest emmel seme, cpm I

pr. 3 x 105 COS-celler. I

Diskussion. I

30 Det bevarede BsmI-sted, som findes midtvejs gennem I

kodesekvensen i den første SCR i hver LHR, tillader kon- I

struktionen af en række udeladelsesmutanter, som snævert I

svarer til grænserne for disse LHR'er, og opretholder den I

åbne læseramme og de hensigtsmæssige stillinger af de fire I

35 cysteiner, som er nødvendige for den formodede disulfidbin- I

dingsdannelse (fig. 16). En sammenligning af C3(ma)- og I

C4(ma) -bindingsfunktionerne i disse udeladelsesmutanter I

skelner ikke alene mellem de LHR'er, som har disse specifi- I

citeter, men også mellem de SCR'er, som er kritiske for I

40 påvisningen af ligandspecificiteten. Derfor viser evnen I

hos piAD-, piA/D- og piE-2-formerne af receptoren, men ikke I

DK 175699 B1 I

69 I

piD-formen, til mediering af rosetdannelse mellem de trans- I

ficerede COS-celler og EC4 (ma) , at de to NH2-terminale SCR'er I

i LHR-A indeholder et sted for vekselvirkning med dette I

komplementprotein (tabel III). Dette sted er kun relativt I

5 specifikt for C4(ma), fordi transfektanter, som eksprimerer I

pi AD og piA/D, også er i stand til at binde SC3(ma) (tabel I

III). C3 (ma)-bindingsfunktionen i de receptorer, som kodes I

af piBD- og piCD-konstruktionerne, vist ved rosetteafprøv- I

I ningen og cofaktorfunktionen for faktor I for spaltning af I

10 C3 (ma) (tabel III, fig. 18), angiver tilstedeværelsen af I

steder, som er specifikke for C3(ma), i de første to SCR'er I

i disse LHR'er. Disse steder er også i stand til veksel- I

virkning med C4(ma) (tabel III). Der er derfor foretrukne, I

men overlappende, C4- og C3-bindingsaktiviteter i LHR-A, -B I

15 og -C. I

Alternativt kan evnen til binding af EC4 (ma) hos de I

COS-celler, som eksprimerer piBD- og piCD-konstruktionerne, I

eventuelt være forårsaget af overføring af nucleotider, som I

koder de 36 NH2-terminale aminosyrer fra SCR-1 i LHR-A til I

20 LHR-B og -C gennem ligateringen af Bsml-fragmenterne. Imid- I

lertid giver disse 36 aminosyrer ikke alene piD-produktet I

C4-rosetfunktion. En sekundær funktion af LHR-D ved disse I

reaktioner kan ikke udelukkes, fordi denne LHR er til stede ' I

i alle de konstruktioner, som er afprøvet for funktion. I

25 Erkendelsen af tre forskellige liganderkendelsessteder i I

CR1, to for C3b og et for C4b (fig. 19), viser, at hvert f receptormolekyle eventuelt kan være i stand til effektiv binding af komplekser, som bærer flere C4b- og C3b-molekyler, til trods for at de har en relativt lav affinitet for mono-30 valente ligander (M.A, Arnaout et al., 1983, Immunology 48, 229). Denne erkendelse tilvejebringer også en forklaring på den manglende evne hos opløselig C4b til inhibering af dannelsen af rosetter mellem erythrocyter, som bærer C3b, og en human B-lymfoblastoidcellelinie (T.A. Gaither et al., 35 1983, J. Immunol. 131, 899). Mulige ligander, for hvilke CR1 ville være specielt tilpasset, kan være de molekylkom- H DK 175699 B1 Η plekser, C4b/C3b og C3b/C3b, som skabes under aktivering af henholdsvis de klassiske og de alternative veje. Da der er forskellige bindingssteder i tre af de fire LHR'er, kan de CRl-strukturallotyper, som afviger ved deres antal af LHR'er, 5 have signifikante funktionelle forskelle, som forårsages af - variationer i antallet af ligandbindingssteder. Selv om studier in vitro ikke har rapporteret om afvigende bindings-aktiviteter for allotyperne F, S og F' (henholdsvis A, B og C), kan den mindre F'-allotype, som formodentlig kun har 10 tre LHR'er, eventuelt have en forringet evne til clearing af immunkomplekser. Det er blevet rapporteret, at F'-al-lotypen muligvis er forbundet med systemisk lupus erythema-H tosus (S. van Dyne et al., 1987, Clin. Exp. Immunol. 68, I 570).

Eksempel: Påvisning af cofaktoraktivitet for faktor I.

Det er blevet påvist, at rekombinant-CRl-proteinet og specifikke fragmenter deraf i både celleoverfladeformer og opløseliggjorte former har cofaktoraktivitet for C3b-fak- I 20 tor I.

Afprøvninger for cofaktoraktivitet for faktor I er blevet gennemført ved modifikationer af en offentliggjort metode (D.T. Fearon, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5867). j I 25 Til afprøvning af cofaktoraktivitet for faktor I af I opløseliggjort CR1 og fragmenter er celleoverflade-CRl-pro- I tein og fragmenter blevet opløseliggjort med "Nonidet® P-40", I og lysatet er blevet immunoudfældet med monoklonalt anti- i -CRl-antistof YZ-1 koblet til "Sepharose®"-perler. Deter- 30 gentlysater af 1 x 106 transficerede COS-celler er blevet I immunoudfældet sekventielt med "Sepharose® UPC10"-anti-levan I og "Sepharose®"-YZ-1. Derefter er immunoudfældningen blevet I afprøvet for cofaktoraktivitet for faktor I ved inkubering I af de vaskede perler i 60 minutter ved 37°C med 0,5 μg 125j- I 35 -C3(ma) og 200 ng faktor I i 0,05 ml PBS, 0,5% "NP-40". Efter I inkubering er den ovenstående væske indeholdende radiomærket

DK 175699 B1 I

71 I

C3(ma) blevet analyseret ved SDS-polyacrylamid-gelelektro- I

forese og autoradiografi. Cofaktoraktivitet for faktor I er I

angivet ved tilsynekomsten på autoradiogrammet af former I

med lavere molekylvægt af α-kæden i C3 (ma) , som er resultatet I

15 af proteolytisk spaltning ved hjælp af faktor I. I

Til afprøvning af cofaktoraktivitet for faktor I af I

celleoverflade-CRl og fragmenter er transficerede COS-celler, I

som bærer en CR1-ekspressionsvektor (piABCD, piAD, piBD, I

piCD eller piD, beskrevet ovenfor) blevet inkuberet med 0,5 I

10 /xg 12^I-C3(ma) og 0,2 μg faktor I (D.T. Fearon, 1977, J. I

Immunol. 119, 1248) og analyseret som ovenfor beskrevet. I

Cofaktoraktiviteten for faktor X af celleoverflade- I

-rekombinant-CRl er vist i fig. 15. Faktor I har kun spaltet I

α-kæden i C3(ma) i fragmenter med molekylvægte på 76.000 og I

15 46.000 i nærværelse af immunoimmobiliseret rekombinant-CRl I

eller faktor H (fig. 15) . De regioner, som svarer til bånd I

fra autoradiogrammet, udskæres fra gelen og afprøves for I

12^I til bestemmelse af mængden af spaltet α-kæde. I nærvær I

af faktor H er 91% af α-kæden spaltet, medens der i nærvær I

20 af voksende mængder af rekombinant-CRl spaltes henholdsvis I

26%, 41% og 55%. Selv om de COS-celler, som er transficeret I

med CDM8-vektoren alene, indeholder nogen endogen cofaktoraktivitet for faktor I, er en stigning i denne funktion tydelig med COS-celler transficeret med piABCD, piBD og 25 piCD (fig. 18) . Der ses ingen forøget spaltning af 125I- -C3(ma) med COS-celler transficeret med piAD eller piD.

Blandt disse konstruktioner har derfor kun de udeladelses-mutanter, piBD og piCD, som har givet COS-celler en evne til binding af C3, tillige haft cofaktoraktivitet for faktor 30 I til spaltning af C3.

Resultaterne af afprøvningerne for cofaktoraktivitet for faktor I med både celleoverfladeformer og opløseliggjorte former af CR1 og fragmenter deraf er vist i tabel V.

DK 175699 B1

I I

Tabel V I

Cofaktoraktivitet for faktor I af celleoverfladeformer I

og opløseliggjorte former af CR1 og CR1-fragmenter I

5 Cofaktoraktivitet for faktor I*5 I

Plasmid3 Celleoverflade Opløseliggjort I

piABCD + + I

10 piAD I

piBD + NDC I

H piCD + + I

piD NDd I

H 15 3 Kodning af det afprøvede CRl-protein eller -fragment og I

H transficeret ind i COS-celler til ekspression. I

H b ( + ) Betegner en stigning i cofaktoraktivitet over det I

H endogene niveau, som iagttages efter transfektion med I

H CDM8-vektoren alene. I

20 c Ikke bestemt. I

d Ikke bestemt på grund af fraværet i LHR-D af den epitop, I

som er erkendes af monoklonalt anti-CRl-antistof YZ-1. I

Som det vil ses i tabel V, har ekspresion af piABCD I

25 (som koder et CRl-protein af fuld længde), piBD (som koder I

LHR-B og -D) eller piCD (som koder LHR-C og -D) produceret I

I et CRl-produkt med cofaktoraktivitet for C3b-faktor I. Disse I

I data i tabel V giver derfor bevis for, at CR1-proteinet I

eller et fragment deraf kan fremme komplementinaktivering. I

I I

Eksempel: Ekspression af opløselig rekombinant-CRl. I

CRl-cDNA modificeres ved rekombinant-DNA-metoder, I

således at der dannes en opløselig form (sCRl) af CR1 eller I

I CR1-fragmenter. sCRl-konstruktionerne eksprimeres i et pat- I

I 35 tedyrssystem, hvor det eksprimerede protein udskilles fra I

I cellerne. Der produceres store mængder af de opløselige I

I polypeptider, som i modsætning til den membranbundne form I

I af CRl-proteiner ikke behøver at blive opløseliggjort for I

I at opnå dem i opløsning. I

73 DK 175699 B1

Materialer oa metoder.

Bnzvmdigererinqer

Alle restriktionsenzymdigereringer, linkerligateringer og T4-DNA-ligase- og E. coli-DNA-polymerasereaktioner er 5 blevet foretaget i overensstemmelse med fabrikantens (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA) anbefalinger. E. coli DH1 eller DH5a gøres kompetent ved metoden ifølge D.A. Morrison, 1979, Meth. Enzymol. 68, 326-331. Kompotente bak terieceller transformeres med DNA ifølge T. Maniatis et 10 al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Plasmider renses ved alkalisk lyse eller ved kogemetoden (T. Maniatis et al., supra).

15 DNA-fragmentisoleringer.

DNA-fragmenter renses fra agarosegeler (BioRad, Richmond, CA) som.følger. Det hensigtsmæssige DNA-bånd udskæres fra gelen ved anvendelse af en kniv, og agaroseskiven anbringes på et stykke parafilm, opskæres i meget små stykker 20 og overføres til et nyt stykke parafilm. Agarosestykkerne knuses, og agarosen overføres til et 1,5 ml glas. Samme volumen phenol (ultraren, BRL, Gaithersburg, MD) tilsættes, blandingen omhvirvles og fryses derefter ved -70°C i 10 minutter og centrifugeres i 10 minutter. Vandfasen ekstra-25 heres yderligere med phenol/chloroform (1:1) og to gange med chloroform. Derefter ethanolydfældes DNA, perlen vaskes, tørres i vakuum og resuspenderes i 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA.

DNA-fragmenter isoleres fra agarose med lav gelati-30 neringstemperatur (FMC, Corp., Rockland, ME) som følger.

Det hensigtsmæssige DNA-bånd udskæres fra agarosegélen, anbringes i et 1,5 ml glas og smeltes ved 65°C i 15 minutter.

Den flydendegjorte gel ekstraheres med phenol indeholdende 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS, ultraren, BRL, Gaithersburg, 35 MD). Vandfasen ekstraheres yderligere én gang med phenyl-SDS og to gange med chloroform. Derefter ethanoludfældes DNA i

I! DK 175699 B1 I

2,0 M ammoniumacetat, tørres og resuspenderes i vand. I

Transfektion ind i pattedvrceller. I

Transfektion af DNA'er ind i pattedyrceller gennem- I

5 føres ved CaP04-udfældnings- og glycerolchokmetoden ifølge I

Graham og van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467. DUX-B11- I

-CHO-celler udsættes efter at være inkuberes med DNA-cal- I

ciumphosphat-præparatet i 4-6 timer for glycerolchok, ved I

at vækstmediet fjernes ved frasugning, og der tilsættes 5 1 I

10 ml 20%'s glycerol-DMEM-medium i 1 minut. Derefter vaskes I

cellerne to gange i komplet a-MEM og inkuberes i dette medium I

i 48 timer. I

CHO-transfektantcellekultur. I

15 DUX-Bll-CHO-celletransfektanter dyrkes i DHFR-selek- I

tionsmedium (dihydrofolatreduktase) bestående af ar-MEM-medium I

! (Gibco) uden nucleosider suppleret med 10% dialyseret kal- I

vefosterserum (Gibco) og 4 mM L-glutamin. Forstærkning gen- I

nemføres ved dyrkning af celler i voksende koncentrationer I

20 af methotrexat (Sigma, nr. A-6770, Amethopterin) (R.J. I

Kaufman et al., 1985, Molec. Cell Biol. 5, 1750-1759). I

ELISA til påvisninoen af niveauer af opløselig CR1. I

CR1-standarder. I

25 Detergentlysater af hæmoglobinfrie røde blodlegeme- I

spøgelser (RBC) anvendes som CR1-standard ved ELISA (enzym- I

bundet immunosorbentafprøvning). Spøgelserne fremstilles I

som tidligere beskrevet (W.W. Wong og D.T. Fearon, 1987, I

Meth. Enzymol 150, 579-585). Kort fortalt fås for gammelt I

30 helblod fra Røde Kors. De røde blodlegemer vaskes tre gange I

i PBS, lyseres derefter i 6 volumener hypotonisk lysepuffer I

(10 mM Tris, pH 8, 0,1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid), I

0,1 mM TPCK (tosylamidphenylethylchlormethylketon), aproto- I

nin, 2 mM EDTA) . Spøgelserne vaskes nogle gange i lysepuffer, I

I 35 tælles i et hæmocytometer, opdeles i portioner og fryses I

ved -70°C, indtil der er brug for dem. Til CR1-ELISA fortyn- I

75 DK 175699 B1 des spøgelser til 1,6 x 108 spøgelser/ml i opløseliggørende puffer (10 mM Tris, pH 8, 50 mM KCl, 0,2% "NP40", 0,3% DOC, 6,2 mM PMSF, 0,2 mM iodacetamid, aprotonin, 0,1 mM TPCK, 2 ; mM EDTA, 0,2% NaN2) og seriefortyndes til 2,5 x 106 spøgel- 5 ser/ml til anvendelse som standarder ved ELISA. Absorptioner ved 490 nM afbildes, og enhver ukendt prøve henføres til afbildningen til opnåelse af spøgelsesækvivalenter/ml.

CR1-ELISA.

10 "Immulon"-II-plader overtrækkes med 100- μΐ/hul af en 0,4 pg/ml koncentration af et monoklonalt anti-CRl-antistof (Klon J3D3, AMAC IOT 17) (J. Cook et al., 1985, Molec.

i Immunol. 22,·. 531-538) i PBS og inkuberes natten over ved I 4 °C. Derefter kasseres antistofopløsningen, og pladerne I 15 blokeres ved tilsætning af blokeringspuffer (1,0% BSA i j j PBS) med 300 μΐ/hul og inkubering ved 37°C i 2 timer. Efter • blokering anvendes pladerne øjeblikkeligt, eller de opbevares ved 4°C, indtil der er brug for dem.

Pladerne vaskes tre gange ved anvendelse af PBS in-20 deholdende 0,05% "Tween®-20". Prøver tilsættes med 100 μΐ/hul som dobbeltforsøg og indkuberes i 2 timer ved 37°C. Om nødvendigt fortyndes prøverne i opløseliggørende puffer. Stan-dard-RBC-spøgelser medtages på hver plade. Efter prøveinku-bering vaskes pladerne tre gange, og et konjugat (M.B. Wilson 25 og P.K. NaKane, 1978, Immunofluorescence and Related Staining Techniques, North Holland Biomedical Press, side 215-224) af peberrodperoxidase (HRP), og det monoklonale antistof YZ1 (P.S. Changelian et al., 1985, J. Immunol. 134, 1851--1858) fortyndes 1:8000 i 50% FCS, 50% blokeringspuffer og 30 tilsættes med 100 μΐ/hul. Efter inkubering i 2 timer ved 37°C vaskes pladerne igen tre gange med PBS indeholdende 0,05% ,,Tween®-20". Substratet orthophenylendiamin (OPD) tilsættes i 0,2%'s koncentration i substratpuffer (0,36% citronsyre--H20, 1,74% Na2HP04-7H20, 0,1% thimerosal, 0,4% H202, pH

35 6,3) med 100 μΐ/hul. Reaktionen standses efter 20 minutter ved stuetemperatur ved anvendelse af 50 μΐ/hul af 2 N H2S04.

I DK 175699 B1

Absorptioner ved 490 nm aflæses. I

Genetiske modifikationer af CR1-kodesekvenser. I

CRl-cDNA er sammensat af ca. 6.951 nucleotidbasepar I

5 (fig. 1, afsnittene 6 og 7 ovenfor) . Translationsstopsignalet I

i den native cDNA er placeret ved basepar 6145. Proteinet I

er et membranbundet receptormolekyle sammensat af fire lange, I

homologe gentagelser (LHR'er), som er blottet på cellemem- I

branens ydre overflade, plus et domæne på ca. 25 aminosyrer, I

10 som spænder over membranen, efterfulgt af en carboxylter- I

minalregion, som strækker sig ind i cytoplasmaet. Dette I

cytoplasmiske domæne består af 43 aminosyrer. Den strategi, I

som er anvendt til produktion af opløselige CR1-molekyler I

(sCRl) er at fjerne transmembranregionen, som forankrer et I

15 protein i cellemembranen, og derefter at eksprimere de af- I

kortede konstruktioner som udskilte polypeptider.- I

Konstruktion af pBSCRlc. I

Plasmid pBSABCD (ovenstående eksempel 8) indeholder I

20 CRl-cDNA fra nucleotiderne 1 til 6860 og mangler de utrans- I

laterede sekvenser 3' i forhold til EcoRV-stedet ved nucleo- I

tid 6860. CRl-cDNA har et enkelt Ball-restriktionsendonu- I

cleaseerkendelsessted ved basepar 5914, 29 basepar borte I

fra starten af transmembrandomænet. pBSABCD digereres først I

25 med Ball til produktion af et lineært molekyle med glatte I

ender og ligateres derefter ved anvendelse af T4-DNA-ligase I

til et syntetisk oligonucleotid bestående af to komplementære I

strenge på 38 nucleotider med følgende sekvens: I

5' : CCAAATGTÅCCTCTCGTGCACATGATGCTtaaCTCGAG I

30 3': GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC I

Det resulterende molekyle har et genoprettet Ball-sted ; I

og en ændret sekvens, som reproducerer den native CRl-sekvens j I

op til og omfattende alaninresten ved starten af transmem- I

brandomænet. Desuden er et translationsstopsignal (med små ! I

35 bogstaver og understreget ovenfor) blevet indført umiddelbart I

efter alaninet efterfulgt af et Xhol-restriktionssted forJ I

77 DK 175699 B1 at lette underkloning af den ændrede cDNA.

Xhol-digerering af dette plasmid (betegnet pBSCRlc) udskærer cDNA-indsætningen (betegnet sCRlc) ved opskæring ved det oligonucleotidadderede Xhol-sted i cDNA og ved Xhol-ste-5 det i det multiple pBSKS+®-kloningssted ved 5'-enden af CR1--cDNA. pBSCRlc indeholder følgende C-terminale sekvenser:

Base nr. 5911: CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG Aminosyrer: L AKCTSRAHDA slut Xhol- -sted 10

Konstruktion af pBSCRl'er.

En anden sCRl-konstruktion, som mangler en transmembranregion, frembringes som følger. pBSABCD digereres med SacI, som opskærer ved det eneste SacI-sted ved nucleo-15 tidbasepar 5485 i CRl-cDNA og ved Sacl-stedet i det multiple kloningssted i værtspiasmidet, placeret ved 3'-enden af CR1--cDNA. Denne digerering resulterer i udskæringen af 1375 nucleotider af DNA-sekvensen fra 3'-enden af cDNA. Dette fragment fjernes derefter elektroforetisk. De blottede ender 20 af det resulterende plasmid, som indeholder den tilbageværende sCRl-cDNA, gøres glat ved anvendelse af T4-DNA-poly-merase, og der gennemføres en stumpendeligatering. Phar-macia's universaltranslationsterminator (katalog nr. 27--4890-01, -Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ), en selvkomple-25 mentær oligomer, som indeholder translationsstopsignaler i alle tre læserammer, medtages også ved ligateringen. Efter ligatering tilvejebringer den indsatte oligomer et nyt translationsstopsignal for sCRl-cDNA.

30 Konstruktion af pBM-CRlc.

pBMT3X er en eukaryotisk ekspressionsvektor (M.

Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2709--2713}, som indeholder det i humane metallothionein-lA-gen, som giver cellerne modstandsevne mod forøgede niveauer af 35 tungmetaller, såsom cadmium. Vektoren indeholder ligeledes musemetallothionein-1-genet, som indeholder et konstrueret

DK 175699 B1 I

Xhol-sted, som går forud for initieringscodonen for Mt-1- I

-proteinet. Xhol-stedet anvendes som indsættelsesstedet H

til ekspression af gener under kontrol af muse-Mt-I-promoto- H

ren. I

5 sCRlc-indsætningen (ca. 5,9 kb) udskæres fra pBSCRlc I

ved anvendelse af Xhol og ligateres derefter til det eneste H

Xhol-sted i vektoren pBMT3X. Den korrekte orientering af H

sCRlc-indsætningen i pBMT3X bestemmes ved restriktionsdige- H

rering (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A ' I

10 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring H

Harbor, New York). Det resulterende plasmid betegnes pBM- I

-CRlc. I

Konstruktion af udeladelsesmutanterne pT-CRlcl, Η

15 pT-CR1c2. pT-CR1c3 pT-CR1c4 og oT-CRlc5._ I

Der er også blevet konstrueret forskellige udeladel- H

sesmutanter, som specifikt udelader dele af sCRl-cDNA (fig. I

20). Hver enkelt udeladelsesmutant mangler transmembran- H

regionen i cDNA af fuld længde, således at ekspression af H

20 mutanterne vil give opløselige polypeptider. I

pT-CRlcl. I

pBSCRlc digereres med Smal, hvilket resulterer i to

fragmenter med en størrelse på 2,56 kb og 7,3 kb. Disse H

25 fragmenter adskilles ved agarosegelelektroforese, og frag- I

mentet på 7,3 kb renses og religateres til sig selv. E. H

coli DH5a-celler gøres kompetente (D.A. Morrison, 1979, Meth. I

Enzymol. 68, 326-331) og transformeres derefter med ligate- I

ringsblandingen. Det resulterende plasmid betegnes pBL-CRlcl. I

30 Denne konstruktion fjerner 38% LHR-B, 100% LHR-C og 51% I

LHR-D i CRlc-indsætningen. Desuden regenererer den Smal- I

stedet ved sammenknytningen 2335/4894 bp og opretholder I

den korrekte translationsramme. pBL-CRlcl digereres med I

Xhol, og CR1-indsætningen adskilles fra "pBluescript"-vek- I

35 toren. Det isolerede CRl-fragment indsættes derefter i det I

eneste Xhol-sced i ekspressionsvektoren pTCSgpt til produk- I

79 DK 175699 B1 tion af plasmid pT-CRlcl.

PT-CRIC2.

pBSCRlc digereres med Clal og Ball, hvilket resulterer 5 i to fragmenter med en størrelse på 3,96 kb og 5,9 kb. Disse fragmenter renses fra en agarosegel. Plasmid pBR322 digereres med Clal og Ball, og pBR322-fragmentet på 2,9 kb renses og ligateres til fragmentet på 5,9 kb fra pBSCRlc. E. coli OHS^-celler transformeres med ligateringsblandingen, og det 10 resulterende plasmid betegnes pBR8.8. Dette plasmid digereres med Xbal, hvilket frembringer to fragmenter med en størrelse på 7,45 kb og 1,35 kb. Fragmentet på 7,45 kb renses fra en agarosegel og religateres til sig selv. Det resulterende plasmid pBR7.45 digereres med Clal og Ball, og det isolerede 15 fragment på 4,5 kb indeholdende sCRl-cDNA ligateres til fragmentet på 3,96 kb fra pBSCRlc, hvilket resulterer i plasmid pBL-CRlc2. Denne konstruktion fjerner 90% LHR-B i sCRl-indsætningen, regerererer Xbal-stedet ved sammenknytningen 1637/2987 bp og opretholder den korrekte læseramme.

20 pBL-CRlc2 digereres med Xhol, og CR1-indsætningen adskilles fra "pBluescript"-vektoren. Det isolerede CRl-fragment indsættes derefter i det eneste Xhol-sted i ekspressionsvektoren pTCSgpt til produktion af plasmid pT-CRlc2.

25 PT-CR1C3.

pBSCRlc digereres med Nsil, hvilket resulterer i tre fragmenter med størrelser på 1,09 kb, 1,35 kb og 7,46 kb.

Fragmentet på 7,46 kb renses fra en agarosegel og religateres · til sig selv, hvilket frembringer plasmidet pBL-CRlc3. Denne 30 konstruktion fjerner 77% LHR-A og resten af CR1 - indsætningen. Nsil-stedet regemereres ved sammenknytningen 463/2907 bp. Translationsrammen modificeres på en sådan måde, at en non-senscodon indføres umiddelbart efter det regenererede Nsil-sted. pBL-CRlc3 digereres med Xhol, og CR1-indsætningen 35 adskilles fra '"pBluescript"-vektoren. Det isolerede CRl-fragment indsættes derefter i det eneste Xhol-sted i eks-

I DK 175699 B1 I

I

I pressionsvektoren pTCSgpt -til produktion af plasmid pT-CRlc3. I

I PT-CR1C4. I

I pBSCRlc digereres med Pstl. PstI-stedet i polylinker- I

I 5 regionen i "pBluescript" er blevet fjernet under ligatering H

af CRl-cDNA til denne vektor (ovenstående eksempel 8.1). De H

I resulterende fragmenter med en størrelse på 1,35 kb og 8,5 H

kb adskilles ved gelelektroforese, og fragmentet på 8,5 kb H

I renses og religateres til sig selv, hvilket frembringer H

I 10 plasmid pBL-CRlc4. Denne konstruktion fjerner 31% LHR-A og I

I 69% LHR-B i sCRl-indsætningen. Pstl-stedet regenereres ved

I sammenknytningen 1074/2424 pb, hvorved den korrekte læse- H

I ramme opretholdes. pBL-CRlc4 digereres med Xhol, og CRl-ind- H

I sætningen adskilles fra "pBluescript"-vektoren. Det isolerede I

I 15 CR1-fragment indsættes derefter i det eneste Xhol-sted i I

I ekspressionsvektoren pTGSgpt til produktion af plasmid pT- I

I CRlc4. I

I pT-CR1c5. I

20 pBL-CRlcl digereres med Smal, således at plasmidet I

lineariseres ved det eneste Smal-sted. Plasmidet dephospho- I

ryleres og ligateres til phosphoryleret Nhel-linker indehol- I

dende en nonsenscodon (New England Biolabs, Beverley, MA). I

Denne type linker indeholder en translationsstopcodon i H

I 25 alle tre mulige læserammer, og den indeholder ligeledes et

I Nhel-restriktionssted, hvilket letter bekræftelsen af til- H

I stedeværelsen af nonsenslinkeren i sCRl-cDNA. Det resul- H

I terende plasmid betegnes pBL-CRlc5, og det bibeholder LHR-A H

I og 62% LKR-B i sCRl-cDNA. Det resulterende plasmid betegnes H

I 30 pBL-CRlc5 digereres med Xhol, og CR1-indsætningen adskilles

I fra "pBluescript"-vektoren. Det isolerede CRl-fragment ind- I

I sættes derefter i det eneste Xhol-sted i ekspressionsvektoren I

I pTCSgpt til produktion af plasmid pT-CRlc5. I

35 Ekspression af opløselig CR1. I

I Som her vist er ekspressionen af en opløselig form H

81 DK 175699 B1 af CR1, som kan udskilles fra celler i højt udbytte, {i) ikke begrænset til ét præcist sted i den CRl-cDNA, som skal anvendes til udeladelse eller afkortning, og (ii) heller ikke begrænset til anvendelsen af en speciel ekspresionsvek-5 tor (se nedenfor). Evnen til produktion af udskilt sCRl er blevet påvist i to forskellige ekspressionssystemer.

Konstruktion af pTCS-rækken af ekspressionsvektorer. pTCS-rækken af ekspressionsvektorer, som er anvendt, 10 består af tre plasmider, hver især med et enkelt Xhol-klo-ningssted til indsættelse af cDNA (fig. 21). Transskription af den indsatte cDNA drives af et sæt af tandempromotorer.

Den tidlige SV40-promotor, som er placeret imod strømmen i forhold til den sene adenovirus-2-hovedpromotor (AD2-MLP).

15 Mellem begyndelsen af cDNA og AD2-MLP er adenovirustripar-titlederen. Transkriberede mRNA'er afsluttes ved et polyad-enyleringssignal, som tilvejebringes af de museimmunoglobu-1 in-kappa-sekvenser (Igic) , som er placeret med strømmen i forhold til Xhol-cDNA-kloningsstedet. Udvælgelige mærkestof-20 fer xanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (gpt), dihydro-folatreduktase (dhfr) eller neomycinresistens (neor) er blevet tilvejebragt ved indsættelsen af de tilsvarende mærkestoffer fra henholdsvis pSV2gpt, pSV2dhfr og pSV2neo.

Disse plasmider er også kilden til replikation af bakterie-25 oprindelse og' β-lactamasegenet for ampicillinresistens. I almindelighed afhænger valget af den af disse vektorer, som skal anvendes, af det udvælgelige mærkestof eller den kombination af mærkestoffer, som foretrækkes til udvælgelsen af rekombinanterne.

30 De komplette DNA-sekvenser er kendt for adenovirus 2 (Ad2), SV40, pSV2cat (C. Gorman, 1985, DNA Cloning, bind II, A Practical Approach, udg. D.M. Glover, IRL Press, side 143-190) og museimmunoglobulin-kappa. Sekvenser er anbragt i "GenBank"-databasen og National Biomedical Research noter 35 og henvisninger. Enhver af disse sekvenser vil også kunne tjene som kilde for de hensigtsmæssige segmenter af pTCS-

I DK 175699 B1 I

H

I I

-vektorerne. I

Vektorerne pTCSgpt, pTCSneo og pTCSdhfr er blevet I

konstrueret ud fra mellemproduktplasmiderne pEAXgpt og I

pMLEgpt som følger. I

I 5 - I

Konstruktion af pEAXgpt I

Trin 1. Ad2-MLP-DNA-fragmentet stammer fra Ml3 mp9/MLP I

I (M.F. Concino et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 8493-8496). I

Dette plasmid indeholder adenovirus 2-sekvenser af nucleo- I

I 10 tider 5778 (Xhol-sted) til 6231 (Hindlll-sted), herunder I

H PvuII-restriktionsstedet ved nucleotid 6069 og SacII-stedet I

ved nucleotid 5791 (se NBRF Nucleic database, accessionsnum- I

mer Gdad2) . Fragmentet Xhol til Hindi 11 skal klones ind i I

I Hindlll- og Sall-stederne i M13 mp9 til frembringelse af I

I 15 plasmid M13 mp9/MLP. I

I Plasmid M13 mp9/MLP digereres med EcoRI og Hindlll, I

I og det mindre fragment indeholdende MLP isoleres. Et pUC- I

-plasmid (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) digereres lige- I

ledes med EcoRI og Hindlll, og det store fragment fra dette I

20 plasmid ligateres derefter til MLP-fragmentet EcoRI til I

Hindlll. Dette resulterer i et nyt, MLP-holdigt plasmid med H

plasmidrygraden i pUC. Dette plasmid digereres med Smal,' I

ligateres til Sall-linkere og gøres igen cirkelformet. Der- I

efter digereres dette nye plasmid med PvuII, som spalter I

I 25 plasmidet ved det PvuII-sted, som er placeret i stillingen I

H 6069 i de indsatte adenovirus 2-sekvenser. Det resulterende, I

lineære fragment ligateres til Xhol-linkere og gøres igen I

I cirkelformet. Derefter digereres dette plasmid med Xhol og I

Sall, og det lille fragment indeholdende MLP-DNA isoleres I

I 30 (fragment nr. 1). I

I Trin 2. Plasmidet pSV2gpt (American Type Culture I

I Collection (ATCC) accessionsnummer 37145) digereres med I

I PvuII, ligateres til Sall-linkere og digereres med Sall. I

I Slutproduktet er et lineært pSV2gpt-fragment, som tjener I

35 som kilden til gpt-genet (fragment nr. 2). I

I Trin 3. Et museimmunoglobulin-Igit-fragment (P.A. I

83 DK 175699 B1

Hieter et al., 1980, Cell 22, 197-207) digereres med Haelll og Avail, og fragmentet indeholdende polyadenyleringssekven-serne isoleres. I den muse-Ig-kappa-sekvens, som er tilgængelig i NBRF Nucleic database (accessionsnummer Kcms) er 5 Ig-stopcodonen i stilling 1296 efterfulgt af Avail-stedet ved 1306, AATAAA-polyadenyleringsstedet ved 1484 og Haelll--stedet ved 1714. De udragende ender af dette fragment udfyldes med E. coli-DNA-polymerase, hvorefter fragmentet ligateres til Xhol-linkere og digereres med Xhol. Dette 10 fragment (fragment nr. 3) tjener som kilden til polyadeny-leringsstedet.

Trin 4. Fragmenterne 1, 2 og 3 ligateres sammen med T4-DNA-ligase til produktion af et cirkulært plasmid. Den korrekte orientering af fragmenterne i dette plasmid bekræf-15 tes ved restriktionsenzymanalyse. Med strømmen i forhold til Xhol-cDNA-kloningsstedet er muse-kappa-polyadenylerings-stedet og yderligere med strømmen fra dette sted er SV40-pro-motoren og gpt-genet. Imod strømmen i forhold til Xhol-stedet er MLP-promotoren, og yderligere imod strømmen fra denne 20 promotor er bakterieoprindelsen til replikation og ampicil-lingenet. Derefter digereres dette plasmid med Sall, og de udragende ender udfyldes med E. coli-DNA-polymerase. Det resulterende, stumpendede fragment ligateres til EcoRI-lin-kere og gøres igen cirkelformet med T4-DNA-ligase. Dette 25 slutplasmid betegnes pEAXgpt.

Konstruktion af pMLEqpt.

Trin 1. Plasmid pMLP-CAT (R.F. Lee et al., 1988, Virology, 165, 51-56) er et ekspressionsplasmid med en pML-30 -vektor-rygrad og indeholder adenovirus 2-MPL- og tripartit-ledersekvenserne 5' i forhold til CAT-genet. pMLP-CAT digereres med Xhol og SacII. Xhol opskærer ved et sted mellem CAT-genet og L3-regionen i tripartitlederen, og SacII opskærer ved stilling 5791 i adenovirus-DNA, men 5' i forhold til 35 MLP. AD2-MLP og tripartitlederen er således placeret på dette lille fragment Xhol til SacII (fragment nr. 4).

84 I

DK 175699 B1 I

Trin 2. Plasmid pEAXgpt digereres med Xhol og SacII, I

-og det lille, MLP-holdige fragment kasseres. Det store frag- I

ment (fragment nr. 5) isoleres. Fragmenterne 4 og 5, begge I

med SacII- og Xhol-ender, ligateres til produktion af plas- I

5 midet pMLEgpt. I

Konstruktion af oTCSoot. I

Trin 1. pMLEgpt digereres med SacII, og enderne ud- I

fyldes med T4-DNA-polymerase til opnåelse af et stumpendet H

10 fragment (fragment nr. 6). Dette SacII-sted er placeret ved I

nucleotid 5791 i adenovirus 2-sekvensen, 5' i forhold til I

MLP-tripartitlederen. I

Trin 2. pSV2dhfr (ATCC accessionsnummer 37146) dige-

reres med Hindlll og PvuII. Det lille fragment på 342 nu- H

15 cleotider indeholdende den tidlige SV40-promotor gøres stump- H

endet ved anvendelse af Klenow-fragmentet fra E. coli-DNA- I

-polymerase (fragment nr. 7). Fragmenterne 6 og 7 ligateres I

med T4-DNA-ligase. Restriktionsenzymanalyse bekræfter, at I

fragmenterne er korrekt orienteret til opnåelse af to tan- I

20 dempromotorer imod strømmen i forhold til Xhol-cDNA-klonings- H

stedet, og hver enkelt promotor er i stand til at prime H

RNA-syntese i samme retning. Dette plasmid betegnes pTCSgpt H

(fig. 22). I

25 Konstruktion af pTCSdhfr. I

Trin 1. pSV2dhfr digereres med HindiII og PvuII, og I

det store fragment renses derefter fra en agarosegel (frag- H

ment nr. 8) . Det lille fragment indeholdende den tidlige H

SV40-promotor kasseres. I

30 Trin 2. pTCSgpt digereres med EcoRI og udfyldes der- H

efter med Klenow-fragmentet af E. coli-DNA-pol ymer a se til H

frembringelse af stumpe ender. Derefter digereres dette H

lineære fragment med Hindlll, og det fragment (ca. 1600 H

nucleotider), som indeholder pTCS-transskriptionsenheden i H

35 SV40-promotoren, MLP, tripartitlederen, Xhol-cDNA-klonings- I

stedet, muse-IgX-sekvenserne og den anden SV40-promotor, H

85 DK 175699 B1 isoleres (fragment nr. 9). Dette fragment har en glat ende og én udragende HindiII-ende. Ligatering af fragmenterne 8 og 9 frembringer plasmidet pTCSdhfr.

5 Konstruktion af pTCSneo.

Trin 1. pSV2neo (ATCC nr. 37149) digereres med Hindlll og BamHI, og det store fragment (fragment nr. 10) isoleres.

Dette fragment indeholder plasmidrygraden og neo-genet.

Trin 2. pTCSdhfr digereres med HindiII og BamHI, og 10 pTCS-transskriptionsenheden (fragment nr. 11) isoleres fra en agarosegel efter elektroforese af digereringsprodukterne. Ligatering af fragmenterne 10 og 11 frembringer plasmidet pTCSneo.

15 Ekspression og afprøvning af plasmiderne pBSCRlc, pBSCRis og pBM-CRlc, pattedyrekspressionsvektorer indeholdende opløselige CR1-kodesekvenser._

Ekspression af CR1-konstruktioner afkortet i for- skelliqe stillinger i CRl-cDNA._ - 20 Plasmiderne pBSCRlc og pBSCRis konstrueres (ovenstå ende afsnit 11.1), således at det meste af cDNA-koderegio-nerne, undtagen transmembranregionen og den cytoplasmiske region, bevares (fig. 20) . pBNCRls er kortere end pBSCRlc, 1 da det også mangler en del af LHR-D og sCRl'er 29 og 30, som 25 er til stede i pBSCRlc. sCRl-delene af disse plasmider indsættes i pTCSgpt efterfulgt af transfektion og ekspression som nedenfor beskrevet.

Konstruktion af pBSCRlc/pTCSgpt: pBSCRlc digereres med Xhol til opnåelse af indsætningen på 5,9 kb, sCRlc.

30 sCRlc indsættes i Xhol-cDNA-kloningsstedet i pTCSgpt til produktion af pBSCRlc/pTCSgpt.

Konstruktion af PBSCRis/pTCSgpt: pBSCRis digereres med Xhol og Pvul til frigivelse af sCRl s-indsætningen. Enderne af indsætningen gøres stumpe med T4-DNA-polymerase.

35 Denne indsætning renses fra en agarosegel. Vektoren pTCSgpt digereres med Xhol, og de udragende Xhol-ender udfyldes med

I DK 175699 B1 I

I I

I E. coli-DNA-polymerase I. Dernæst ligateres sCRls-indsætnin-

I gen til den stumpendede vektor til produktion af pBSCRls/- I

pTCSgpt. I

I Plasmiderne pBSCRlc/pTCSgpt og pBSCRls/pTCSgpt dige- I

I 5 reres med Fspl, og de resulterende, linieære DNA'er trans- I

I ficeres ind i ovarieceller fra kinesisk hamster, soni er I

I mutanter i dhfr-genet (DUX Bll-CHO-celler) via calciumphos- . I

I phatsamudfældning med plasmidet pSV2dhfr. Transfektanter I

I udvælges ved hjælp af deres evne til at vokse i DHFR-udvæl- I

I 10 gelsesmedium. Ovenstående kulturvæsker af transfektantkloner I

I afprøves for udskilt sCRl ved ELISA. Ovenstående kulturvæsker I

I fra 50 pBSCRlc/pTCSgpt-rekombinanter afprøves, og de positive I

I rekombinanter føres igennem forstærkningsprocessen, ved at I

I de dyrkes i voksende koncentrationer af methotrexat. Desuden I

15 fremstilles puljer af transfektanter, ved at otte pBSCRlc/- I

pTCSgpt-transfektanter dyrkes sammen pr. pulje, og de føres I

gennem samme forstærkningsproces. Resultater af forstærknin- I

gen er vist i tabel VI. I

87 DK 175699 B1

Tabel VI

Ekspression af pBSCRlc/pTCSgpt Udskilt opløselig CR1 ^g/ml)

Klon 0 MTX 20 nM MTX 50 nM MTX 100 nM MTX 500 nM MTX

5 2* 0,7‘ 3,4 11 10,9 4 . 0,04 0,1 6 0,04 9 0,02 10 0,2 10 11 0,12 12 0,14 ' 13 0,07 14 0,2 15 0,45 1,1 7,3 9,0 15 21 0,07 30 0,27 <0,02 <0,02 35* 0) 0,82 6,3 8,4 10,9 10,9 40 0,05 41 0,05 20 50 0,12 52 0,12

Pulje 25 A 0,02 B 0,04 C 0,23 D <0,02 <0,02 E 0,27 1,1 30 F 3,6 5,8 9,1 G 0,27 H 0,04 35 * Klonerne 2 og 35 udvælges til produktion af sCRl i stor målestok.

0) Klon 35 underklones ved begrænsende fortynding, og produk-40 tionen af opløselig CR1 bestemmes for hver enkelt underklon. pBSCRlc/pTCSgpt-klon 35.6 er den kraftigste producent, idet den viser 17,7 ^g/ml sCRl.

MTX: methotrexat.

.88 I

DK 175699 B1 I

Tolv rekombinanter fra pBSCRls/pTCSgpt afprøves for H

produktion af opløselig CR1 ved ELISA. Alle tolv kandidater I

har vist påviselige niveauer af udskilt sCRl. De bedste I

producenter har givet niveauer af sCRl, som kan sammenlignes H

5 med dem, som produceres af de bedste pBSCRlc/pTCSgpt-trans- I

fektanter. H

pBSCRlc/pTCSgpt- og pBSCRls/pTCSgpt-rekombinanter I

har produceret opløselig CR1 med tilsvarende produktionsnive- H

auer. Dette viser, at evnen til produktion af et opløseligt H

10 CRl-polypeptid ikke er afhængig af et nøjagtigt afkortnings- I

punkt i CRl-cDNA. I

Ekspression af sCRlc i to forskellige ekspressions- I

systemer. H

15 Den afkortede CRl-cDNA-indsætning, sCRlc, indsættes H

i ekspressionsvektoren pTCSgpt og eksprimeres som ovenfor. H

Den indsættes også i ekspressionsvektoren pBMT3X som be- H

skrevet ovenfor i afsnit 11.2.3 til opnåelse af pBM-CRlc.

Begge disse ekspressionsvektorer har meget stærke promotorer. I

20 Ekspression af opløselig CR1 afprøves i begge systemer for I

at fastslå, om det ene system ville producere bedre udbytter I

af udskilt polypeptid. I

C127I-museceller (ATCC accessionsnummer CRL 1616, I

Rockville, Maryland) transficeres med pBM-CRlc ved anvendelse I

25 af calciumphosphatmetoden (F.L. Graham, og A.J. van der Eb, I

A.J., 1973, Virology 52, 456-467). Efter glycerolchok emæres H

cellerne igen med D-MEM-medium indeholdende 10% oksefoster- I

serum og 2 mM L-glutamin og inkuberes ved 37°C i 48 timer. H

Derefter trypsiniseres cellerne og spaltes i forhold på 1:5 H

30 og 1:10 i komplet D-MEM-medium plus 10 μΜ cadmiumchlorid. I

Cadmiumresistente kolonier viser sig i løbet af 10 døgn. Ti H

kolonier fjernes ved anvendelse af kloningscylindre. Hver ^ I

enkelt koloni overføres til en 60 ml petriskål indeholdende I

komplet D-MEM-medium og inkuberes ved 37°C, 5% C02, indtil I

35 cellerne når sammenløb. Derefter trypsiniseres cellerne for I

hver skål og opdeles i tre skåle på 60 mm, som skal anvendes I

DK 175699 B1 t i 89 · | i til fremstilling af frosne stamceller, RNA-ekstraktion og ELISA-afprøvning af cellemediet for tilstedeværelsen af udskilt sCRlc.

Når cellemediet fra hver sammenløbende petriskål 5 udtages og underkastes ELISA-analyse, er alle afprøvede pBM-CRlc-kloner positive for produktion af opløselig CR1. Niveauerne af udskilt sCRl fra pBM-CRlc-rekombinanterne kan sammenlignes med dem fra pBSCRlc/pTCSgpt-rekombinanterne.

Dette viser, at evnen til produktion af høje niveauer af 10 udskilt sCRl-polypeptid ikke er afhængig af anvendelsen af udelukkende visse promotorer eller ekspressionssystemer.

Ekspression og afprøvning af plasmiderne pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 og pT-CRlc5, pattedyr-15 ekspressionsvektorer indeholdende sekvenser, som koder opløselig CR1._ pT-CRlc-rækken af udeladelsesmutanter mangler trans-membrandomænet og det cytoplasmiske domæne, og det samme gælder konstruktionerne pBSCRlc og pBSCRls. Desuden indehol-20 der udeladelsesmutanterne også ret store udeladelser af forskellige LHR-regioner i CRl-cDNA (se fig. 20) . Udladelses-mutanterne eksprimeres i DUX Bll-CHO-celler, og de producerede niveauer af opløseligt CRl-polypeptid måles.

For hver udladelseskonstruktion udvælges fyrre for-25 skellige puljer af kloner til ELISA-analyse for at bestemme, om der produceres opløselige CRl-polypeptider. Alle fem pT--CRlc-konstruktioner viser sig at udskille sCRl i cellekulturmediet, som bestemt enten ved ELISA eller ved tilstedeværelsen af funktionel aktivitet i cellekulturmedierne.

30 Ovenstående væsker for celler transficeret med fire af de fem pT-CRlc-konstruktioner producerer sCRl, som er funktionelt som bestemt ved en hæmolytisk afprøvning (se tabel VII og nedenstående afsnit 13.2).

S

t ! , 1

I DK 175699 B1 I

I I

I Tabel Vil I

I Produktion af funktionelle sCRl-fragmenter* I

I 5 Konstruktion ELISA Hæmolytisk prøve I

I I

I pT-CRlcl I

I pT-CRlc2 + + I

pT-CRlc3 - + I

I 10 pT-CRIc4 + ikke bestemt I

I pT-CRlc5 + I

* Ovenstående væsker afprøvet for ELISA eller hæmolytiske I

I prøver fås enten fra kulturer, som vokser i T75-kolber eller I

I 15 i skåle med 24 huller. Da der under disse betingelser har I

I kunnet akkumuleres forskellige mængder af opløselig CR1 i I

de ovenstående kulturvæsker, er de viste resultater kvalita- I

I tive. {+) angiver produktion af funktionel sCRl som bestemt I

H ved den angivne afprøvning. I

I 20 _ I

Den omstændighed, at udeladelsesmutanterne også har I

være i stand til at producere opløselig CR1, har yderligere I

I vist, at evnen til ekspression af sCRl ikke er afhængig af I

25 én nøjagtig genetisk modifikation af CRl-cDNA. Når blot I

transmembranregionerne er udeladt, har alle konstruktionerne I

I været i. stand til at producere et opløseligt polypeptid. I

Eksempel: Produktion og rensning af opløselig CR1. I

30 Store mængder af sCRl produceres i et bi ore akt or system I

med hule fibre. De opnåede mængder af sCRl er proportionale I

med det relative udbytte af de podede rekombinantkloner. I

Til optimale rensningsresultater vælges der et serumfrit I

medium, som resulterer i høje produktionsniveauer af sCRl i I

35 fravær af store mængder af exogent tilsatte kalve fosterserum- I

polypeptider. I

91 DK 175699 B1

Produktion af opløselig CR1 i stor målestok.

Et "Cell-Pharm"-cellekultursystem I {CD Medical Inc.,

Miami Lakes, FL), forsynet med en bioreaktor med hule fibre (molekylvægtsafskæring 30 kD) model IV-L, samles under ste-5 rile betingelser. To kloner (klon 2 og klon 35 af pBSCRlc/-pTCSgpt) ekspanderes i otte T-225-kolber. Ved sammenløb trypsiniseres cellerne, vaskes, pelletteres og resuspenderes i kulturmedium. Ca. 5 x 10® celler af klon 2 og 10 x 10® celler af klon 35 podes i to separate bioreaktorer med hule 10 fibre. Der anvendes et næringsreservoir på 20 liter af a-MEM plus 10% kalvefosterserum, 8 mM L-glutamin, 100 μg/ml penicillin-streptomycin og den hensigtsmæssige koncentration af methotrexat (50 nM for klon 2, 500 nM for klon 35).

I forvejen blandet gas (5% C02 i luft) bobles ind i 15 reservoirmediet gennem oxygenatoren til opretholdelse af pH-værdien. Mediumrecirkulation og -udskiftning og gasstrømningshastighederne indstilles til opnåelse af maksimal produktion. Prøver høstes gennem podningsåbningerne, centrifugeres ved 1000 opm i 10 minutter, filtreres gennem et filter 20 med porestørrelse på 0,22 μτη og holdes ved 4°C før rensning. Høstvolumen og -frekvens forøges gradvis fra 25 ml tre gange om ugen ved begyndelsen af dyrkningen til 40 ml 5 gange om ugen efter 2-3 måneder. Produktionen af sCRl afprøves ved en CRl-ELISA. Udbytterne af klon 2 og klon 35 i første måned 25 efter podning er hhv. 66 /zg/dag og 1060 /zg/dag. Disse udbytter vokser, efterhånden som kulturerne bliver etablerede.

Produktion af sCRl i serumfrie medier.

To kommercielt tilgængelige, serumfrie medier afprøves 30 for deres evne til understøtning af cellevækst og produktion af sCRl. En T75-kolbe med sammenløbende klon 35 af pBSCRlc/pTCSgpt opdeles i to T75-kolber. Den ene kolbe dyrkes med a-MEM suppleret med 10% kalvefosterserum, L-glutamin, antibiotika og 500 mM methotrexat. Den anden kolbe afvænnes 35 trinvis fra 5%, 1%, 0,5% og ingen kalvefosterserum i or-MEM plus L-glutamin, antibiotika, 500 nM methotrexat plus HB-

DK 175699 B1 I

92 I

-CHO-vækstsupplement (Hana Biologies, Inc., Alameda, CA). I

Cellevæksten og sCRl-produktionsniveauerne i de to kolber I

sammenlignes. Væksten af cellerne i de serumfrie medier når I

aldrig sammenløb. Niveauerne for sCRl-produktion er vist i I

5 tabel VIII. I begge tilfælde er sCRl-produktionsniveauet I

bedst, når cellerne dyrkes i 10% kalvefosterserum. Til sam- I

menligning er niveauerne fundet på dag 14 i serumfrie medier I

1,4 x 1010 spøgelser/ml sammenlignet med 4,2 x 1010 spøgel- I

ser/ml for medier suppleret med 10% kalvefosterserum. I

10 I

Tabel VIII I

Produktion af sCRl i serumfrie medier suppleret med CHO- I

15 vækstsupplement imod medier indeholdende 10% kalvefoster-

serum* I

Dag 4 Dag 7 Dag 11 Dag 14 I

20 _ I

Kolbe 1 I

CHO-vækst- I

supplement

plus 5% FCS 1% FCS 0,5% FCS 0% FCS

25 I

2,6 2,4 2,95 1,4

30 Kolbe 2 I

10% FCS 4,8 3,85 4,3 4,2

35 * udtrykt som 1,010 spøgelser/ml I

Cellevækst og sCRl-produktion i rekombinanter er I

blevet afprøvet ved anvendelse af en anden kilde til serum- I

40 frie medier (CHO-1, Ventrex Laboratories, Inc., Portland,

ME) . Da det ikke er nødvendigt at afvænne serumdyrkede celler M

i disse medier, optøs cellerne og dyrkes direkte i de serum- I

frie medier. Disse medier består af en DME-F12-base og et I

vækstadditiv. Lige store antal celler optøs og podes i sepa-

45 rate huller i en plade med 24 huller. Efter at cellerne har M

fæstnet sig, kasseres mediet, og der sættes enten medium H

93 DK 175699 B1 indeholdende 10% kalvefosterserum eller serumfrit medium til hensigtsmæssige huller. Hver enkelt betingelse gennemføres i dobbeltforsøg. Til forskel fra de tidligere afprøvede, serumfrie medier har CHO-l-medierne fra Ventrex Laboratories 5 givet tilsvarende niveauer for cellevækst som de kalvefoster-serumholdige medier.

Konklusioner.

De ovenfor beskrevne resultater viser, at sCRl-pro-10 ducerende CHO-celler har kunnet holdes i et defineret,-serumfrit medium. Dette har resulteret i en besparelse i omkostningerne til dyrkningsmedier til produktionsforsøg i stor målestok. En yderligere fordel er, at rensning af sCRl fra de ovenstående cellekulturvæsker er blevet simplificeret, 15 idet der ikke er kalvefosterserumproteiner, som skal fjernes.

Rensning af opløselig CR1.

Med fremkomsten af specifikke anti-CRl-antistoffer er det blevet muligt at erstatte de mange chromatografiske 20 trin, som har været nødvendige til fremstilling af renset CR1, med en simplificeret totrinsmetode. Dette har forøget de udbytter af CRl-proteiner, som har kunnet opnås, til ca.

1-5 mg CR1 pr. 5,9 x 1013 erythrocyter (W.W. Wong et al., 1985, J. Immunol. Methods 82, 303-313). Da den rapporterede 25 rensning har været af membranbundne former af CR1, har det . imidlertid altid været nødvendigt at opløseliggøre det CR1-holdige materiale i detergenter.

Opløselig CR1 produceret af rekombinanttransfektanter · behøver ikke at blive gjort opløselig med detergenter til 30 rensning, den er allerede opløselig. Selv om opløselig CR1 kan renses ved anti-CRl-antistof-chromatografi (se nedenfor), lader denne metode sig ikke let anvende ved produktion i stor målestok. Udstrækningen af målestoksforøgelse er begrænset af den mængde anti-CRl-antistof, som kan opnås til frem-35 stilling af antistofgrundmassen i antistofrensningskolonnerne. Desuden betyder den høje bindingsaffinitet for CR1

I DK 175699 B1 ; I

I 94 I

I af et sådant antistof som YZ-1, at der skal anvendes temmelig I

I barske betingelser, f.eks. pH 12,2, for at fjerne det bundne I

I sCRl-produkt fra antistofgrundmassen (W.W. Wong et al., 1985, | I

I J. Immunol. Methods 82, 303-313). I

I 5 For at opnå kapacitet til rensning af meget store I

I mængder opløselig CR1 er der blevet udviklet rensningerneto- I

I der, som involverer HPLC-kolonner. Disse HPLC-kolonner kan I

I let forstørres op til produktion af endnu større mængder I

I renset, opløselig CR1. Desuden kræver de ikke barske betin- I

10 gelser til elueringen og udvindingen af sCRl. I

I Antistofaffinitetskolonnerensninq. I

Metoder. I

Til antistofaffinitetsrensning af sCRl kobles 100 mg I

I 15 monoklonalt antistof YZ-1 covalent til 7 mg "AffiGel-10" I

I (BioRad, Richmond, CA) efter fabrikantens instruktioner. I

CRl-holdig, ovenstående væske fra cellekulturer inkuberes I

I med det immobil i serede YZ-1 i en kolbe, som vugger natten I

over ved 4°C. Materialet hældes i en glaskolonne og vaskes I

H 20 extensivt med 10 mM Hepes, 0,1 M NaCl, pH 7. sCRl elueres I

ved anvendelse af 20 mM natriumphosphat, 0,7 M NaCl, pH 12 I

I (S.H. Yoon og D.T. Fearon, 1985, J. Immunol. 134, 3332-3338). I

. Eluerede fraktioner afprøves for tilstedeværelse af protein I

ved anvendelse af Biorad-proteinprøven (BioRad, Richmond, I

25 CA). Prøver indeholdende protein slås øjeblikkeligt i pulje I

og dialyseres i 0,1 M Hepes, pH 7, natten over (2x1 liter) I

ved 4°C. Derefter dialyseres prøven i PBS. Tilstedeværelse I

. af sCRl analyseres ved CR1-ELISA. I

30 Resultater. I

H Ovenstående cellekulturvæske indeholdende sCRl produ- I

. ceret af pBSCRlc/pTCSgpt-transfektantklon 2 fyldes på anti- I

-CRl-antistofaffinitetskolonnen, og sCRl-spidsfraktionerne I

H slås i pul.je. En portion af dette rensede materiale gen- I

I 35 nemløber en 4-20%'s SDS-PAGE-gel (DAIICHI; Inc., polyacryl- I

H amidgeler; modificeret metode ifølge U.K. Laemmli, 1970, I

DK 175699 B1 j 95

Nature 227, 680-685). Under reducerende betingelser er den tilsyneladende molekylvægt af opløselig CR1 ca. 224.000 dalton (fig. 24). Det er også blevet vist; at denne rensede CR1 er, aktiv ved dens evne til at inhibere komplementmedieret 5 hæmolyse samt C5a- og C3a-produktion (nedenstående afsnit 13) .

CR1-rensning ved HPLC.

Metoder.

10 Udgangsmateriale.

Når kulturer først er etableret i bioreaktorerne, er niveauerne for sCRl-produktion lavere, énd når kulturerne er blevet dyrket i nogle måneder. Almindeligvis er der en periode på nogle uger, før cellerne i bioreaktoren når sam-15 menløb og producerer, maksimale niveauer af sCRl - Ovenstående cellekulturvæsker med lave niveauer af sCRl har kunne koncentreres før rensning ved enten ammoniumsulfatudfældning eller ved ultrafiltrering. Ammoniumsulfatfraktionering af ovenstående væsker over intervallet 60-80% mætning udfælder 20 sCRl i praktisk taget ækvivalente udbytter. Udfældningen opløses i. et minimalt volumen og dialyseres i udgangspuffer for kationbytter-HPLC. Alternativt har de ovenstående CHO--cellekulturvæsker kunnet koncentreres ved ultrafiltrering og dialyseres i udgangspuffer til kationbytterchromatografi.

25 Efterhånden som bioreaktorerne producerer højere koncentrationer af opløselig CR1, har de ovenstående CHO--cellekulturvæsker fra disse kulturer kunnet dialyseres direkte i udgangspuffer til kationbytterchromatografi.

30 Kationbvtter-HPLC-metode.

Prøver dialyseres i udgangspuffer (0,02 M natrium-phosphat, 0,06 N natriumchlorid, pH 7,0) og filtreres derefter gennem et 0,2 μνα filter til fjernelse af eventuelt partikelformet materiale. Derefter fyldes prøven på en kation-35 bytterhøj tryksvæskechromatograf ikolonne (10 cm x 10 mm, "Hydropore®-scX" HPLC-kolonne fra Rainin). Kolonnen vaskes

I DK 175699 B1 I

1 96 I

I og elueres med natriumchloridgradient fremkaldt ved anven- I

I delse af 0,02 M phosphat, 0,5 N NaCl, pH 7,0. sCRl eluerer I

I et sted mellem 0,06 N og 0,25 N NaCl. Elueringen overvåges I

I ved absorptionen ved 280 nm og ved ELISA. I

I 5 I

I Anionbvtter-HPLC-metode. I

I Om ønsket kan yderligere rensning af den kation-HPLC- I

I rensede sCRl opnås ved anion-HPLC. Spidsfraktioner fra ka- I

I tion-HPLC dialyseres i udgangspufferen for anion-HPLC. Prøver I

I 10 fyldes på, og kolonnen ("Hydropore®-AX" fra Rainin) vaskes I

I i 0,01 M phosphat, pH 7,5. Kolonnen elueres med en række trin I

I og gradienter fremkaldt ved anvendelse af 0,01 M phosphat, I

0,5 N NaCl, pH 7,5. sCRl eluerer et sted mellem 0,0 N og I

I 0,3 N NaCl. Elueringen overvåges som før for kationbytter- I

I 15 -HPLC. Koncentrationerne og pH-værdien af kation- og anion- I

-HPLC-kolonnepufferne er kun anført som eksempler. Andre I

I . pufferkoncentrationer, saltbetingelser eller pH-betingelser I

I vil også virke. ' I

H 20 Western-pletanalvse. I

Western-pletning gennemføres ved anvendelse af en I

modificeret metode fra H. Towbin et al., 1979, Proc. Natl. I

I Acad. Sci. USA, 76, 43 50-4354. Kort fortalt køres renset I

I sCRl på en 4-20%’s SDS-PAGE, overføres til nitrocellulose, I

25 sonderes specifikt med anti-CRl (muse-mAb-YZ-1 eller J3D3) I

H og påvises med gede-anti-muse-antistof konjugeret med alka- I

lisk phosphatase. I

Resultater. I

I 30 Til et typisk forsøg dialyseres 50-100 ml ovenstående I

I væske fra en bioreaktorkultur i udgangspuffer og fyldes på I

en 10 cm x 10 mm kationbytter-HPLC. Spidsfraktionerne bestem- I

mes ved ELISA og absorption ved 280 nm og slås i pulje. I

Proteinkoncentrationen i puljen bestemmes ved absorption I

I 35 ved 280 nm (e (1 %) ved 280 nm = 10, som vurderet ud fra CRlc- I

-aminosyresammensætningen). Nogle gange 10 mg renses ud fra I

97 DK 175699 B1 100 ml forstærket, ovenstående kulturvæske.

Som et eksempel har 100 ml ovenstående kulturvæske fra pBSCRlc/pTCSgpt-transfektantklon 2 produceret 22 mg renset sCRl, som bestemt ved absorption ved 280 nm, når der 5 renses ved kation-HPLC (fig. 24). Overvåget ved CR1-ELISA er udbyttet beregnet til at være 202% med yderligere 13% i gennemstrømnings- eller kolonnevaskefraktionen. Udbyttet på over 100% genspejler sandsynligvis grundmassevirkninger ved ELISA.

10 I de mængder, hvor ovenstående kulturvæske kan udtages fra en bioreaktor, bør det være muligt på dette niveau af methotrexatforstærkning at producere ca. 100 mg renset, opløselig CR1 pr. uge pr. bioreaktor. Nogle måder, på hvilke dette produktionsniveau kan bringes op i målestok, omfatter 15 forstærkning af udgangskulturerne i maksimal udstrækning med methotrexat før podning af bioreaktoren, forøgelse af antallet af bioreaktorer, som producerer på et vilkårligt tidspunkt, og anvendelse af HPLC-kolonner med større kapacitet.

20

Karakterisering af renset, opløselig CR1.

Den sCRl-holdige spidsfraktion fra kation-HPLC (fig.

24) renses yderligere på en anion-HPLC. Renheden af sCRl--materialet på de forskellige trin afprøves ved SDS-PAGE 25 (fig. 25) . De mindre bånd, som ses i disse tungt belastede geler, repræsenterer fragmenter af sCRl som bestemt ved Western-pletanalyse ved anvendelse af monoklonale anti-CRl--antistoffer, YZ1 eller J3D3. Fragment-sCRl-båndene ses ikke i de fleste præparater.

30 Den funktionelle aktivitet af renset . sCRl afprøves ved dens evne til at inhibere klassisk, komplement medieret hæmolyse med 50% ved en koncentration af renset sCRl på 0,25 μg/ml. Den rensede, opløselige CR1 er også i stand til at inhibere klassisk komplement-C5a-produktion med 50% ved 35 5 Mg/ml og C3a-produktion med 50% ved 13 /ig/ml (se nedenstå ende afsnit 13).

I DK 175699 B1 I

I I

I 98 I

Konklusioner. I

I Som ovenfor beskrevet er der udviklet en forbedret I

I metode til rensningen af opløselig CR1, en metode, som let I

kan forstørres op til produktion af de mængder af sCRl, som I

5 er nødvendige til terapeutiske anvendelser. De grundlæggende I

I elementer til denne metode omfatter et udgangsmateriale, I

I i som allerede er opløseligt, således at kravet om opløselig- I

gørelse af membranbundet CR1 med detergenter er elimineret. I

I Formindskelsen af kalvefosterserumkoncentrationerne· i biore- I

I 10 aktorkulturerne og/eller anvendelsen af alternative kultur- I

I medier i disse kulturer har elimineret behovet for fjernelse I

I af høje koncentrationer af udefra kommende proteiner fra I

det sCRl-holdige udgangsmateriale under efterfølgende rens- I

I ning. Endvidere har udviklingen af en HPLC-metode til rens- I

H 15 ning tilvejebragt en metode til rensning i stor målestok. I

I Enten kation-HPLC eller en kombination af kation-HPLC efter- I

fulgt af anionbytter-HPLC kan anvendes til rensning. Praktisk I

I ren, opløselig CR1 i højt udbytte kan opnås ved denne metode I

I i kun ét eller to trin. I

20 I

I Eksempel: -Påvisning af aktivitet in vitro af opløse- I

I lig CR1. I

I Inhiberinq af det oxidative neutrophiludbrud. I

I Ved reperfusionsskademodellen for vævsbeskadigelse I

I 25 pådraget under en myocardial infarction tilskynder aktiverede I

H komplementkomponenter neutrophiladhæsion og -aktivering. I

Den aktiverede neutrophil undergår et oxidativt udbrud, som I

skaber yderst toxiske oxygenradikaler. Disse og andre poten- I

tielle toxiner frigives under neutrophildegranulering, hvil- I

H 30 ket beskadiger det omgivende væv. Opløselig CR1 kan nedsætte I

arealet med beskadiget væv ved at forhindre skabelsen af I

C3a og C5a, de komplementkomponenter, som er involveret i I

neutrophilaktivering. I

H Til overvågning af evnen hos opløselig CR1 til bloke- I

35 ring af skabelsen af C5a under komplementaktivering in vitro I

I er der blevet anvendt en bioafprøvning, som kan kvantificere I

99 DK 175699 B1 skabelsen af oxygenradikaler produceret af netrophiler under et C5a-tilskyndet oxygenudbrud (D.A. Bass et al., 1983, J. Immunol. 130, 1910-1917). Denne afprøvning anvender dichlor-fluorescindiacetat (DCFDA), et lipidopløseligt molekyle, 5 som kan vandre ind i celler, blive indfanget og blive kraftigt fluorescerende ved oxidation.

Materialer og metoder.

Materialer.

10 Frisk helblod, humane komplementkilder (Beth Israel

Hospital, Boston, MA), tørret bagerigær, PBS med 0,1% gelatine og 5 mM glucose, 100 mM EDTA, 10 mM DCFDA i HBSS (Kodak), puffer, som lyserer røde blodlegemer (RBC) (Ortho Diagnostics), renset C5a (Sigma Chemical Co., St. Louis, 15 MO) og opløselig CR1 er blevet anvendt.

Fremstilling af neutrophiler.

Neutrophiler er blevet fremstillet som beskrevet af D.A. Bass et al., 1983, J. Immunol. 130, 1910-1917. 2,0 ml 20 helblod vaskes tre gange i PBS-gelatine-glucose, resuspende-res i 5 ml 10 μΜ DCFDA i HBSS plus 5 ml PBS-gelatine-glucose og inkuberes i 15 minutter ved 37°C. Cellerne centrifugeres derefter og resuspenderes i 2,0 ml PBS-gelatine-glucose plus 5 mM EDTA.

25

Fremstilling af gærpartikler.

Tørret bagerigær resuspenderes i H2O, vaskes to gange og koges i 30 minutter. Partiklerne vaskes igen to gange i H20 og resuspenderes med 0,5 g/ml i H20 (P.J. Simpson et 30 al., supra).

Aktivering af neutrophiler med renset C5a.

100 μΐ DCFDA-belastede celler behandles med RBC-lyse-rende puffer, vaskes én gang i PBS-gelatine-glucose-EDTA og 35 resuspenderes i 1,0 ml PBS-gelatine-glucose. 50 μΐ renset C5a med 200 ng/ml eller kontrol tilsættes til 0,5 ml mål-

I ; DK 175699 B1 I

I 100 I

celler ved 37°C og analyseres på et strømningscytometer ved I

I forskellige tidsintervaller. I

I Aktivering af neutrophiler med renset C5a i humant I

I 5 serum eller plasma. I

I 100 μΐ DCFDA-belastede celler inkuberes med 50 μΐ I

I C5a fortyndet 1:1 i humant serum eller hepariniseret plasma I

I (100 ng/ml) eller kontrol ved 37°C i 30 minutter. RBC lyseres I

H ud, og neutrophilerne analyseres på et strømningscytometer. I

I 10 I

I Aktivering af neutrophiler med gæroartikelaktiveret. I

humant serum eller plasma. I

425 μΐ, frosset serum og plasma plus 50 μΐ sCRl eller I

I kontrol inkuberes med 25 μΐ gærpartikler ved 37°C i 30 minut- I

15 ter. De komplementaktiverede prøver og kontrolprøverne een- I

trifugeres derefter til fjernelse af gaerpartiklerne. Ti 2 I

ganges fortyndinger af hver af disse prøver gennemføres i I

PBS-gelatine-glucose-EDTA. 50 μΐ af hver seriefortynding I

af kontrol og aktiveret serum og plasma sættes til 50 μΐ I

20 DCFDA-belastede målceller og inkuberes ved 37°C i 30 minut- I

ter. Derefter lyseres RBC ud, og neutrophiler analyseres I

ved strømningscytometri. I

Resultater. I

25 C5a tilskynder et oxyqenudbrud i humane neutrophi- I

ler, hvilket kan måles ved anvendelse af DCFDA. I

Fig. 26 viser en hurtig stigning i fluorescensinten- I

sitet af de humane neutrophiler efter stimulering med renset I

C5a. I løbet af 4 minutter efter tilsætning af C5a (slutkon- I

30 centration 20 ng/ml) er neutrophilerne 10 gange klarere end I

H DCFDA-belastede kontrolneutrophiler. Efter 20 minutter er I

H neutrophilerne 20 gange så klare som kontrollerne. Denne I

H afprøvning ser ud til at være en følsom indikator for C5a. I

Η I

101 DK 175699 B1

Humant serum blokerer oxvgenudbrudsvirkningerne af renset C5a på neutrophiler.

Der iagttages ingen stigning i fluorescensintensitet i neutrophiler belastet med DCFDA og inkuberet med renset 5 C5a fortyndet i humant serum. Denne virkning kan skyldes, at vækstfaktor stammende fra blodplader (PDGF) frigives fra plader under koagulering. Det er blevet vist, at lave niveauer af PDGF kan inhibere C5a-tilskyndet neutrophilaktivering (E. Wilson et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 10 2213-2217).

Hepariniseret plasma blokerer ikke virkningerne af C5a på neutrophiler.

C5a fortyndet 1:1 i hepariniseret plasma tilskynder 15 et oxygenudbrud i DCFDA-belastede neutrophiler. Selv om stigningen ikke er så dramatisk som C5a i puffer, er der en stigning på 10 gange i fluorescensintensitet efter en 30 minutters inkubering med neutrophilerne. Det nedsatte signal kan være forårsaget af PDGF-frigivelse under phlebotomi 20 eller plasmaisolering. Mildere .og hurtigere isolering af plasmaet fra blodets cellekomponenter kan minimere frigivelsen af PDGF og tillade bedre-C5a-funktion.

sCRl til stede under komplementaktivering blokerer 25 C5a-skabelse.

Zymosantilskyndet aktivering af humant komplement i nærværelse af opløselig CR1 viser nedsat C5a-aktivitet som målt med DCFDA-afprøvningen. Som det kan ses i fig. 27, har en fortynding med på 1:16 af humant plasma aktiveret i nær-30 værelse af sCRl frembragt en fluorescensintensitetstigning i neutrophil erne, som er 70% mindre end i plasma fortyndet 1:16 og aktiveret uden sCRl til stede. Dette indebærer, at sCRl inhiberer C5a-skabelsen. Yderligere optimering af DCFDA--afprøvningen og plasmaindsamlingen burde resultere i en 35 mere dynamisk og følsom afprøvning for aktivitet af opløselig CR1.

I . DK 175699 B1 i I

I I

I 102 I

I Inhiberina af komplementmedieret hæmolyse. I

I Metoder. I

I Evnen til inhibering af komplement er blevet afprøvet I

I ved en prøve for inhibering af komplementmedieret lyse af I

I 5 røde blodlegemer (hæmolyse). Inhiberingen af hæmolyse er I

I blevet bestemt som en funktion af koncentrationen af opløse- I

I lig CR1. De sCRl-prøver, som skal afprøves, fortyndes i 0,1 I

I M Hepes-puffer (0,15 N NaCl, pH 7,4), og 50 μΐ sættes til I

hvert hul i en mikrotiterplade med V-bund, typisk som tredob- I

I 10 belte forsøg. Humant serum, anvendt som komplementkilden, I

I fortyndes 1:125 i Hepes-puffer, og 50 μΐ sættes til hvert I

I hul. Derefter anvendes kommercielt tilgængelige fåreerythro- I

I cyter med anti-fåre-antistof (Diamedix katalog nr. 789-002) I

I som leveret og tilsættes med 100 μΐ pr. hul til initiering I

15 af den komplementvej, som fører til hæmolyse. Pladen in- I

I kuberes i 60 minutter ved 37°C og centrifugeres derefter I

ved 500 x g i 10 minutter. De ovenstående væsker udtages og I

I anbringes i en fladbundet mikrotiterplade. Udstrækningen af I

H hæmolyse måles som en funktion af prøveabsorptionen ved 410 I

20 nm. Den maksimale absorption (svarende til maksimal hæmo- I

I lyse) , Amax, opnås ud fra absorptionen af en erythrocytprøve, I

som kun indeholder humant serum, Ag, minus absorptionen af I

en prøve, som kun indeholder.de røde blodlegemer, Aq. Derfor I

er Amax = As - Aq . - Differensen mellem absorptionen af en I

H 25 erythrocytprøve indeholdende både humant serum og sCRl og I

absorptionen af en celleprøve, som kun indeholder sCRl, I

defineres som Aprøve. Inhiberingen, IH, udtrykkes som brøken I

I iAmax_Aprøve/^max^ » °9 IH50 defineres som den koncentration I

H af sCRl, som er nødvendig til at frembringe en IH-værdi på I

H 30 en Til overvågni-ng af chromatografifraktioner medtages I

de serumfrie kontroller ikke, og anti-komplementaktivtet I

overvåges kvalitativt som en nedgang i prøvens absorption I

ved 410 nm. I

Den ovenfor beskrevne hæmolyseprøve er også blevet I

35 anvendt til vurderingen af evnen hos human rekombinant-sCRl I

H til inhibering af lyse af røde blodlegemer fra får ved hjælp i 103 DK 175699 B1 af komplement fra andre dyrearter, såsom marsvin og rotter.

For hver enkelt art er frisk, frosset serum eller frisk, lyophiliseret serum eller plasma blevet anvendt som komplementkilde. I nogle tilfælde er sera opnået kommercielt .{Sigma 5 Chemical Company, St. Louis, MO).

Først titreres serummet for dets evne til lyse af aktiverede, røde blodlegemer. Den største fortynding, som giver mindst 80% maksimal lyse af røde blodlegemer, udvælges til vurdering af virkningerne af tilsat, human sCRl. Derefter 10 gennemføres prøven som ovenfor beskrevet, idet dyreserum erstatter humant serum ved den foretrukne fortynding.

Resultater.

Som vist i fig. 28 inhiberer renset sCRl klassisk, ! 15 komplementmedieret lyse med 50% ved en sCRl-koncentration ' på 0,12 μg/ml. Evne hos antistofaffinitetsrenset sCRl til inhibering af hæmolyseprøven er blevet sammenlignet med evnen hos urenset materiale (sCRl indeholdende ovenstående cellekulturvæske). Den rensede sCRl har en aktivitet, som 20 kan sammenlignes med den hos den urensede sCRl, idet begge frembringer 50% inhibering ved hæmolyseprøven ved 1,6 x 108 spøgelser/ml. Dette viser, at rensningsprocessen ikke i væsentlig grad nedsætter den funktionelle aktivitet hos slut -sCRl-produktet.

25 For at bestemme, om renset sCRl kan opbevares frosset, er en portion blevet opbevaret ved -70°C i en uge. Koncentrationen af den frosne sCRl er den samme som af ikke-frosset sCRl, som bestemt ved absorption ved 280 nm og CR1-ELISA.

Den frosne sCRl har også samme aktivitet som den ikke-frosne 30 sCRl, som bestemt ved inhibering af hæmolyse.

Evnen hos human rekombinant-sCRl til inhibering af hæmolysen medieret af komplement fra forskellige dyrearter er opsummeret i tabel IX.

35 Η Η

I DK 175699 Β1 I

; 104 I

I 1 Tabel IX I

Hæmolyse af sensibiliseret fåre-RBC ved anvendelse af korrple- I

I ment fra forskellige dyresera I

I

I Anvendt slut- Inhibering IH50** I

I koncentration Inhibering (IH)** (spøg- I

I Dyr af serum af sCRl (spøgelse/ml) else/ml) I

; 10 Marsvin* 1:500 Ja 66%(2,6xl09) Ι,ΟχΙΟ9 I

I Menneske 1:500 Ja 94%(2,5xl09) 2,0xl08 I

Menneske 1.312 Ja 94%(l,2xl09) Ι,ΟχΙΟ7 I

I i Rotte 1:200 Ja 85%(2,6xl09) 2,4xl08 I

Rotte* 1:200 Ja 77%(3,8xl09) Ι,ΟχΙΟ9 I

I : 15 Hund 1:50 Nej I

I Kanin* 1:20 Nej I

I Mus* 1:5 Nej I

I

* lyophiliserede sera opnået kommercielt (Sigma I

H 20 Chemical Co., St. Louis, MO. I

** som defineret i teksten (afsnit 13.2.). I

Både marsvine- og rottekomplement ser ud til at blive I

inhiberet af human sCRl. Manglen på tydelig inhibering for I

25 andre dyrearter kan genspejle (a) uhensigtsmæssigheden ved I

anvendelse af kaninantistoffer og fåreerythrocyter i afprøv- I

ningssystemet eller (b) den høje koncentration af serum, I

som er nødvendig til. hæmolyse i dette system. I

30 Inhibering af C3a- og C5a-produktion. I

I Metoder. I

Evnen til inhibering af komplement er også blevet I

H afprøvet ved afprøvning for specifik inhibering af C3a- og I

H C5a-produktion. Til alle forsøg er en enkelt pulje af humant I

35 serum, som skal anvendes som kilde for komplement, blevet I

opdelt i portioner og opbevaret frosset ved -70°C. Humant I

IgG varmeaggregeres, opdeles i portioner og opbevares frosset I

ved -70°C. Til hvert enkelt forsøg ækvilibreres serumpor- I

H tioner ved 37°C med varierende koncentrationer af den sCRl, I

105 DK 175699 B1 som skal afprøves. Komplement vej en initieres ved tilsætningen af aggregeret, humant IgG. Kontrolprøver uden indhold af IgG medtages altid. Efter en fast reaktionstid på 15 minutter (bestemt ved et tidligere tidsforløbstudium til tilvejebrin-5 gelse af et hensigtsmæssigt tidsrum, i løbet af hvilket produktionen af C5a eller C3a er næsten komplet, dvs. over 90%) bestemmes niveauerne af de frigjorte komplementpeptider (C5a eller C3a) ved radioimmunoafprøvning ved anvendelse af kommercielt tilgængelige radioimmunoafprøvningssæt (RIA) 10 (C5a-RIA, Amersham katalog nr. RPA.520; C3a-RIA, Amersham katalog nr. RPA.518) ved modificerede metoder.

Da .der anvendes en konkurrerende immunoafprøvning, varierer koncentrationerne af kompleméntpeptid (C5a og C3a) omvendt med tællingerne. De tællinger, som er bundet (CB) 15 for en prøve, er defineret som de totale tællinger (i tællinger pr. minut, cpm) målt i pelleten.

Y-Aksen i fig. 29 repræsenterer inhiberingsbrøken. Inhiberingsbrøken er lig med de bundne tællinger (CB) for en "prøve" minus CB i "prøven med sCRl" divideret med CB for 20 "ingen IgG, kontrol" minus CB i "prøven uden sCRl".

I [ (CB prøve) - (CB uden sCRl)]

Inhibering = - [(CB uden IgG) - (CB uden sCRl)] 25

Resultater.

Aktiviteten af renset sCRl er blevet afprøvet ved afprøvning af dens evne til inhibering af C5a- og C3a-produk-tion i en aktiveret prøve af humant serum.

30 Som vist i fig. 29 er renset sCRl under de afprøvede betingelser i stand til maksimalt at inhibere C5a-produk-tionen med 100% og C3a-produktionen med 60%. Inhibering på 50% iagttages ved sCRl-koncentrationer på 5 /zg/ml for C5a--produktion og 15-20 μg/ml for C3a-produktion. Disse data 35 antyder, at rekombinant-sCRl inhiberer C5-konvertasen mere effektivt end C3-konvertasen.

I DK 175699 B1 I

I 106 I

I Eksempel: Påvisning af funktionel, terapeutisk ak- I

tivitet in vivo af opløselig CR1. I

I Opløselig CR1 udviser funktion in vivo ved en om- I

I vendt, passiv arthus-reaktion._ I

5 Arthus-reaktionen er en klassisk, immunologisk til- ’ I

I skyndet betændelsesreaktion, som forårsages ved lokal injek- I

I tion af antigen, som derefter reagerer med antistoffer i I

I cirkulation. Den biologiske hovedreaktion er karakteriseret I

I ved immunkompleksafsætning, komplementfiksering, polymor- I

10 phonuclear (PMN) leukocytinfiltrering, frigivelse af lysoso- I

I male enzymer, vasoaktiv amin og lokal vævsbeskadigelse (T. I

I Uriuhura og H.Z. Movat, 1966, Exp. Mol. Pathol. 5, 539-558; I

I C.G. Cochrane, 1968, Adv. Immunol. 9, 97-162). En modifika- I

tion af den direkte Arthus-reaktion, den omvendte, passive I

15 Arthus-reaktion (RPAR) , er blevet anvendt som en model til ; I

identifikation af antiinflammatoriske midler (L.R. Pflum og I

I M.I«. Graeme, 1979, Agents and Actions 9, 184-189) . Ved en I

RPAR injiceres antistof lokalt, og antigen er til stede i I

cirkulationen. I

20 Afprøvet ved en rotte-RPAR-model har opløselige CRl'er I

været i stand til at blokere den lokale betændelsesreaktion. I

Virkningsmekanismen ved denne funktion af opløselig CR1 in I

vivo kan medieres via inhiberingen af komplementvejsenzymer. I

25 Materialer og metoder. I

Fem uger gamle Sprague Dawley hunrotter (stamme CD), I

som vejer ca. 100-125 g (Charles River Laboratories, Wil- I

H mington, MA) , bedøves med en intraperitoneal injektion af I

H 0,1-0,3 ml "Avertin''-opløsning. Denne opløsning er l:2-for- I

30 tynding af en stamopløsning fremstillet med 1 g tribrometha- I

nol i 15 ml "Amel"-ethanol. Pelsen på dyrenes rygge barberes I

H af. Derefter opvarmes halen, først med varmt vand og derefter I

med en varmelampe. Ved anvendelse af en 1 ml sprøjte in- I

jiceres 0,35 ml ovalbumin (Calbiochem Corp., San Diego, CA) I

H 35 med 5 mg/ml i 0,15. M phosphatpufret saltopløsning (PBS) I

intravenøst i halevenen, ca. 2,5-5 cm fra halespidsen. 5 I

107 DK 175699 B1 minutter senere injiceres rotterne intradermalt med 0,08 ml af en 20 mg/ml kanin-Ig-fraktion af anti-ovalbumin-antistof med en antistoftiter på 4 mg/ml (Organon Teknika Corp., Cappel Division, West Chester, PA) eller med 0,08 ml af 20 5 mg/ml kanin IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) eller med PBS. Hver enkelt injektion gennemføres som dobbelt forsøg, og arealerne rundt om injektionen cirkles ind med mærkepen. Derefter overvåges rotterne 1, 4 og 18 timer. Efter 24 timer' dræbes rotterne, ved at de neddyppes i tøris i 3 minutter.

10 Hudprøver udskæres fra injektionsstederne. Den ene af dobbeltprøverne fikseres i 10%'s formalin til paraffinindlejring, og den anden fryses til kryostatsnit. Vævsnit fremstilles og farves med hæmatoxylin og eosin.

15 Resultater.

En svag RPAR-reaktion (f.eks. oedema og erythema) begynder at blive synlig efter 3-5 timer efter intradermal injektion af anti-ovalbumin-antistof. Intensiteten af reaktionen vokser gradvis, indtil reaktionens størrelse når en 20 diameter på 3-5 mm efter 24 timer (fig. 30b). Der iagttages ingen reaktioner i rottehuden, hvor der kun injiceres ikke--immun kanin-IgG eller PBS.

Ved mikroskopisk undersøgelse af vævssnit præpareret ud fra læsionsstedet er mange, akutte betændelsesceller 25 synlige i huden, især rundt om blodkarrene (fig. 31b) dette erkendes typisk som vaskulitis og perivaskulitis. Vævet viser en typisk betændelsestilstand med ekstensiv infiltrering af PMN uden for blodkarrene, tilstedeværelsen af ery-throcyter i bindevævet og løsnen af collagenfibre.

30

Virkning af intradermal indgivelse af opløselig CR1.

En blanding af renset sCRl fremstilles ved kombination af 40 μΐ 0,75 mg/ml sCRl med samme volumen anti-ovalbumin eller normal kanin-IgG eller PBS. Enten sCRl:anti-ovalbumin-35 -blandingen eller sCRl:kanin-IgG-blandingen eller sCRl:PBS--blandingen injiceres intradermalt i intravenøst ovalbumin- I DK 175699 B1

I 108 I

I primede rotter. Kun lige synlige læsioner udvikles i de I

injektionssteder, som får sCRl plus anti-ovalbumin-antistof I

I (fig. 30a). Som forventet udvikles der ingen læsioner i de I

I injektionssteder, som får sCRl:kanin-IgG eller sCRl:PBS. I

I 5 Når snit af væv, som omgiver sCRl:anti-ovalbumin-injektions- I

I stederne, undersøges mikroskopisk, har der kunne findes I

I klynger af PMN og mononuclearé celler rundt om venulerne, I

I men der er ingen ekstensiv infiltrering af PMN eller ekstra- I

I vasation af erythrocyter (fig. 31a) . Disse data viser, at I

I 10 indgivelse af opløselig CRl bevirker en inhibering af be- I

skadigelse af endothelcellerne og en inhibering af betændel- I

I sesreaktionen. I

I Til bestemmelse af den effektive minimumdosis af I

I sCRl, som er nødvendig til blokering af en RPAR ved ovenstå- I

I 15 ende ovalbumin-rot te-model, er ti gange seriefortyndinger I

I (ren, 1/10, 1/100, 1/1000 og 1/10.000) af sCRl-stamopløs- I

ningen på 0,75 mg/ml blevet afprøvet. Hver enkelt sCRl-for- I

tvnding blandes med samme volumen rent eller en halv gang I

fortyndet anti-ovalbumin-antistof. Hvert sted injiceres med I

I 20 totalt 80 μΐ. Evnen hos sCRl til inhibering af RPAR er dosis- I

afhængig, idet en effektiv formindskelse af oedema iagttages I

I ved 300 ng pr. sted (tabel X) . I

I Tabel X I

25 Virkning af dosis på inhiberingen af RPAR ved hialp af sCRl I

sCRl (ug/sted) Udstrækning af tilbageværende RPAR I

30 +/- I

I 30 3 + /- I

I °'3 +/- . I

I 0,03 ++ I

0,003 + + + + I

H o ++4-+ I

I i 35 _______ I

109 DK 175699 B1

Farmakokinetik af sCRl indgivet in vivo.

Den biologiske halveringstid for sCRl in vivo bestemmes som følger. Rotter af samme alder (6 uger) og legemsvægt (110-125 g) injiceres intravenøst med 250 ^g sCRl i 0,35 5 ml. 2 minutter, 5 minutter, 10 minutter, 60 minutter og 24 timer efter injektion aflives rotterne, og blod udtages fra punktur af vena cava. 1-2 ml sera fra hver enkelt rotte fås ved centrifugering ved 1800 opm i 10 minutter, og mængden af sCRl i hver enkelt prøve bestemmes ved CR1-ELISA. To 10 ganges fortyndinger af 1 μg/ml renset sCRl tilsat til kon-trolrotteserum eller detergentlysater af hæmoglobinfrie, røde blodlegemespøgelser (1,6 x 108 spøgelser/ml) anvendes som CRl-standarder. Resultaterne er vist i tabel XI.

15 Tabel XI

Farmakokinetiske data for serumkoncentrationer af injiceret sCRl med tiden

Tid efter in- 20 travenøs in- sCRl-koncentration -jektion (ua /ml)_

Kontrol 0,01 2 min. 0,17 5 min. 0,80 25 10 min. 1,01 60 min. 0,38 24 timer 0,49 30 Disse data viser, at sCRl kan påvises 24 timer efter intravenøs injektion. Efter 24 timer er sCRl-niveauet i serummet 50% af spidsniveauet, som iagttages 10 minutter efter injektion.

35 sCRl nedsætter infarctstørrelsen hos rotter med reper- fuseret. infarcteret myocardium.

Som her beskrevet er sCRl, som kan inhibere aktiviteten af komplementvejs-C3/C5-konvertasen in vitro, også i Η I DK 175699 B1 I 110 I stand til at formindske udstrækningen af reperfusionsskader i en myocardial rotteinfarctmodel in vivo.

I Myocardial infarction kan tilskyndes i en rotte ved i I coronarunderbinding. Hvis reperfusion etableres i løbet af I 5 de første få timer efter myocardial infarction, har det vist I sig, at den formindsker infarctstørrelsen, forbedrer funktio- I nen af den venstre ventrikel og nedsætter dødeligheden (E.

Braunwald og R.A. Kloner, 1985, J. Clin. Invest. 76, 1713- 1719) . Imidlertid kan reperfusion til et myocardium, som er H 10 svært iskætnisk, men ikke irreversibelt beskadiget, i sig selv frembringe og forøge skaderne. De mekanismer, som er ansvarlige for den reperfusionstilskyndede beskadigelse, kan omfatte skader medieret af frie oxygenradikaler og cellu- lær calciumoverbelastning. Leukocyter, som virker enten 15 alene eller i samvirke med mikrovaskulære endothelceller, H kan bidrage til denne beskadigelse. Komplementaktivering kan være involveret i denne proces (R.D. Rossen et al., 1985, Cir. Res. 57, 119-130; M.H. Crawford et al., 1988, I Circulation 78, 1449-1458).

20

Metoder. . - .

Tilskyndelse af myocardial infarct hos rotter. I

H Rotter (n=14), som vejer mellem 200 og 250 g, bedøves I

ved inhalering af methoxyfluran og får højre halsvene skåret I

H 25 op og forsynet med kanyle.. Halvdelen (n=7) får 2 ml (1 mg) I

sCRl gennem kanylen, og halvdelen får 2 mg saltopløsningspla- I

H cebo præpareret og indgivet på samme måde. Dyrene får hals- I

H kanylen fjernet, halsvenen syes sammen, og stedet lukkes. I

H Derefter gennemføres der en venstre thoracotomi i mellemrum- I

H 30 met mellem 5. og 6. ribben, medens der intermitterende ind- I

H gives ventilering med positivt tryk med 95% oxygen og 5 I

H carbondioxid. Derefter gennemføres der pericardiotomi, og I

venstre coronararterie lukkes ved suturligatur 2-3 mm til I

venstre for den proximale aorta. Virkningen af denne coronar- I

H 35 ligatur er at frembringe en stor region med risiko for for- I

reste transmural infarction. Brystkassen lukkes forbigående, I

t DK 175699 B1 111 medens rotterne forbliver under bedøvelse. 35 minutter efter lukningen genåbnes brystkassen, og ligaturen løsnes. Dette tidsrum er valgt således, at en signifikant del af risikoregionen potentielt vil kunne reddes. Derefter lukkes thoraco-5 tomien permanent, og dyrene får lov at vågne op af bedøvelsen, sædvanligvis i løbet af 5-10 minutter efter operationen.

100.000 enheder benzathinpenicillin G og 0,25 mg/kg morphin-sulfat indgives intramuskulært. Dyrene holdes på vand og en standrottediæt i l uge, hvorefter de efter heparinisering 10 og methoxyfluranbedøvelse aflives ved udtagelse af hjertet.

Morphologisk analyse af forsøgsinfarcter,· præ- parering af hjerter til studium._

Efter udtagelsen af hjertet sættes der hurtigt kanyler 15 i aorta, og coronararterierne perfuseres først med Krebs--Henseleit-opløsning for at befri hjerterne for blod og blodpropper og derefter med 30 mM KCl til diastolisk hjertestandsning. Hjerterne fikseres ved intercoronar perfusion og neddypning i 10%'s pufret formalin. Til hensigtsmæssig kon-20 trol med fyldningstrykket ventileres hjerterne gennem mitral-klappen med plastrør. Efter fiksering skæres hjerterne i skiver på tværs parallelt med den atrioventriculære kløft i 2 mm snit fra basis til top, og histologiske snit fremstil les.

25

Resultater.

Overlevelsen er den samme i begge grupper, dvs. 6 ud af 7 rotter overlever i 7 døgn og analyseres. Ved grov inspektion af de histologiske snit har 5 ud af 6 placebobehand-30 lede rotter store, transmurale, myocardiale infarctioner (bedømt til at være mindst 15% af den totale, venstre ventrikelmasse) . Kun én ud af G overlevende, sCRl-behandlede dyr har dette fund af en stor, transmural infarction. De andre, sCRl-behandlede dyr har små, spredte infarcter, som 35 omfatter langt mindre af venstre ventrikelmasse.(under 15%).

Faktisk kan de fleste af disse kun opdages ved mikroskopi, ! ...... j I DK 175699 B1 I 112 I medens infarcterne fra placebobehandlede rotter kan ses ved H grov inspektion.

Konklusioner.

I 5 Resultaterne viser, at sCRl-behandling er effektiv til formindskelse af reperfusionsskader in vivo og til for- bedring af virkninger af myocardial infarction. I den ud- I strækning, hvor reperfusionsskader kan forbedres, kan den absolutte mængde af reddet myocardium forøges, og det tids- 10 vindue, for hvilket reperfusion er klinisk anvendelig, kan forlænges. Behandling med sCRl må være en værdifuld; led- sagende terapi sammen med thrombolytika eller coronar bal- lonangioplasti under akut infarction.

H 15 . Deponering af mikroorganismer.

E. coli, stamme DK1/P3, som bærer plasmid piABCD

(betegnet pCRl-piABCD), som koder CR1-proteinet af fuld længde, er blevet deponeret hos Agricultural Research Culture

Collection (NRRL), Peoria, Illinois, den 31. marts 1988 og 20 er blevet tildelt accessionsnummer B-18355.

Ovariecellelinien DUX Bil fra kinesisk hamster, som bærer plasmid pBSCRlc/pTCSgpt-klon 35.6, som koder et opløse- H ligt CRl-molekyle, er blevet deponeret hos American Type H Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, den 23.

H 25 marts 1989 og er blevet tildelt accessionsnummer CRL 10052.

H Den foreliggende opfindelse skal ikke være begrænset H i omfang af de deponerede mikroorganismer, da den deponerede H ' udførelsesform skal forstås som en enkelt illustration af et aspekt ved opfindelsen, og enhver mikroorganisme, som er 30 funktionelt ækvivalent, falder indenfor opfindelsens rammer.

^B Det må også forstås, at alle størrelser af basepar, som er angivet for nucleotider, er omtrentlige og er anvendt med det formål at beskrive.

Claims (37)

113 DK 175699 B1 Patentkrav .

1. Nucleinsyremolekyle indeholdende en nucleotidsekvens, der koder for et polypeptid, som mangler et trans-membrandomæne og har en komplement-regulatorisk aktivitet 5 af CR1, hvilken nucleotidsekvens er valgt blandt: (a) en nucleotidsekvens i det væsentlige som vist i fig. 1 fra nucleotid nr. 28 til nucleotid nr. 5943, der koder for et opløseligt CR1-polypeptid, og (b) en nucleotidsekvens, som er degenereret med hensyn til 10 (a), eller et fragment af nucleotidsekvenserne (a) eller (b) , der koder for polypeptid, som mangler et transmembrandomæne og har en komplement-regulatorisk aktivitet af CR1.

2. Nucleinsyremolekyle ifølge krav 1, der indeholder 15 en cDNA-sekvens.

3. Nucleinsyremolekyle ifølge krav 1, der indeholder en genomisk DNA-sekvens.

4. Nucleinsyremolekyle ifølge krav 1, der er et ENA- molekyle. i

5. Nucleinsyremolekyle ifølge ethvert af kravene 1-4, 1 hvor den komplement-regulatoriske aktivitet af det kodede polypeptid er mindst én af de følgende egenskaber: (a) evnen til binding af C3b, (b) evnen til binding af C4b og 25 (c) faktor I-cofaktor-aktivitet.

6. Nucleinsyremolekyle ifølge ethvert af kravene 1 til 5, i hvilket den komplement-regulatoriske aktivitet af det kodede polypeptid er mindst én af de følgende egenskaber: (a) evnen til at inhibere klassisk C3 konvertaseaktivitet, 30 (b) evnen til at inhibere alternativ C3-konvertaseak tivitet, (c) evnen til at inhibere klassisk C5-konvertaseaktivitet, (d) evnen til at inhibere alternativ C5-konvertaseak tivitet , 35 (e) evnen til at inhibere neutrofilt oxidativt udbrud, (f) evnen til at inhibere komplement-formidlet hæmolyse, I DK 175699 B1 I I 114 I (g) evnen til at inhibere C3a-produktion og I (h) evnen til at inhibere C5a-produktion. I

7. Nucleinsyremolekyle ifølge ethvert af kravene 1 I til 5, i hvilket den komplement-regulatoriske aktivitet af I 5 det kodede polypeptid er mindst én af de følgende egenskaber: ; I I (a) evnen til at ændre reperfusionsbeskadigelse, 1 I . (b) evnen til at inhibere Arthus-reaktion, | I H (c) evnen til at reducere størrelsen af myokardial in- I I farkt, I 10 (d) evnen til at formindske inflammation og I (e) evnen til at inhibere neutrofil-formidlet vævsbe- I I skadigelse. I I I

8. Rekombinant DNA-vektor indeholdende nucleinsyre- I molekylet ifølge ethvert af kravene 1 til 5. I

9. Rekombinant vektor ifølge krav 8, der er en human H eller animal virus, insektvirus, gærvektor, bakteriofagvek- tor, plasmid- eller cosmid-DNA-vektor. I

10. Rekombinant vektor ifølge krav 9, der er en re- I kombinant vaccinia-virus eller adenovirus. I I 20 11. Rekombinant ekspressionsvektor indeholdende nu- I I cleinsyremolekylet ifølge ethvert af kravene .1 til 5, der I er i stand til at udtrykke nucleinsyremolekylet i en proka- I I ryotisk celle. ; I

12. Rekombinant ekspressionsvektor ifølge krav 11, I I 25 hvor den prokaryotiske celle er en bakterie. H

13. Rekombinant ekspressionsvektor indeholde nuclein- I I syremolekylet ifølge ethvert af kravene 1 til 5, som er i H I stand til at udtrykke nucleinsyremolekylet i en eukaryotisk H I celle. I I 30 14. Rekombinant ekspressionsvektor ifølge krav 13, I I hvor den eukaryotiske celle er en pattedyrscelle. H

15. Rekombinant vektor indeholdende plasmid I pBSCRlc/pTCSgpt som indeholdt i cellelinien deponeret ved i I I ATCC og tildelt tilgængelighedsnummer CRL 10052. I I 35 16. Celle, der indeholder nucleotidsekvensen ifølge I I ethvert af kravene 1 til 5 eller er transformeret med den I 115 DK 175699 B1 rekombinante vektor ifølge ethvert af kravene 6 til 15.

17. Celle ifølge krav 16, der er en bakterie, en gærcelle, en insektcelle eller en pattedyrscelle.

18. CHO-celle DUX Bil, der bærer plasmid 5 pBSCRlc/pTCSgpt, deponeret ved ATCC og tildelt tilgængelighedsnummer CRL 10052.

19. Opløseligt CR1 polypeptid med komplement-regula-torisk aktivitet, der kan fås ved trinnene dyrkning i et egnet dyrkningsmedium af cellen ifølge ethvert af kravene 10 16 til 18 og udvinding af polypeptidet fra dyrkningsmediet.

20. Fremgangsmåde til fremstilling af CRl-polypeptid, omfattende trinnene dyrkning i et egnet medium af cellen ifølge ethvert af kravene 16 til 18 og isolering af polypeptidet fra cellerne eller mediet.

21. Opløseligt CRl-polypeptid med en komplement-regu- latorisk aktivitet, hvilket polypeptid kodes af nuclein-syremolekylet ifølge ethvert af kravene 1 til 5.

22. Polypeptid ifølge krav 21, der indeholder mindst én CRl-kort konsensusgentagelse og ikke alle de CRl-korte 20 konsensusgentagelser.

23. Opløseligt CRl-polypeptid indeholdende i det mindste den CRl lange homologe gentagelse A og med en komplement-regulatorisk aktivitet med en aminosyresekvens i det væsentlige som vist i fig. 10, aminosyrer nr. 47 til 494.

24. Opløseligt CRl-polypeptid indeholdende de 30 ekstracellulære korte konsensus-gentagelser, med en aminosyresekvens i det væsentlige som vist i fig. 1, fra Gln42 til Ala;[_972, hvilket polypeptid mangler en transmerribranregion og udviser komplement-regulatorisk aktivitet.

25. Opløseligt CRl-polypeptid ifølge ethvert af kra vene 21 til 24, der er uglycosyleret.

26. Opløseligt CRl-polypeptid ifølge ethvert af kravene 21 til 24, der er glycosyleret.

27. Opløseligt CRl-polypeptid ifølge ethvert af kra- 35 vene 21 til 23, der mangler et signalpeptid.

116 I DK 175699 B1 I

28. Opløseligt CRl-polypeptid, der har evnen til at I binde C3b, der omfatter de følgende CR1 korte konsensus- I gentagelser: I (a) SCRs 15 og 16, i det væsentlige som vist i fig. 10, I 5 aminosyre nr. 947 til 1068; H (b) SCRs 15, 16, 17, 18, 19, 20 og 21 (LHR-C), i det væ- I sentlige som vist i fig. 10, aminosyre nr. 947 til I 1394. I

29. Fremgangsmåde til rensning af det opløselige I

10 CRl-polypeptid ifølge ethvert af kravene 21 til 28, hvilken H fremgangsmåde omfatter: (a) opnåelse af en prøve indeholdende polypeptidet, j I (b) udsættelse af prøven for kationbytnings-højtryks- | I væskechromatografi, H 15 (c) eluering af polypeptidet fra højtryksvæskechromato- H grafisøjlen H (d) udsættelse af polypeptidet for anionbytnings-højtryks- I væskechromatografi og H (e) eluering af polypeptidet fra højtryksvæskechromato- H 20 grafisøjlen i trin (d). I

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, hvor polypeptidet H er sCRl, der har de samme egenskaber som opløseligt CR1 I produceret af CHO-cellen DUXB11, der bærer plasmid H pBSCRlc/pTCSgpt, der er deponeret ved ATCC og har fået til- H 25 delt tilgængelighedsnummer CRL 10052. I

31. Fremgangsmåde ifølge krav 29 eller 30, hvor trin (a) omfatter: (al) ekspression af det opløselige CR1 polypeptid i en I celle i kultur således, at CR1 polypeptidet sekrete- H 30 res, og H (a2) opnåelse af en prøve af cellekulturvæsken indeholdende H CR1 polypeptidet. H

32. Farmaceutisk sammensætning indeholdende polypep- H tidet ifølge ethvert af kravene 21 til 28 og/eller polypep- H 35 tidet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge ethvert af kra- I vene 29 til 31 og en farmaceutisk acceptabel bærer. H 117 DK 175699 B1

33. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 32 til regulering af komplementaktivitet.

34. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 33 til behandling af en patient med en immunlidelse eller en lidel- 5 se, der involverer uønsket eller ikke-hensigtsmæssig komplementaktivitet.

35. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 32 til behandling eller forebyggelse af beskadigelse hos en patient forårsaget af en myokardial infarkt.

36. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 32 til behandling eller forebyggelse af beskadigelse hos en patient forårsaget af inflammation.

37. Anvendelse af polypeptidet ifølge ethvert af kravene 21 til 28 og/eller polypeptidet fremstillet ved 15 fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 29 til 31 til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning som defineret i ethvert af kravene 32 til 36.